p18小分子抑制剂及在人造血干细胞体外扩增中的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药领域，特别涉及P18小分子抑制剂及其在人脐带血来源造血干细 胞的体外扩增中的用途。
【背景技术】
[0002] 干细胞因其具有自我更新及多向分化的能力而成为临床上治疗多种疾病的有效 途径之一，这也代表了再生医学新时代的到来。其中造血干细胞研宄开始最早、研宄最为深 入且应用最为广泛。应用骨髓移植治疗白血病等恶性血液疾病已有50多年的历史。但骨 髓中造血干细胞数量较低，移植后难以在病人体内有效进行造血重建，这也成为干细胞临 床应用的一个瓶颈。
[0003] 造血干细胞在体内有多种选择，例如自我更新、分化、迀移（归巢）、静息、凋亡等， 在这些不同的选择背后，有一个非常复杂的信号通路网络调节造血干细胞的不同命运。例 如Wnt、Notch、Shh/BMP、TGF-0、IGF等发育相关的调节蛋白，Bmi等染色质相关因子，HoxB、 NFk等转录因子，INK4、KIP、PTEN等细胞周期调节蛋白等均参与了该信号调节网络。对于 造血干细胞而言，其最为重要的特性即为自我更新。目前已有多项研宄指出，造血干细胞的 自我更新调节与细胞周期的调节息息相关。进入细胞周期是造血干细胞进行自我更新的最 后一步，因此细胞周期，尤其是G1期的调节可能会对造血干细胞的自我更新产生至关重要 的作用。
[0004] 细胞周期主要通过连续的细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs)的活性变化来调控， 而⑶K的活性又必须取决于Cyclin的含量水平。在体内，除了Cyclin和催化亚基的磷酸 化/去磷酸化的调控，CDK很大程度上还受CKIs(细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂）的调控。 目前已知CKI中两类低分子量家族蛋白，Cip/Kip和INK4可以与⑶K反应，并可抑制细胞 通过G1期。其中，Cip/Kip家族，主要包括p21，p27和p57,可以与很多Cyclin-CDK复合物 反应；INK家族，主要包括pl6，pl5,pl8和pl9,可以特异性的抑制CDK4、6。
[0005] 越来越多的研宄表明，相对于其他的CKI而言，pl8对造血干细胞的自我更新调控 作用更为强大。例如，P18的缺失会导致小鼠造血移植率的显著升高，并且该种作用是通过 提高造血干细胞对称性自我更新分裂的比率来实现的，相较于以往单纯提高造血干细胞的 增殖效率，提高其对称性分裂可免于导致造血干细胞的分化和耗竭。因此，P18是一个特异 影响造血干细胞自我更新的独特的INK蛋白。
[0006] 目前体外扩增造血干细胞主要依靠向培养基中添加血清以及SCF、TPO、Flt3L等 细胞因子，但扩增效果仍不理想，造血干细胞在体外很快便发生分化、衰竭。之前的研宄中 曾采用加入多种细胞因子液体培养基、与基质细胞共同培养或在生物反应器中培养等方法 以体外扩增造血干/祖细胞，但上述方法仍不能获得充足的具有移植能力的造血干细胞来 进行临床治疗。
[0007] 而小分子化合物则在体外培养中显示了其独特的优势。首先，化合物的作用效果 可通过调节化合物的结构、浓度来改变，其过程简单可控；其次，小分子化合物相较于细胞 因子或转录因子等其性质更为稳定，化合物的前期处理以及给药非常方便。因此，在传统扩 增造血干细胞的方法中加入小分子化合物，甚至完全采用小分子化合物替代现有的血清、 细胞因子等物质，可能对体外培养造血干细胞发挥重要作用。
[0008] 本发明旨在研宄制得一种新的pl8小分子抑制剂，并通过该pl8小分子抑制剂体 外培养人造血干细胞，以达到造血干细胞的体外扩增的目的。
【发明内容】
[0009] 本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种P18小分子抑制剂及其在人造血 干细胞体外扩增中的用途。
[0010] 本发明采用的技术方案为：
[0011] -种pl8小分子抑制剂，其结构为：
【主权项】
1. 一种pl8小分子抑制剂，其特征在于：其结构为：
2. 权利要求1所述pl8小分子抑制剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤： 在冰浴条件下，将环己胺和对羧基苯磺酰氯溶解在二氯甲烷中，加入三乙胺，搅拌1小 时，升至室温后，继续搅拌，TLC监控反应完成后，旋转蒸发除去反应溶液，残余物纯化，得中 间体； 在冰浴条件下，将所得中间体溶解在水中，加入氢氧化钠，升至室温后，搅拌30分钟， 所得反应液真空冻干，得终产品。
3. 权利要求1所述pl8小分子抑制剂在人造血干细胞体外扩增中的用途。
4. 根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述用途中，pl8小分子抑制剂在扩增培 养基中的浓度为10_50nM。
5. -种人造血干细胞体外扩增方法，其特征在于：包括如下步骤：将新鲜分离的人脐 带血CD34+细胞使用扩增培养基（StemSpanSFEM培养基 +[100ng/mL]SCF/TP0/Flt3L/ IL-6)重悬至细胞浓度为5X104细胞/mL，然后铺于96孔板中，每孔为190yL细胞悬液， 随后向其中添加10UL使用同种扩增培养基稀释过的pl8小分子抑制剂，pl8小分子抑制 剂的终浓度为20nM，在37°C，5%C02恒温培养箱中培养7天。
【专利摘要】本发明涉及p18小分子抑制剂及在人造血干细胞体外扩增中的用途，其结构为：本发明还提供了该p18小分子抑制剂的制备方法及用途，本发明p18小分子抑制剂对于人造血干细胞自我更新具有较好的促进作用，可为日后临床治疗提供新的方法。
【IPC分类】C07C303-38, C12N5-0789, C07C311-20
【公开号】CN104693075
【申请号】CN201510081641
【发明人】程涛, 解向群, 高瀛岱, 杨鹏
【申请人】程涛, 解向群, 高瀛岱
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年2月13日