专利名称：一种人类agt蛋白小分子抑制剂的制作方法
技术领域：
一种人类AGT蛋白小分子抑制剂，属于药物筛选新产品的技术领域，具体涉及一种O6-对氨甲基苄基鸟嘌呤。这种抑制剂能不可逆地使人类AGT蛋白失去活性，用它对肿瘤细胞预处理，再进行烷基化化疗，能提高化疗疗效。
背景技术：
烷基化试剂作为一种阳性抗癌药已经广泛应用于化疗中杀死肿瘤细胞。这些试剂通常作用于鸟嘌呤6位氧，使之烷基化成为O6-烷基鸟嘌呤。通常使用的烷基化试剂有氯乙基化试剂和甲基化试剂。这些烷基化试剂，特别是氯乙基化试剂对杀死肿瘤细胞效果十分显著。因为当氯乙基化试剂进入体内作用于恶性肿瘤时，首先与鸟嘌呤6位氧作用使之烷基化，然后通过分子内环化，再与DNA链上的胞嘧啶交叉偶联，形成共价键连接的稳定大分子，造成DNA碱基不能正常配对，阻止DNA复制，从而导致恶性肿瘤细胞死亡。
这类烷基化试剂在治疗恶性肿瘤如淋巴瘤，脑瘤，黑色瘤和Hodgkin病等都有好的疗效。但是人类O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(h AGT)对烷基化药物作用后的O6-烷基鸟嘌呤的修复影响了这些化疗疗效。因此有效抑制肿瘤细胞中人类AGT蛋白的活性对提高当前抗癌烷基化化疗疗效非常重要。
由于人类AGT蛋白修复功能的不可逆性，它可以通过接受而失去活性，该烷基基团从损坏的碱基而来。一些小分子已经被设计用来在烷基化化疗治疗肿瘤细胞之前，使人类AGT(血管紧张素原)蛋白失去活性。这种小分子已经显示了能不可逆地使人类AGT蛋白失去活性，部分地抑制由这种蛋白引起的抗药性。正用于II期临床试验的O6-苄基鸟嘌呤，对肿瘤细胞预处理，再进行烷基化化疗，可以提高几倍的疗效。
目前这种小分子的应用前景看好，但它却有致命弱点。这种小分子对人类AGT蛋白的低亲和性、低生物可获得性、较差的水溶性以及在体液中不能较长时间存在等特性都将大大降低它的应用潜力。
发明内容
本发明的目的在于公开一种人类AGT蛋白小分子抑制剂，它对人类AGT蛋白的亲和性、生物可获得性、水溶性都比O6-苄基鸟嘌呤高，在体液中存在时间较长，可以提高化疗疗效。
为达上述目的，本发明通过对分子水平上人类AGT蛋白对DNA损害部位的特异识别和作用的探讨，合理的设计一些小分子抑制剂来更有效的抑制人类AGT蛋白。具体是在O6-苄基鸟嘌呤的苄基的对位引入甲氨基得到一种O6-对氨甲基苄基鸟嘌呤。这种O6-对氨甲基苄基鸟嘌呤，既不影响人类AGT蛋白对此类分子的特异性识别，还可以增加其对人类AGT蛋白的亲和性和水溶性。经检验发现本发明的O6-对氨甲基苄基鸟嘌呤比O6-苄基鸟嘌呤的生物活性高1～5倍。
其特征是本发明的抑制剂是O6-对氨甲基苄基鸟嘌呤，化学结构式如下 本发明的O6-对氨甲基苄基鸟嘌呤的合成方法如下以2-氨基-6-氯嘌呤为起始原料，先和三甲氨或1，4-二氮杂双环[2，2，2]辛烷成盐，生成三甲氨-嘌呤(TMA-purine)或1，4-二氮杂双环[2，2，2]辛烷-嘌呤(DBACO-purine)，再与对氨甲基苄醇在氢化钠的作用生成O6-对氨甲基苄基鸟嘌呤。
其中，三甲氨-嘌呤(TMA-purine)2a的合成在100℃，2-氨基-6-氯嘌呤(1.69g，10mmol)溶解在无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，溶解后冷却到室温，滴加50％(体积比)三甲氨的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液。滴加完毕后，反应液于室温搅拌24小时，析出沉淀，过滤用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤。于70～80℃真空干燥固体沉淀，得三甲氨基-嘌呤2.19g，产率95％。熔点207～208℃1，4-二氮杂双环[2，2，2]辛烷-嘌呤(DBACO-purine)2b的合成方法同三甲氨-嘌呤(TMA-purine)2a的合成，1，4-二氮杂双环[2，2，2]辛烷(DABCO)(6.17g，55mmol)在无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)在室温反应24小时，得到1，4-二氮杂双环[2，2，2]辛烷-嘌呤(DBACO-purine)2.54g，产率90％。熔点＞300℃。
O6-对氨甲基苄基鸟嘌呤的合成对氨甲基苄醇(32mmol)溶于干燥的10ml二甲亚砜(DMSO)，将氢化钠(30mmol)加入其中，于室温下搅拌1小时后，加入15mmol三甲氨-嘌呤(TMA-purine)2a或1，4-二氮杂双环[2，2，2]辛烷-嘌呤(DBACO-purine)2b。继续于室温搅拌3小时。待反应完全，加入3ml冰醋酸中和。再加入400ml乙酸乙酯剧烈搅拌30分钟，生成沉淀，过滤。用乙酸乙酯和水先后洗涤固体，干燥固体得O6-对氨甲基苄基鸟嘌呤3.41g，产率84.3％。
1H NMR(500Hz，CD3OD)64.58(s，2H)，5.46(s，2H)，6.26(s，NH2重水交换消失)，7.26(d，J＝7.8Hz，2H)，7.38(d，J＝7.8Hz，2H)，7.85(s，1H)，12.30(br，s，NH，重水交换消失)。
具体实施例方式
实施例1药理药效试验1.细胞培养选取多种化疗敏感细胞株及耐药细胞株，(如卵巢癌细胞株SKOV-3ip及卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV-3/DDP)在含10％小牛血清的RPM11640培养液中，于37℃、含5％CO2的培养箱中贴壁生长，待培养至对数生长期后，0.25％胰酶消化、制成单细胞悬液。以每孔2×105个细胞加入96孔培养板中，置于37℃、含5％CO2的培养箱中培养，同时加入不同浓度的待测药物，检测在不同的细胞株上待试药物的IC50，观察阳性对照药物(顺铂)在单用、同时合并用药或序贯用药中IC50的变化。通过金氏公式判断是否在单独用药、合并用药48小时及序贯用药(待测药物先作用24小时后加入阳性对照的化疗药物24小时)中存在疗效增强的作用，得到药物的增效剂量范围。
2.细胞周期和凋亡率测定将每孔2×105个细胞接种于12孔培养板中，培养过夜后，弃培养基。实验组I分别加入不同浓度的待测药物，阳性对照药物及待测药物阳性对照药物联合用药和阳性对照药物，继续培养48小时；实验组II先加入终浓度为待测药物作用24小时后，弃去培养基，再加入阳性对照药物培养24小时。每孔设4个平行孔，消化收集细胞制成含1×106/ml的单细胞悬液1ml，PBS冲洗3次，300目尼龙网过滤，PI染色30分钟后置流式细胞仪分析，观察待测药物对细胞凋亡率及细胞周期的影响。
试验结果O6-对氨甲基苄基鸟嘌呤90％AGT抑制效价在乳腺癌MCF-7细胞中，O6-对氨甲基苄基鸟嘌呤为0.5μM，O6-苄基鸟嘌呤为1μM。培养细胞抑制试验对乳腺癌细胞，O6-对氨甲基苄基鸟嘌呤使替莫唑胺的IC50从100μM降低到8μM。
实施例2动物模型对粘附性差的肿瘤细胞株而言无菌条件下取生长良好的S-180腹水型小鼠腹水，用生理盐水稀释，制成瘤细胞悬液，1×106个/ml。于小鼠腹腔接种0.2ml/只，随机分为1，2，3，4，5，b，7，8共八组。接种瘤细胞24h后腹腔给药。1组(对照组)单用生理盐水，2组(待测药物组)单用待测药物，3组(阳性抗癌药物组)单用阳性抗癌药，4组(待测药物+阳性抗癌药组)同时给予待测药物与阳性抗癌药，5组(待测药物十8h阳性抗癌药)注射待测药物后8h给予阳性抗癌药，以下以此类推，6组(待测药物+12h阳性抗癌药)两药间隔12h，7组(待测药物+24h阳性抗癌药组)两药间隔24h，8组(待测药物+72h阳性抗癌药组)两药间隔72h。以上实验重复3次。
对粘附性好的肿瘤细胞株而言，直接接种肿瘤细胞到小鼠皮下或相应部位，检测瘤块大小、重量、动物存活情况等。
观察每组小鼠的体重变化、瘤块大小、重量及生存天数，计算生命延长率。生命延长率(increase in life span ILS)＝(治疗组生存天数一对照组生存天数)/治疗组生存天数×100％。实验第60日终止实验，观察存活的小鼠数量，小鼠生存超过60天视为治愈。计算治愈率。治愈率(curable rate)＝生存超过60天的小鼠数/小鼠总数×100％。
试验结果裸鼠接种恶性胶质瘤治疗试验替莫唑胺(35mg/kg，腹腔注射)+伊立替康(4mg/kg，腹腔注射，1-5，8-12天给药)+新化合物20mg/kg，给抗癌药1小时前腹腔注射)以治疗开始时的瘤体大小增加5倍所需要的时间为判定指标。与对照组比较，合并用药使肿瘤生长延迟150天，而单独给与抗癌药使瘤体成长延迟7-9天。
权利要求
1.一种人类AGT蛋白小分子抑制剂，其特征在于该抑制剂是O6-对氨甲基苄基鸟嘌呤，化学结构式如下
全文摘要
一种人类AGT蛋白小分子抑制剂，属于药物筛选新产品的技术领域，具体涉及一种O
文档编号C07D473/00GK1861078SQ20061002759
公开日2006年11月15日 申请日期2006年6月12日 优先权日2006年6月12日
发明者杨琍苹, 韩峰燕, 何川, 施章杰, 艾瑞卡 申请人:华东师范大学