一种小分子抑制剂及在抑制鸟氨酸脱羧酶(odc)上的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学领域，涉及一种鸟氨酸脱羧酶（ODC)的小分子抑制剂及其应 用；具体涉及人源鸟氨酸脱羧酶的小分子抑制剂及其在抑制和杀伤肿瘤细胞中的应用。
【背景技术】
[0002] 蛋白质是生物体的主要组成成分之一，是完成各种生命活动的主要物质。在各种 蛋白质中，蛋白酶对生命活动至关重要，几乎所有生物体内的生化反应过程都由蛋白酶进 行催化。生物体内各种蛋白酶的活性具有严格的调控机制，一旦其调控机制出现问题，造成 蛋白酶的活性过高、过低或者是完全失活，都会造成相应的各类疾病。因此，通过药物来调 控蛋白酶的活性，使其恢复和保持在正常水平，具有非常重要的理论意义和现实意义。以结 构为基础的药物设计，是设计以蛋白质为靶标的药物的一个非常重要的手段。
[0003] 多胺（polyamines)是一类从氨基酸代谢产生的带正电的阳离子小分子，在所有 生物体中都存在，对细胞生长、分化、存活及正常生物学功能等都不可缺少。多胺带多正电 荷的特性，使它们能通过与带负电荷的生物大分子（DNA、RNA、蛋白质、细胞膜等）形成静 电作用，从而调控非常广泛的生物学过程，包括染色体结构形成、DNA合成与稳定、DNA复 制、转录和翻译、蛋白质磷酸化、核糖体生成、离子通道和膜表面受体的调控、自由基清除 等。天然的多胺有很多种。在哺乳动物中，天然存在的有三种，即腐胺（putrescine)，精脒 (spermidine),精胺（spermine),它们对哺乳动物正常生长和发育必不可少。由于多胺具有 重要的生物学功能，其细胞内水平受到严格的调控。在快速繁殖的细胞中，如肿瘤细胞，多 胺水平及ODC表达水平也会上升和失调。多胺水平升高，伴随着细胞增殖加快、凋亡减少、 以及肿瘤浸润和转移相关基因的表达水平升高等。因此，多胺的调控，成为肿瘤治疗和药物 研发中的一个重要手段。
[0004] 多胺代谢的起始底物是鸟氨酸（ornithine)，它是精氨酸在尿素循环（urea cycle)中被精氨酸酶（arginase)催化的反应产物。ODC是多胺合成途径的第一个酶，催化 从鸟氨酸（ornithine)到腐胺的反应，该步催化反应也是多胺合成途径的一个限速步骤。 因此，合成ODC抑制剂，抑制腐胺的生成，是目前很受关注的一个肿瘤治疗途径。同时，由于 病原微生物也需要正常的多胺水平，ODC抑制剂也成为针对病原微生物（如导致非洲锥虫 病的布氏锥虫）的重要靶标。
[0005] 当前，ODC的抑制剂DFM0(a-二氟甲基鸟氨酸）已经被用于临床，辅助癌症的化 疗。但其与ODC的结合能力较弱，作用浓度很高，且由于是与ODC形成共价键的自杀性抑制 剂，毒副作用非常大。因此，非常有必要开发出具有更好效果的ODC新型抑制剂。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是通过计算机辅助的高通量药物筛选，提供一种针对ODC的新型小 分子抑制剂，将其应用于鸟氨酸脱羧酶的抑制剂，将有可能可以用于制备治疗肿瘤、病原微 生物感染的药物。具体为：
[0007] -种小分子抑制剂，其特征在于，该小分子抑制剂的结构式为：
[0008]
【主权项】
1. 一种小分子抑制剂，其特征在于，该小分子抑制剂的结构式为：
其中，R1为邻位或间位或对位；馬为对位或间位。
2. 根据权利要求1所述的小分子抑制剂，其特征在于，R1包括
R2包括
3. 根据权利要求2所述的小分子抑制剂，其特征在于，该小分子抑制剂的结构式为：
4. 权利要求1或2或3所述的小分子抑制剂在抑制鸟氨酸脱羧酶（ODC)上的应用。
5. 权利要求1或2或3中所述的小分子抑制剂在制备治疗肿瘤药物中的应用。
6. 权利要求1或2胡3中所述的小分子抑制剂在制备治疗病原微生物感染药物中的应 用。
7. -种小分子抑制剂抑制鸟氨酸脱羧酶（ODC)的方法，其特征在于，包括如下步骤： 1. ODC原核表达质粒的构建 将ODC的基因序列，通过BamH I和Xho I酶切位点，插入到pET28a质粒中，构建出 pET28a_h0DC质粒，经DNA测序验证； 2. ODC蛋白的表达 将步骤1)构建的pET28a-h0DC质粒通过CaCl2法，转化到大肠杆菌BL21菌株中，通过 卡那霉素进行筛选，然后将在含有卡那霉素的Luria-Bertani (LB)培养板上生长的菌株， 接种至含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C、250rpm培养至对数生长期，再添加异丙 基硫代半乳糖苷（IPTG)至0. 5mM，在28°C诱导表达4小时，最后，离心收集细菌； 3. ODC蛋白的纯化 将步骤2)中收集的细菌，用裂解液重新悬浮，然后通过超声方法进行细胞裂解，再将 裂解液在4°C、12000转/min，离心后，保留上清；最后将上清利用Ni-NTA His标签蛋白结 合填料进行结合和纯化，得到ODC蛋白，ODC蛋白的洗脱缓冲液为50mM三羟甲基氨基甲烷 (Tris)/HCl，pH8.0,300mM NaCl，lmM DTT，IOOmM 咪唑（imidazole); 4. ODC蛋白的活性检测 在EP管中，加入400uL底物反应混合物、50ug的ODC蛋白，混匀后将EP管放置在37°C 水浴中30min ;加入400uL10%的三氯乙酸终止反应，室温离心5000rpm、5min，然后取出 IOOuL上清，与200uL4mol/L的NaOH溶液混合，加入400uL正戊醇，充分混合，2000rpm离 心5min，再将上层液200uL转移至新的EP管中，加入200uL0.1mol/LpH为8. 0的四硼酸钠 混合均匀、加入200uL10mmol/L三硝基苯磺酸混合充分、加入400uL DMS0,充分混合lmin， 3000rpm离心5min ;最后取出上层液到96孔板中，用酶标仪检测426nm处的吸光值，得到未 加酶的OD值； 5)抑制剂对ODC蛋白的抑制活性的检测 根据步骤4)中所述的方法，在加入400uL底物反应混合物后，随即加入鸟氨酸脱羧酶 的小分子抑制剂，后续操作同步骤4); 通过以下公式计算出ODC抑制率： 对照差=加小分子抑制剂对照组平均OD值-未加小分子抑制剂对照组平均OD值，其 中对照组在步骤5)中加入的抑制剂为DFMO抑制剂； 实验差=加小分子抑制剂实验组平均OD值-未加小分子抑制剂实验组组平均OD值； ODC抑制率=[(对照差-实验差）/对照差]X 100 %。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤3)中所述的裂解液为50mM三羟甲 基氨基甲烷（Tris)/HCl，pH8.0, 300mM NaCl，ImM DTT，ImM PMSF，5mM 咪唑（imidazole)的 混合液。
9. 根据权利要求7中所述的方法，其特征在于：步骤4)中的底物反应混合物为在 150mM pH为L 1的磷酸盐缓冲液（PBS)中溶解17. 57ul β -巯基乙醇，55. 84mgL 5mM EDTA 二盐钠，75nM磷酸吡哆醛（PLP)储液，2mM鸟氨酸盐酸盐。
10. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的鸟氨酸脱羧酶为人源鸟氨酸脱羧 酶、非人源鸟氨酸脱羧酶或与人源鸟氨酸脱羧酶的腐胺底物及磷酸吡哆醛结合位点高度同 源的蛋白质。
【专利摘要】本发明属于生物医学领域，涉及一种鸟氨酸脱羧酶(ODC)的小分子抑制剂及其应用；通过计算机辅助的高通量药物筛选，发现针对鸟氨酸脱羧酶(ODC)的新型小分子抑制剂，验证其效果，发现对ODC具有良好的抑制作用，尤其可用于抑制人源ODC，预防、治疗和诊断肿瘤疾病、病原微生物感染，研发制备肿瘤药物或病原微生物感染类药物。
【IPC分类】A61K31-4425, A61P35-00, A61P33-02, C07D213-53
【公开号】CN104744351
【申请号】CN201410525202
【发明人】刘森, 王艳林, 占景琼
【申请人】三峡大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2014年9月30日