一种淡水小龙虾多巴脱羧酶基因Pc-DDC、其编码的氨基酸序列以及克隆方法
【专利摘要】本发明涉及一种淡水小龙虾多巴脱羧酶基因Pc-DDC、其编码的氨基酸序列以及克隆方法。通过设计特异的扩增引物，PCR反应成功扩增到了该基因的cDNA序列，其核苷酸序列具有1425bp，编码的氨基酸序列具有474个氨基酸残基。诱导多巴脱羧酶基因在淡水小龙虾体内过量表达可以提高淡水小龙虾先天免疫系统中多巴转化为多巴胺的能力，从而可以提高淡水小龙虾的抗菌能力。
【专利说明】—种淡水小龙虾多巴脱羧酶基因Pc-DDC、其编码的氨基酸序列以及克隆方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种淡水小龙虾多巴脱羧酶基因Pc-DDC、其编码的氨基酸序列以及克隆方法，属于分子生物学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]无脊椎动物在进化方面的地位要比脊椎动物低，其免疫系统不如脊椎动物发达，但是也具有比较全面的免疫类型和相关的信号途径网络结构。无脊椎动物的免疫系统在低等的甲壳类动物中研究的较为清楚，目前统一称为先天免疫系统。在以甲壳类动物为代表的无脊椎动物体内，先天免疫系统主要包括物理屏障、细胞免疫和体液免疫三种形式。这个先天免疫系统发挥着防御细菌与病毒等病原微生物的侵染，物理屏障是防御病原微生物入侵的第一道天然屏障，主要包括甲壳类动物的体表和肠道，细胞免疫主要包括免疫细胞的吞噬作用、结节的形成和包囊作用，体液免疫主要是指酚氧化酶原活化系统介导的黑化作用和相关信号途径介导的抗菌肽类物质的表达。
[0003]酚氧化酶原活化系统介导的黑化作用在发挥功能的过程中，需要借助于丝氨酸蛋白酶水解级联反应来将酚氧化酶原激活为酚氧化酶，活化后的酚氧化酶可以将多巴胺转化为醌类物质，形成包囊来进一步发挥黑化作用。其中，作为酚氧化酶底物的多巴胺是由多巴脱羧酶催化多巴进行脱羧反应生成的，因此，多巴脱羧酶活性的高低可以影响多巴胺的浓度，从而影响黑化反应的进展，从而反应了多巴脱羧酶的重要地位。一般情况下，当发生病原微生物入侵之后，多巴脱羧酶的基因表达量就会被上调表达，从而蛋白质表达量也会被上调，从而促进了多巴 转化为多巴胺的反应进行，使黑化作用进一步加强，促进宿主对于病原微生物的清除。在中国对虾、凡纳滨对虾、斑节对虾、日本对虾中，相关研究结果表明，细菌或者白斑病毒的入侵都会引起多巴脱羧酶基因的上调表达，进一步显示了多巴脱羧酶通过参与黑化反应的信号途径从而发挥免疫防卫作用，也就是说甲壳类动物的多巴脱羧酶基因是一个先天免疫防御相关的基因。
[0004]淡水小龙虾是一种重要的甲壳类动物，具有较高的经济养殖价值，一直是我国比较重要的水产养殖动物。同时，伴随着淡水小龙虾养殖规模的不断扩大，细菌入侵和病毒感染造成的虾类疾病也在频繁发生，困扰着淡水小龙虾养殖业的发展。开展淡水小龙虾先天免疫相关基因的研究工作，可以不断完善先天免疫系统的基础理论，同时，多巴脱羧酶基因的研究工作将会进一步丰富先天免疫系统相关的免疫防御基因的种类与数量。更重要的是，开展淡水小龙虾多巴脱羧酶基因的研究工作将会为淡水小龙虾养殖业中病害的防治提供一定的理论基础与技术支持。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种淡水小龙虾多巴脱羧酶基因Pc-DDC的核苷酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1，具有1425bp。[0006]本发明的另一个目的在于提供一种淡水小龙虾多巴脱羧酶基因Pc-DDC编码的氨基酸序列，其氨基酸序列为SEQ ID N0.2，具有474个氨基酸残基。
[0007]同时，本发明还提供该淡水小龙虾多巴脱羧酶基因Pc-DDC的克隆方法。
[0008]本发明所提供的多巴脱羧酶基因Pc-DDC来源于淡水小龙奸(Procambarusclarkii)，命名为Pc-DDC基因，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1，具有1425bp。
[0009]上述多巴脱羧酶基因Pc-DDC编码的蛋白质来源于淡水小龙奸(Procambarusclarkii)，命名为Pc-DDC蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID N0.2，具有474个氨基酸残基。
[0010]上述淡水小龙虾多巴脱羧酶基因Pc-DDC的克隆方法，包括如下步骤:
[0011](1)选用淡水小龙虾作为实验材料，利用动物总RNA提取试剂盒提取各组织总RNA,获得淡水小龙虾各个组织的总RNA样品；
[0012](2)以步骤(1)获得的总RNA样品作为模板，利用一步法RT-PCR扩增试剂盒进行cDNA的反转录合成，获得淡水小龙虾各个组织的cDNA样品；
[0013](3)设计扩增淡水小龙虾多巴脱羧酶基因Pc-DDC编码区的前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R:
[0014]Pc-DDC-F: 5' -tactcagaattcATGGACGCCGATCAGTTCAG-3'
[0015]Pc-DDC-R: 5' -tactcactcgagTTACTCCTGCAGAATGATC-3'
[0016]以步骤(2)中的淡水小龙虾各个组织的cDNA样品作为模板，进行PCR扩增反应，反应的程序为:94°C预变性3min，94°C变性30s，58°C退火50s，72°C延伸50s，循环35圈，后延伸5min，获得PCR反应产物；
[0017](4)将步骤(3)获得的PCR反应产物进行回收、纯化，之后进行EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切，并且与经过EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切处理的pET-28a载体连接，转化大肠杆菌DH5 α克隆菌株感受态细胞之后，进行菌落PCR筛选，将筛选得到的阳性克隆子送测序公司进行序列测定，获得淡水小龙虾多巴脱羧酶基因Pc-DDC基因序列。
[0018](5)将步骤(4)获得的基因序列，利用分子生物学Expasy在线软件(http://au.expasy.0rg)进行氨基酸序列的翻译,获得对应蛋白质的氨基酸序列。
[0019]本发明的优点:
[0020]本发明涉及一种淡水小龙虾多巴脱羧酶基因Pc-DDC、其编码的氨基酸序列以及克隆方法。该基因在淡水小龙虾体内过量表达可以提高淡水小龙虾先天免疫系统中多巴转化为多巴胺的能力，从而可以提高淡水小龙虾的抗菌能力。
【具体实施方式】
[0021]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述
[0022]实施例1淡水小龙虾肝胰腺组织中多巴脱羧酶基因Pc-DDC的克隆
[0023](1)选用淡水小龙虾肝胰腺组织作为实验材料，利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA Extractor (Trizol)动物总RNA快速抽提试剂盒进行总RNA的提取,获得淡水小龙虾肝胰腺组织的总RNA样品；
[0024](2)以步骤(1)获得的淡水小龙虾肝胰腺组织的总RNA样品作为模板，利用上海生工生物工程有限公司提供的一步法RT-PCR扩增试剂盒进行cDNA的反转录合成，获得淡水小龙虾肝胰腺组织的cDNA样品；[0025](3)设计扩增淡水小龙虾多巴脱羧酶基因Pc-DDC编码区的前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R:
[0026]Pc-DDC-F:5/ -tactcagaattcATGGACGCCGATCAGTTCAG-3'
[0027]Pc-DDC-R: 5' -tactcactcgagTTACTCCTGCAGAATGATC-3'
[0028]以步骤(2)中的淡水小龙虾肝胰腺组织的cDNA样品作为模板，进行PCR扩增反应，反应的程序为:94°C预变性3min，94°C变性30s，58°C退火50s，72°C延伸50s，循环35圈，后延伸5min，获得PCR反应产物；
[0029](4)将步骤(3)获得的PCR反应产物进行回收、纯化，之后进行EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切，并且与经过EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切处理的pET-28a载体连接，转化大肠杆菌DH5 α克隆菌株感受态细胞之后，利用前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R进行菌落PCR筛选，将筛选得到的阳性克隆子送上海生工生物工程有限公司进行序列测定，获得淡水小龙虾肝胰腺组织多巴脱羧酶基因Pc-DDC基因序列。
[0030](5)将步骤(4)获得的基因序列，利用分子生物学Expasy在线软件(http://au.expasy.0rg)进行氨基酸序列的翻译,获得对应蛋白质的氨基酸序列。
[0031]实施例2淡水小龙虾血淋巴组织多巴脱羧酶基因Pc-DDC的克隆
[0032]( I)选用淡水小龙虾作为实验材料，利用淡水小龙虾血淋巴抗凝剂作为佐剂，使用医用注射器从淡水小龙虾腹节中部抽取血淋巴组织液，之后，利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA Extractor (Trizol)动物总RNA快速抽提试剂盒进行总RNA的提取，获得淡水小龙虾血淋巴组织的总RNA样品；
[0033](2)以步骤(1)获得的淡水小龙虾血淋巴组织的总RNA样品作为模板，利用上海生工生物工程有限公司提供的一步法RT-PCR扩增试剂盒进行cDNA的反转录合成，获得淡水小龙虾血淋巴组织的cDNA样品；`
[0034](3)设计扩增淡水小龙虾多巴脱羧酶基因Pc-DDC编码区的前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R:
[0035]Pc-DDC-F:5/ -tactcagaattcATGGACGCCGATCAGTTCAG-3'
[0036]Pc-DDC-R: 5' -tactcactcgagTTACTCCTGCAGAATGATC-3'
[0037]以步骤(2)中的淡水小龙虾血淋巴组织的cDNA样品作为模板，进行PCR扩增反应，反应的程序为:94°C预变性3min，94°C变性30s，58°C退火50s，72°C延伸50s，循环35圈，后延伸5min，获得PCR反应产物；
[0038](4)将步骤(3)获得的PCR反应产物进行回收、纯化，之后进行EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切，并且与经过EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切处理的pET-28a载体连接，转化大肠杆菌DH5 α克隆菌株感受态细胞之后，利用前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R进行菌落PCR筛选，将筛选得到的阳性克隆子送上海生工生物工程有限公司进行序列测定，获得淡水小龙虾血淋巴组织多巴脱羧酶基因Pc-DDC基因序列。
[0039](5)将步骤(4)获得的基因序列，利用分子生物学Expasy在线软件(http://au.expasy.0rg)进行氨基酸序列的翻译,获得对应蛋白质的氨基酸序列。
`[0040]实施例3淡水小龙虾腮组织中多巴脱羧酶基因Pc-DDC的克隆
[0041](I)选用淡水小龙虾腮组织作为实验材料，利用上海生工生物工程有限公司提供的TotalRNA Extractor (Trizol)动物总RNA快速抽提试剂盒进行总RNA的提取，获得淡水小龙虾腮组织的总RNA样品；
[0042](2)以步骤(1)获得的淡水小龙虾腮组织的总RNA样品作为模板，利用上海生工生物工程有限公司提供的一步法RT-PCR扩增试剂盒进行cDNA的反转录合成，获得淡水小龙虾腮组织的cDNA样品；
[0043](3)设计扩增淡水小龙虾多巴脱羧酶基因Pc-DDC编码区的前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R:
[0044]Pc-DDC-F:5/ -tactcagaattcATGGACGCCGATCAGTTCAG-3' [0045]Pc-DDC-R: 5' -tactcactcgagTTACTCCTGCAGAATGATC-3'
[0046]以步骤(2)中的淡水小龙虾腮组织的cDNA样品作为模板，进行PCR扩增反应，反应的程序为:94°C预变性3min，94°C变性30s，58°C退火50s，72°C延伸50s，循环35圈，后延伸5min，获得PCR反应产物；
[0047](4)将步骤(3)获得的PCR反应产物进行回收、纯化，之后进行EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切，并且与经过EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切处理的pET-28a载体连接，转化大肠杆菌DH5 α克隆菌株感受态细胞之后，利用前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R进行菌落PCR筛选，将筛选得到的阳性克隆子送上海生工生物工程有限公司进行序列测定，获得淡水小龙虾腮组织多巴脱羧酶基因Pc-DDC基因序列。
[0048](5)将步骤(4)获得的基因序列，利用分子生物学Expasy在线软件(http://au.expasy.0rg)进行氨基酸序列的翻译,获得对应蛋白质的氨基酸序列。
【权利要求】
1.一种淡水小龙虾多巴脱羧酶基因Pc-DDC，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ IDN0.1。
2.根据权利要求1所述的淡水小龙虾多巴脱羧酶基因Pc-DDC，其特征在于，淡水小龙虾多巴脱羧酶基因Pc-DDC编码的蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID N0.2。
3.一种淡水小龙虾多巴脱羧酶基因Pc-DDC的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)选用淡水小龙虾作为实验材料，利用动物总RNA提取试剂盒提取各组织总RNA，获得淡水小龙虾各个组织的总RNA样品； (2)以步骤(1)获得的总RNA样品作为模板，利用一步法RT-PCR扩增试剂盒进行cDNA的反转录合成，获得淡水小龙虾各个组织的cDNA样品； (3)设计扩增淡水小龙虾多巴脱羧酶基因Pc-DDC编码区的前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R:
Pc-DDC-F: 5' -tactcagaattcATGGACGCCGATCAGTTCAG-3'
Pc-DDC-R:5/ -tactcactcgagTTACTCCTGCAGAATGATC-3/ 以步骤(2)中的淡水 小龙虾各个组织的cDNA样品作为模板，进行PCR扩增反应，反应的程序为:94°C预变性3min，94°C变性30s，58°C退火50s，72°C延伸50s，循环35圈，后延伸5min，获得PCR反应产物； (4)将步骤(3)获得的PCR反应产物进行回收、纯化，之后进行EcoRI和Xho I核酸内切酶双酶切，并且与经过EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切处理的pET-28a载体连接，转化大肠杆菌DH5 α克隆菌株感受态细胞之后，进行菌落PCR筛选，将筛选得到的阳性克隆子送测序公司进行序列测定，获得淡水小龙虾多巴脱羧酶基因Pc-DDC基因序列。 (5)将步骤(4)获得的基因序列，利用分子生物学Expasy在线软件(http://au.expasy.0rg)进行氨基酸序列的翻译,获得对应蛋白质的氨基酸序列。
【文档编号】C12N9/88GK103667324SQ201310534689
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月4日 优先权日:2013年11月4日
【发明者】杜志强, 任乾, 李新苍 申请人:内蒙古科技大学