一种淡水小龙虾mt基因表达模式用于水体质量评价的方法
【专利摘要】本发明涉及一种淡水小龙虾MT基因表达模式用于水体质量评价的方法，属于环境生物【技术领域】。本发明利用淡水小龙虾金属硫蛋白基因（MT基因）表达模式进行工业污水的水体质量评价。本发明首次从淡水小龙虾的肝胰腺组织中克隆到金属硫蛋白基因（MT基因），通过工业污水胁迫实验证明该基因与淡水小龙虾对抗水环境胁迫的生理反应相关，淡水小龙虾受到污水胁迫之后的金属硫蛋白基因（MT基因）的表达模式能够反映水体污染的程度。因此，本发明对应用生物技术方法评价受污染水体的质量以及存在的潜在生态毒理效应提供了一种全面、快速的技术手段，在环境保护方面具有较为广泛的应用前景。
【专利说明】一种淡水小龙虾MT基因表达模式用于水体质量评价的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种淡水小龙虾MT基因表达模式用于水体质量评价的方法，属于环境生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]随着我国经济快速发展的同时，从中央到地方的各级政府十分重视环境保护的问题。在解决经济需要快速发展与环境保护问题日趋严重的矛盾的过程中，各级政府都制定了十分严格的规章制度和处理措施，尤其是将水体环境保护工作作为了首要任务。从历年来频繁出现的水体受污染之后引起的重大环境与居民身体健康问题来看，水环境的保护工作刻不容缓。以频繁出现的企业恶意排污造成的水体污染与当地居民癌症发生率激增的问题来看，各级环境保护部门对于所辖企业在生产过程中产生的污水的监管与检测，需要更为严格、科学、全面的检测手段，对于污水的处理需要更为科学的技术。
[0003]目前，在检测相关企业在生产过程中产生的污水是否达到相关排放标准，各级环保部门通常采用的检测方法是化学检测法。化学检测方法主要是通过以标准物质作为参照，通过仪器的测定来确定被检测水样中的污染物的种类与浓度。通过多次反复测定，化学检测法可以确定出被检测水样中存在的污染物的种类与浓度，与相关排放标准比较之后，可以确定是否达到排放要求。但是，在这个检测过程中，存在一个较大的化学与生物学问题，如果一个被检测的水样通过化学检测法的结果来看，发现样品中存在的多个污染物的含量并没有超过国家标准，说明已经达到了排放的要求。但是，从生物学的效应累加角度来看，水体中所有没有超标的污染物对于生物体的影响作用累加起来，就有可能会造成较为严重的后果，尤其是对于人的身体健康的影响。
[0004]淡水小龙虾学名为克氏原螯虾，在`我国南方和北方都有养殖，它是一个非常常见的甲壳类动物的模式生物，对于生物学试验的研究结果具有一定的指示作用，因为淡水小龙虾便于获得，易于饲养，同时又具有代表意义，所以非常适合作为水体环境质量的指示生物。淡水小龙虾MT基因的全称是金属硫蛋白基因，它在小龙虾受到外界环境胁迫刺激的过程中，会通过调整自身的基因表达量来实现对抗环境胁迫的作用，来进行自身保护，它是一个非常好的能够反映外界环境胁迫程度的指示基因。而淡水小龙虾18S rRNA基因是动物体中的一个持家基因，不论在什么条件的胁迫刺激作用下，18S rRNA基因的表达量不会受到影响。因此，通过将淡水小龙虾MT基因的表达情况与18S rRNA基因进行比较，就可以获得环境胁迫刺激作用下的淡水小龙虾MT基因的相对表达量，来进一步反映环境的污染情况。
[0005]长期以来，对于水体是否受到污染，环境保护部门多采用化学检测的方法，这种方法存在检测手段单一，不能全面说明受污染水体存在的潜在生物学安全问题，而且，这种方法不能够从生物学角度来合理说明水体污染的生态毒理效应。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种快速、全面检测水体质量的一种淡水小龙虾MT基因表达模式用于水体质量评价的方法，该方法利用基因表达模式来定性评价水体污染产生的生态毒理效应。
[0007]技术解决方案:
[0008]本发明采用MT基因的表达模式进行水体质量评价。
[0009]本发明的具体方法如下:
[0010]I)污水水样的预处理:对污水原水进行稀释，稀释倍数为原水的5倍-10倍；
[0011]2)污水胁迫刺激:将步骤(I)中稀释后的污水分成三组，将小龙虾分别放入，同时进行平行试验，小龙虾的放入数量以保证每个取样时候时间点都有活的小龙虾；
[0012]3)模板制作:采用总RNA提取联合cDNA反转录合成的方法制作cDNA样品；
[0013]4)实时荧光定量PCR技术确定MT基因的表达模式:以步骤(3)制备的cDNA样品作为模板进行实时荧光定量PCR，过程中使用的淡水小龙虾MT基因扩增引物为MT-qRT-F引物:5'_gagtgtgccgagggcgggt_3'，MT_qRT_R 引物:5'_gcagggcttggagcaggtc_3'，扩增作为内参的淡水小龙虾18S rRNA基因的引物是18S_qRT_F引物:5'-tcttcttagagggattagcgg-3', 18S_qRT_R 引物:5'_aaggggattgaacgggtta_3',具体扩增程序的反应条件为:95°C预变性3min,之后为反复进行的40个循环,每个循环设置为:95°C变性30s，59°C退火30s，从55°C _95°C按照每秒升高0.5°C的进度进行退火，获得反应过程对应的溶解曲线，并且进行Ct值读数；
[0014]5)定性评价淡水小龙虾MT基因的表达模式与水样污染程度之间的关系:对步骤
(4)溶解曲线读取的Ct值数据进行分析，数据分析的具体方法为:数据的计算形式为其中每一个时间点的ACt=(MT基因平均Ct值-18S rRNA基因平均Ct值)，之后利用excell数据分析工具，以胁迫时间作为横坐标，以2-Λ Ct值作为纵坐标来绘制柱形图，最后要以正常组淡水小龙虾的值作为参照，采用T检验的数据分析方法分析其他各个取样时间点的数值与正常组淡水小龙虾的数值之间的显著性差异，当淡水小龙虾MT基因的最高相对表达量对应的数值与正常组淡水小龙虾的2_Aet数值之间存在显著性差异的时候，确定为重度污染，当淡水小龙虾MT基因的最高相对表达量对应的2_δμ数值与正常组淡水小龙虾的?似数值之间存在极显著差异的时候，确定为严重污染。
[0015]本发明的优点:
[0016]本发明采用基因表达模式的方法评价水体污染的情况，能够深入反映水体污染存在的潜在生态安全问题，技术操作简单，便于环保部门从事水体质量检测的相关人员使用。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为污水胁迫刺激后淡水小龙虾MT基因的表达模式图。
【具体实施方式】
[0018]实施例1:
[0019]某金属冶选尾矿库渗漏污水的水体质量评价与潜在生态毒理效应分析
[0020]图1中，纵坐标数值为2_"et，横坐标数值为时间，*表示此数值与正常对照组相比，
差异显著。[0021]I)水样预处理:取某金属冶选尾矿库渗漏污水(原水)5L-10L备用，用蒸馏水稀释5倍之后平均分为3份(作为3组平行试验)，获得3组水样；
[0022]2)污水胁迫刺激小龙虾:将体重为20g_30g的淡水小龙虾放入步骤(I)中的3组水样之中，每组水样饲养小龙虾30只，取样时间点为胁迫刺激之后的6h、12h、24h、48h、72h，注意:每次取样的小龙虾必须为活的小龙虾，死亡的小龙虾不作为研究对象，同时，没有经过污水胁迫刺激的小龙虾作为正常对照组；
[0023]3)总RNA的提取与cDNA的反转录合成:将正常对照组的小龙虾，胁迫刺激之后的6h、12h、24h、48h、72h时间点上采集的小龙虾在超净工作台中无菌条件下摘取肝脏组织，每一只小龙虾的肝脏取样量为30mg-50mg，每一个时间点的3只小龙虾的肝脏混合在一起进行肝脏总RNA的提取，总RNA的提取利用上海生工生物工程有限公司生产的Total RNAExtractor (Trizol)动物总RNA快速抽提试剂盒进行；cDNA的反转录合成采用上海生工生物工程有限公司生产的一步法RT-PCR扩增试剂盒(M-MuLV)进行，获得各个取样时间点淡水小龙虾肝脏的cDNA样品，合成的各个cDNA样品要求存放在_80°C冰箱之中；[0024]4)实时荧光定量PCR技术确定MT基因的表达模式:以步骤(3)中制备的正常小龙虾肝脏和胁迫刺激后各个时间点的小龙虾肝脏cDNA样品作为模板，以淡水小龙虾18S rRNA基因作为参照，进行淡水小龙虾的MT基因表达模式的实时荧光定量PCR分析，实时荧光定量PCR过程中，扩增MT基因的引物序列为MT-qRT-F引物:5'-gagtgtgccgagggcgggt-3', MT-qRT-R 引物:5'-gcagggcttggagcaggtc-3',扩增 18SrRNA基因的引物序列为 18S_qRT_F 引物:5'-tcttcttagagggattagcgg-3', 18S_qRT_R 引物:5' -aaggggattgaacgggtta-3',实时突光定量PCR分析过程中使用的仪器是美国Bio-Rad公司制造的real-time thermal cycler,使用的试剂盒是宝生物工程(大连)有限公司生产的SYBR Premix EX TaqCPerfect Real time染料法实时荧光定量试剂盒)，实时荧光定量PCR具体扩增程序的反应条件为:95°C预变性3min，之后为反复进行的40个循环，每个循环设置为:95°C变性30s，59°C退火30s，从55°C _95°C按照每秒升高0.5°C的进度进行荧光数值读取，获得反应过程对应的溶解曲线，并且读取Ct值，数据的处理方式采用2_Λα，其中每一个时间点的ACt= (MT基因平均Ct值-18S rRNA基因平均Ct值)，之后，以胁迫时间作为横坐标数值，以每一个时间点对应的2_Λα值作为纵坐标数值，用excel绘图工具来绘制柱形图，显著性差异的分析采用常规的T检验的数据分析法；
[0025]5)定性评价淡水小龙虾MT基因的表达模式与水样污染程度之间的关系:在获得步骤(4)中绘制的excel柱形图之后，以正常组淡水小龙虾的2_吣值作为参照，采用T检验的数据分析方法分析其他各个取样时间点的数值与正常组淡水小龙虾的2_Aet数值之间的显著性差异，当淡水小龙虾MT基因的最高相对表达量对应的2_Λα数值与正常组淡水小龙虾的数值之间存在显著性差异的时候，确定为中度污染，当淡水小龙虾MT基因的最高相对表达量对应的?似数值与正常组淡水小龙虾的2_Aet数值之间存在极显著差异的时候，确定为严重污染。
[0026]本次实验中各个取样时间点对应的2_"et数值以及相对于正常对照组(Oh对照组)的变化情况见下表1，分别显示了取样时间、各个取样时间点对应的淡水小龙虾MT基因相对表达量的2_ΛΜ数值，以及相对于正常对照组(Oh对照组)淡水小龙虾的2_Λα数值的变化情况，其中，淡水小龙虾MT基因最高相对表达量出现在污水胁迫刺激之后的24h，上升倍数为4.771倍，而且与对照组相比较存在显著差异，可以确定属于中度污染，可以判定为存在较为严重的生态毒理效应，结果如图1。
[0027]表I各个取样时间点对应的2_δμ数值以及变化情况
【权利要求】
1.一种淡水小龙虾MT基因表达模式用于水体质量评价的方法，其特征在于，采用MT基因表达模式进行水体质量评价。
2.根据权利要求1所述的一种淡水小龙虾MT基因表达模式用于水体质量评价的方法，其特征在于，包含以下步骤: 1)污水水样的预处理:对污水水样进行稀释，稀释倍数为污水水样的5倍-10倍； 2)污水胁迫刺激:将步骤(I)中稀释后的污水分成三组，将小龙虾分别放入进行胁迫刺激，同时进行平行试验，小龙虾的放入数量要保证每个取样时间点都有活的小龙虾可取； 3)模板制制备:采用总RNA提取与cDNA的反转录合成联合的方法来制备cDNA； 4)实时荧光定量PCR技术确定MT基因的表达模式:以步骤(3)制备的cDNA作为模板进行实时荧光定量PCR，过程中使用的淡水小龙虾MT基因扩增引物为MT-qRT-F引物:5'-gagtgtgccgagggcgggt-3', MT-qRT-R 引物:5'-gcagggcttggagcaggtc-3'，扩增作为内参的淡水小龙奸18S rRNA基因的引物是18S_qRT_F引物:5'-tcttcttagagggattagcgg-3',18S-qRT-R引物:5'_aaggggattgaacgggtta_3',具体扩增程序的反应条件为:95°C预变性3min，之后为反复进行的40个循环，每个循环设置为:95°C变性30s，59°C退火30s，从55°C _95°C按照每秒升高0.5°C的进度进行退火，获得反应过程对应的溶解曲线，并且进行Ct值读数； 5)定性评价淡水小龙虾MT基因的表达模式与水样污染程度之间的关系:对步骤(4)溶解曲线读取的Ct值数据进行分析，数据分析的具体方法为:数据的计算形式为2_Aet，其中每一个时间点的ACt= (MT基因平均Ct值-18S rRNA基因平均Ct值)，之后利用excell数据分析工具，以胁迫时间作为横坐标，以2_Λα值作为纵坐标来绘制柱形图，最后要以正常组淡水小龙虾的值作为参照，采用T检验的数据分析方法分析其他各个取样时间点的2-"ct数值与正常组淡水小龙虾的数值之间的显著性差异，当淡水小龙虾MT基因的最高相对表达量对应的数值与正常组淡水小龙虾的数值之间存在显著性差异的时候，确定为中度污染，当淡水小龙虾MT基因的最高相对表达量对应的2_δμ数值与正常组淡水小龙虾的?似数值之间存在极显著差异的时候，确定为严重污染。
【文档编号】G01N21/64GK103451297SQ201310403798
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】杜志强, 张雪峰, 王建英 申请人:内蒙古科技大学