一种拟穴青蟹过氧素基因Sp-PX、其编码的氨基酸序列以及克隆方法
【专利摘要】本发明涉及一种拟穴青蟹过氧素基因Sp-PX、其编码的氨基酸序列以及克隆方法。通过设计引物、PCR扩增反应、公司序列测定，获得了该基因的cDNA序列全长，其核苷酸序列具有2331bp，编码的氨基酸序列具有776个氨基酸残基。研究拟穴青蟹的过氧素基因Sp-PX对于进一步完善无脊椎动物的先天免疫系统的基础理论有重要的意义之外，还可以为寻找增强拟穴青蟹抗菌能力和抗病毒能力的免疫策略提供理论依据。
【专利说明】—种拟穴青蟹过氧素基因Sp-PX、其编码的氨基酸序列以及克隆方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种拟穴青蟹过氧素基因Sp-PX、其编码的氨基酸序列以及克隆方法，属于分子生物学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]无脊椎动物是一类进化地位比较低等的动物，与脊椎动物的显著区别就在于不具有脊椎。其实，正是由于脊椎的出现，导致了生物进化史上免疫系统的更新，由原来的依靠遗传继承的先天免疫，进化成了可以不断丰富的后天的获得性免疫。获得性免疫方式的出现，使得生物在进化过程中具有了更广泛的免疫形式，同时从被动防御型的免疫方式，转化成为了主动获得型的免疫方式。对于无脊椎动物来说，先天免疫系统正是它们防御细菌、病毒、寄生虫等病原入侵的唯一免疫防御形式，其中，细胞免疫是一种比较重要的免疫途径，涉及到结节的形成、包囊作用与细胞吞噬作用，此外，还涉及到细胞信号传递过程。体液免疫也是一类重要的免疫方式，主要包括抗菌肽的形成与黑化作用。目前，发现有一类分子在发挥生理功能的时候，可以同时催生体液免疫与细胞免疫的发生，这一类分子被称为过氧素分子。
[0003]过氧素基因是一类进化比较保守的基因，表达的产物为过氧素分子。过氧素分子是一类具有复合功能的免疫分子，具有细胞粘附功能和过氧化物酶的功能，从分子的属性上来讲，既是一种具有生物化学催化功能的酶分子，参与了相应的信号途径，也是一种能够发挥细胞粘连作用的免疫效应分子。这种过氧素蛋白质分子在清除细菌以及寄生虫的侵染过程中发挥着重要的作用。目前，在十足类的甲壳动物中，先后发现了这种过氧素分子的同源物，包括斑节对虾、凡纳对虾、中国对虾、淡水小龙虾等虾类。在这些过氧素分子的同源物中，都存在两个结构域，一个是过氧化物酶结构域，另一个是整连蛋白结构域，因此，这类分子具有过氧化物酶的作用和使细胞发生粘连的作用。同时，这两种作用都参与了酚氧化酶原活化系统的信号传递以及蛋白酶的水解级联反应。过氧素分子的过氧化物酶活性最终导致了酚氧化酶原活化系统介导的黑化作用的发生，而细胞粘连作用导致了免疫细胞之间的粘附作用。
[0004]拟穴青蟹属于甲壳纲、十足目、青蟹属，是一种较为重要的水产养殖动物，在我国东南沿海养殖规模较为广泛。在过去的20年间，拟穴青蟹的养殖过程被白斑病毒和弧菌以及其他一些细菌所困扰着，细菌与病毒对于拟穴青蟹的侵染给相关养殖行业带来了较大的经济损失。然而，拟穴青蟹不像高等脊椎动物那样可以通过注射疫苗来防御细菌与病毒的入侵，只能通过寻找可以增强拟穴青蟹自身的抗菌、抗病毒能力的措施来缓解蟹病的发生规模。因为，过氧素基因同时涉及到了细胞免疫与体液免疫，因此，研究拟穴青蟹的过氧素基因对于进一步完善无脊椎动物的先天免疫系统的基础理论有重要的意义之外，还可以为寻找增强拟穴青蟹抗菌能力·和抗病毒能力的免疫策略提供理论依据。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种拟穴青蟹过氧素基因Sp-PX的核苷酸序列，其核苷酸序列为 SEQ ID N0.1，具有 233 Ibp。
[0006]本发明的另一个目的在于提供一种拟穴青蟹过氧素基因Sp-PX编码的氨基酸序列，其氨基酸序列为SEQ ID N0.2，具有776个氨基酸残基。
[0007]同时，本发明还提供该拟穴青蟹过氧素基因Sp-PX的克隆方法。
[0008]本发明所提供的拟穴青蟹过氧素基因Sp-PX来源于拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)，命名为Sp-PX基因，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1，具有2331bp。
[0009]上述过氧素基因Sp-PX编码的蛋白质来源于拟穴青蟹(Scylla paramamosain),命名为Sp-PX蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID N0.2，具有776个氨基酸残基。
[0010]上述拟穴青蟹过氧素基因Sp-PX的克隆方法，包括如下步骤:
[0011](I)选用拟穴青蟹作为实验材料，利用动物总RNA提取试剂盒提取各组织总RNA，获得拟穴青蟹各个组织的总RNA样品；
[0012](2)以步骤(1)获得的拟穴青蟹各个组织总RNA样品作为模板，利用一步法RT-PCR扩增试剂盒进行cDNA的反转录合成，获得拟穴青蟹各个组织的cDNA样品；
[0013](3)设计扩增拟穴青蟹过氧素基因Sp-PX编码区的前后引物Sp-PX-F和Sp-PX-R:
[0014]Sp-PX-F: 5' -TACTCAGAATTCATGAAGGGGCTACTGTTCC-3'
[0015]Sp-PX-R: 5' -TACTCACTCGAGCTAGTACTTCTTTGGTCCCCAA-3'`[0016]以步骤(2)中的拟穴青蟹各个组织的cDNA样品作为模板，进行PCR扩增反应，反应的程序为:95°C预变性3min，95°C变性30s，60°C退火90s，72°C延伸60s，循环35圈，后延伸5min，获得PCR反应产物；
[0017](4)将步骤(3)获得的PCR反应产物进行回收以及纯化，之后进行EcoR I核酸内切酶和Xho I核酸内切酶的双酶切处理，并且与经过EcoR I核酸内切酶和Xho I核酸内切酶双酶切处理的大肠杆菌pET_28a质粒载体连接，转化大肠杆菌DH5 α克隆菌株感受态细胞之后，进行菌落PCR筛选，将筛选得到的阳性克隆子送测序公司进行目的基因的序列测定，获得拟穴青蟹过氧素基因Sp-PX基因序列。
[0018](5)将步骤(4)获得的基因序列，利用分子生物学Expasy在线软件(http://au.expasy.0rg)进行氨基酸序列的翻译,获得对应蛋白质的氨基酸序列。
[0019]本发明的优点:
[0020]本发明涉及一种拟穴青蟹过氧素基因Sp-PX、其编码的氨基酸序列以及克隆方法。该基因在拟穴青蟹体内过量表达可以提高拟穴青蟹先天免疫系统中过氧素分子的表达量，从而可以提高拟穴青蟹的抗细菌与抗病毒的能力。
【具体实施方式】
[0021]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述
[0022]实施例1拟穴青蟹肝胰腺组织中过氧素基因Sp-PX的克隆
[0023](I)选用拟穴青蟹肝胰腺组织作为实验材料，利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA Extractor (Trizol)动物总RNA快速抽提试剂盒进行总RNA的提取,获得拟穴青蟹肝胰腺组织的总RNA样品；[0024](2)以步骤(1)获得的拟穴青蟹肝胰腺组织的总RNA样品作为模板，利用上海生工生物工程有限公司提供的一步法RT-PCR扩增试剂盒进行cDNA的反转录合成，获得拟穴青蟹肝胰腺组织的cDNA样品；
[0025](3)设计扩增拟穴青蟹过氧素基因Sp-PX编码区的前后引物Sp-PX-F和Sp-PX-R:
[0026]Sp-PX-F:5/ -TACTCAGAATTCATGAAGGGGCTACTGTTCC-3;
[0027]Sp-PX-R: 5' -TACTCACTCGAGCTAGTACTTCTTTGGTCCCCAA-3'
[0028]以步骤(2)中的拟穴青蟹肝胰腺组织的cDNA样品作为模板，进行PCR扩增反应，反应的程序为:95°C预变性3min，95°C变性30s，60°C退火90s，72°C延伸60s，循环35圈，后延伸5min，获得PCR反应产物；
[0029](4)将步骤(3)获得的PCR反应产物进行回收、纯化，之后进行EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切，并且与经过EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切处理的pET-28a载体连接，转化大肠杆菌DH5 α克隆菌株感受态细胞之后，利用前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R进行菌落PCR筛选，将筛选得到的阳性克隆子送上海生工生物工程有限公司进行序列测定，获得拟穴青蟹肝胰腺组织过氧素基因Sp-PX基因序列。
[0030](5)将步骤(4)获得的基因序列，利用分子生物学Expasy在线软件(http://au.expasy.0rg)进行氨基酸 序列的翻译,获得对应蛋白质的氨基酸序列。
[0031]实施例2拟穴青蟹腮组织过氧素基因Sp-PX的克隆
[0032](I)选用拟穴青蟹腮组织作为实验材料，利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA Extractor (Trizol)动物总RNA快速抽提试剂盒进行总RNA的提取，获得拟穴青蟹腮组织的总RNA样品；
[0033](2)以步骤(1)获得的拟穴青蟹腮组织的总RNA样品作为模板，利用上海生工生物工程有限公司提供的一步法RT-PCR扩增试剂盒进行cDNA的反转录合成，获得拟穴青蟹腮组织的cDNA样品；
[0034](3)设计扩增拟穴青蟹过氧素基因Sp-PX编码区的前后引物Sp-PX-F和Sp-PX-R:
[0035]Sp-PX-F:5/ -TACTCAGAATTCATGAAGGGGCTACTGTTCC-3;
[0036]Sp-PX-R: 5' -TACTCACTCGAGCTAGTACTTCTTTGGTCCCCAA-3'
[0037]以步骤(2)中的拟穴青蟹腮组织的cDNA样品作为模板，进行PCR扩增反应，反应的程序为:95°C预变性3min，95°C变性30s，60°C退火90s，72°C延伸60s，循环35圈，后延伸5min，获得PCR反应产物；
[0038](4)将步骤(3)获得的PCR反应产物进行回收、纯化，之后进行EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切，并且与经过EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切处理的pET-28a载体连接，转化大肠杆菌DH5 α克隆菌株感受态细胞之后，利用前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R进行菌落PCR筛选，将筛选得到的阳性克隆子送上海生工生物工程有限公司进行序列测定，获得拟穴青蟹腮组织过氧素基因Sp-PX基因序列。
[0039](5)将步骤(4)获得的基因序列，利用分子生物学Expasy在线软件(http://au.expasy.0rg)进行氨基酸序列的翻译,获得对应蛋白质的氨基酸序列。
[0040]实施例3拟穴青蟹眼柄组织过氧素基因Sp-PX的克隆
[0041](I)选用拟穴青蟹的眼柄组织作为实验材料，利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA Extractor (Trizol)动物总RNA快速抽提试剂盒进行总RNA的提取,获得拟穴青蟹眼柄组织的总RNA样品；
[0042](2)以步骤(1)获得的拟穴青蟹眼柄组织的总RNA样品作为模板，利用上海生工生物工程有限公司提供的一步法RT-PCR扩增试剂盒进行cDNA的反转录合成，获得拟穴青蟹眼柄组织的cDNA样品；
[0043](3)设计扩增拟穴青蟹过氧素基因Sp-PX编码区的前后引物Sp-PX-F和Sp-PX-R:
[0044]Sp-PX-F:5/ -TACTCAGAATTCATGAAGGGGCTACTGTTCC-3;
[0045]Sp-PX-R: 5' -TACTCACTCGAGCTAGTACTTCTTTGGTCCCCAA-3'
[0046]以步骤(2)中的拟穴青蟹眼柄组织的cDNA样品作为模板，进行PCR扩增反应，反应的程序为:95°C预变性3min，95° C变性30s，60°C退火90s，72°C延伸60s，循环35圈，后延伸5min，获得PCR反应产物；
[0047](4)将步骤(3)获得的PCR反应产物进行回收、纯化，之后进行EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切，并且与经过EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切处理的pET-28a载体连接，转化大肠杆菌DH5 α克隆菌株感受态细胞之后，利用前后引物Pc-DDC-F和Pc-DDC-R进行菌落PCR筛选，将筛选得到的阳性克隆子送上海生工生物工程有限公司进行序列测定，获得拟穴青蟹眼柄组织过氧素基因Sp-PX基因序列。
[0048](5)将步骤(4)获得的基因序列，利用分子生物学Expasy在线软件(http://au.expasy.0rg)进行氨基酸序列的翻译,获得对应蛋白质的氨基酸序列。
[0049]序列表
[0050]SEQ ID N0.1
[0051]内蒙古科技大学
[0052]一种拟穴青蟹过氧素基因Sp-PX、其编码的氨基酸序列以及克隆方法
[0053]2013-10-22
[0054]2
[0055]I
[0056]2331
[0057]cDNA
[0058]拟穴青蟹
[0059]拟穴青蟹过氧素基因
[0060](1)...(2331)
[0061]ATGMGGGGCTACTGTTCCTGGOGGTGTTGGTGGTGAOGGCAGTGCTGGTGGCOGGCCAGTTTGTTTTCC 70
[0062]CAGGTGOGTCGACTGGAGACCAGGGTGCGTGTGACTGCCAACCGGCCACTGTTTGTGCCATTGATTTOGA 140
[0063]TGTGATCCGGMTGGCTGCCAGCTTGGCGAOGGCAGCCAGGGCGTCTGCTGCCCCTCAGMAGOGCTGCC 210
[0064](XM(X:AGTGOGGATGCCCCOGCCATACGGGGCAGCATGCTCAACGTGAACACCAGGAATGCCTTTGCCG 280
[0065]AGTCGCGACCOGOGGTGGCAGMAGCCAGCTGGAGGTGGOGGTGAGAGCOGGTGTGGCTGCAGTGGACAG 350
[0066]CTTGGCGGCCTTAGAGCAGACACTTGTTCAGAGCMCMCTTCCTGCMAGAGGCACCCOGGCATCCMT 420
[0067]CAOGTGCATCAGTCCAGGATCAGACAGAGTGCCCGTGACATGGACAAGCGTGCCTGGACCATCGTGATGG 490
[0068]CCTCCTCCAGOGTGATGCAGAGOGAGGGCTTCACTAGATCACAGGGCGGCTTGGGACTGOGMACGTGCG 560
[0069]OGTGTCTGAAACCTCCCTTAGGGACCAGTGTCCACCTAAAGTGACGTGCGGAGACCCCAGTAGGAGATAC 630
[0070]OGCACCGCOGACGGCTCTTGCAATCACTTACAGAACCCAGAATCCGGCAAGAGCAACACACCCGCTCAGA 700[0071]GGATTCTCCCTCCCACCTACMOGACGGACTGTCTGCCTTCOGCATMATGGCGTGGACGGGTCTCCTCT 770
[0072]GCCCAATGTAAGAAAAATCAGCAGCTCAATAATGGTTGACATCAATGAGCCGGACCCAGCCTTCAOGCTG 840
[0073]TCOGTGATGCAGTGGCOGCAGTTCATGGACCAOGACTTTGCACACATCCOGTTCCCTTCCCTTGAAAATG 910
[0074]QXAGGGTATTGACTGCTGCCCCMGGACTOGMOGCGCAGCTTCACCCTCGCTGCCAGCCCATCGACAT 980
[0075]CTCCGGAGACCCATTCTTTTCCAAATTCCAAACTAAATGCATGAACTTCGTGAGGAGTATGCTTGCCGTG 1050
[0076]GGTCCTGGAGAGGCCTGCACCTTCGGGTTTGCTGAGCAGCTGAACCAGCTGACCCACTGGATTGAOGGTT I120
[0077]CCAATGTATAOGGCTGGGACGAOGAGGAACAGOGTGCGGTGAGAAGCTTCCAAGGOGGTCTGCTGAGGAC 1190
[0078]TTCCOGTGGCAACCTGCTGCCCATCAACCCCAGCCAGGGAGGAGAGTGTGAGGOGGAGCTGOGAGGCGCT 1260
[0079]GAATGCTTCCTTGCTGGCGAGTCCOGOGTGAAOGAGCAACCAGGCCTCACCACCATCCACATCATCTGGA 1330
[0080]TGOGGGAACACAACOGCCTCGCCTOGGAGCTGCAGCGACTCAACCCTCAGTGGTCTGACGAGGAGGTGTT 1400[0081 ]CCAGGAGGOGOGCCGCATTGTGATOGGCGAGATGCAGCACATCACCTTCAAOGAGTGGCTCCCCATCATC 1470
[0082]ATTGGTCCGAGATTTGTGOGAGOGTTCCGAATOGGGGTCOGGCGTGATGGTTTCAGTAAOGACTATAACC 1540
[0083]CAACCATCAATCCCAACATGAACAACGGATTCTCCACOGCCGCTTTCOGCTTCGGCCACTCTCTGGTGCA 1610
[0084]AGGAACAATCAATCTGATOGGGCAGGACGGGTOGTTCAGTTOGGTACTGCTCAGGAACAACTTCAATTCG 1680
[0085]CCCCACCTCATCCAAAACGAGGGCOGCTTGAATGACTTGGTACGCACCCTGGTTCAGTTCCCCGCGCAGA 1750
[0086]GCTTOGACAACTTCGTTACCCAGGATCTGTCCAACCATCTCTTCCAGACTCCAGAATTTAGCTTCGGCAT 1820
[0087]GGATCTGATGAGCCTCAACATCCACCGGGGGCGTGACCAOGCCATOGCCACTTACAACTCCATGAGGCAG 1890
[0088]GCGTGTGGGCTGOGTCGTGCTACTACTTTCGAAGACTTGAGGGACCAGATCATTCCTCCGCTCATCAACA 1960
[0089]GGCTGAAAGCTCTGTACAAGAGTGTGGAOGACATOGACTTCTTOGCCGGOGGCATGTCCGAGAOGCCGCT 2030
[0090]GCAGGGTAGTTTGCTGGGCTGGACCTTCACCTGCGTCGTGGGTGACCAGTAOGOGOGCCTCAAGAAGGGA 2100[0091 ]GACCGATTCTTCTAOGACCTTGGAGGACAGACOGGCTOGTTCAGGCTGGATCAATTGAATCAGATTCGCC 2170
[0092]GAACGTCCTGGGCTOGAATCCTGTGCGACAACTCGGATCTGACAGCCATCCAGCCTCTTGCCTTCCAACT 2240
[0093]GCCCACCCGTGAACTAAACCGCCCACGTTCCTGCAAGAGCTTCAGCATTCCCAGAGTGGATCTGAGAGCT 2310
[0094]TGGGGACCAAAGAAGTACTAG2331
[0095]SEQ ID N0.2
[0096]2
[0097]776
[0098]PRT
[0099] 拟穴青蟹过氧素
[0100](I)…(776)
[0101]
【权利要求】
1.一种拟穴青蟹过氧素基因Sp-ρχ，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1。
2.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹过氧素基因Sp-PX，其特征在于，拟穴青蟹过氧素基因Sp-PX编码的蛋白质对应的氨基酸序列为SEQ ID N0.2。
3.—种权利要求1所述的拟穴青蟹过氧素基因Sp-PX的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)选用拟穴青蟹作为实验材料，利用动物总RNA提取试剂盒提取各组织总RNA，获得拟穴青蟹各个组织的总RNA样品； (2)以步骤(1)获得的拟穴青蟹各个组织总RNA样品作为模板，利用一步法RT-PCR扩增试剂盒进行cDNA的反转录合成，获得拟穴青蟹各个组织的cDNA样品； (3)设计扩增拟穴青蟹过氧素基因Sp-PX编码区的前后引物Sp-PX-F和Sp-PX-R:
Sp-PX-F: 5' -TACTCAGAATTCATGAAGGGGCTACTGTTCC-3'
Sp-PX-R: 5' -TACTCACTCGAGCTAGTACTTCTTTGGTCCCCAA-3' 以步骤(2)中的拟穴青蟹各个组织的cDNA样品作为模板，进行PCR扩增反应，反应的程序为:95°C预变性3min，95°C变性30s，60°C退火90s，72°C延伸60s，循环35圈，后延伸5min，获得PCR反应产物； (4)将步骤(3)获得的PCR反应产物进行回收以及纯化，之后进行EcoRI核酸内切酶和Xho I核酸内切酶的双酶切处理，并且与经过EcoR I核酸内切酶和Xho I核酸内切酶双酶切处理的大肠杆菌pET_28a质粒载体连接，转化大肠杆菌DH5 α克隆菌株感受态细胞之后，进行菌落PCR筛选，将筛选得到的阳性克隆子送测序公司进行目的基因的序列测定，获得拟穴青蟹过氧素基因Sp-PX基因序`列。 (5)将步骤(4)获得的基因序列，利用分子生物学Expasy在线软件(http://au.expasy.0rg)进行氨基酸序列的翻译,获得对应蛋白质的氨基酸序列。
【文档编号】C12N15/10GK103667320SQ201310534686
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月4日 优先权日:2013年11月4日
【发明者】杜志强, 李新苍, 任乾 申请人:内蒙古科技大学