盐酸苄丝肼一种新的用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，具体涉及盐酸苄丝肼对于动脉粥样硬化疾病的防治作用。
【背景技术】
[0002]盐酸苄丝肼收载于中国药典2010年版(ChP 2010)，欧洲药典7.0版(EP7.0)和日本药典16版(JP16)。盐酸苄丝肼为白色或类白色结晶粉末，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于丙酮，其性质极不稳定，对溶剂PH、光线、温度及湿度的变化极为敏感。盐酸苄丝肼是外周脱羧酶抑制剂，主要用于治疗帕金森氏症(原发性震颤麻痹)，脑炎后或合并有脑动脉硬化的症状性帕金森氏综合征(非药源性震颤麻痹综合症)。
[0003]近年来，随着人们生活水平的提高，人们的生活方式及饮食习惯发生了巨大改变，高脂食物的大量摄入，日常运动的日益减少，加上老龄化人口的不断增多，心脑血管疾病的发病率呈逐年递增趋势，并在在许多国家和地区的死亡谱中居于首位。
[0004]动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是中老年人的常见疾病和好发疾病，是心脑血管疾病的主要病理基础，它是一种以细胞增殖和变性为主要病变的疾病，动脉粥样硬化的发生与高血脂、平滑肌细胞增生及损伤、巨噬细胞及单核细胞等粘附聚集具有密切关系。动脉粥样硬化的危害性极大，可导致患者发生心绞痛、心肌梗死、心源性猝死、外周动脉疾病等，动脉粥样硬化已成为全球死亡的首因，对患者的生命健康构成了严重威胁。正是由于动脉粥样硬化的严重危害性，所以近年来，动脉粥样硬化受到了社会及人们的广泛关注，对于动脉粥样硬化的药物治疗研宄成为了一个研宄热点。挖掘出一个具有良好的动脉粥样硬化防治效果的药物对保障患者的生命健康具有重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明采用不同浓度的盐酸苄丝肼治疗高脂动脉粥样硬化造模的ApoE-/-小鼠，结果发现低剂量盐酸苄丝肼(25mg/kg/d)能够显著减少ApoE-/-高脂动脉粥样硬化造模小鼠的血管壁动脉粥样硬化斑块面积及血管壁巨噬细胞沉积，且效果优于中剂量盐酸苄丝肼(50mg/kg/d)及高剂量盐酸节丝肼(100mg/kg/d)。
[0006]下面是药理学部分试验及结果:
[0007]一、实验动物分组
[0008]空白对照组(野生型C57小鼠10只)、模型对照组(ApoE-/-小鼠10只)、盐酸苄丝肼低剂量组(ApoE-/-小鼠10只、25mg/kg/d)、盐酸苄丝肼中剂量组(ApoE-/-小鼠10只、50mg/kg/d)、盐酸节丝肼高剂量组(ApoE-/-小鼠10只、100mg/kg/d)。
[0009]二、建立动脉粥样硬化模型及给药处理
[0010]所有小鼠均饲养于SPF级动物房内，并采取自由采食及饮水的饲养方式。对上述五组小鼠采用基础饲料适应性喂养I周后，给空白对照组小鼠喂食基础饲料，给模型对照组、盐酸苄丝肼给药的三组小鼠均喂食高脂饲料，高脂饲养的同时给予盐酸苄丝肼低剂量组小鼠腹腔注射盐酸苄丝肼25mg/kg/d，盐酸苄丝肼中剂量组小鼠腹腔注射盐酸苄丝肼50mg/kg/d，盐酸苄丝肼高剂量组小鼠腹腔注射盐酸苄丝肼100mg/kg/d，空白对照组及模型对照组小鼠则腹腔注射相应体积的生理盐水。连续给药处理8周后，处死小鼠，取小鼠主动脉标本，进行HE染色及巨噬细胞免疫组化实验。
[0011]三、病理切片HE染色检测
[0012]取小鼠主动脉根0.5cm置于10%福尔马林固定24h，常规脱水，标本以石蜡包埋、连续切片，片厚4 μ m，对切片进行HE染色并镜检。
[0013]光镜下可见空白对照组小鼠主动脉壁由内膜，中膜及外膜组成，分界清楚，厚度均一。内膜表被单层扁平上皮，内膜下为内弹性膜。中膜主要由弹性膜组成，外膜为疏松结缔组织，可见脂肪，如图1。模型对照组小鼠主动脉光镜下局部内膜隆起，出现明显的动脉粥样硬化斑块，斑块主要由吞噬脂质的泡沫细胞组成，泡沫细胞表面可见少量胶原纤维、平滑肌细胞，如图2。盐酸苄丝肼低剂量组小鼠主动脉光镜下，仅见少量泡沫细胞沉积，未形成明显的斑块，如图3。盐酸苄丝肼中剂量组及高剂量组小鼠主动脉光镜下，内膜增厚明显减轻，斑块数目明显减少，但效果不如盐酸苄丝肼低剂量组，如图4、图5。
[0014]四巨噬细胞免疫组化检测
[0015]取小鼠主动脉根0.5cm置于10%福尔马林固定24h，常规脱水，标本以石蜡包埋、连续切片，片厚4 μ m，对切片进行巨噬细胞免疫组化检测。
[0016]光镜下可见空白对照组小鼠主动脉内壁无棕黄色斑块沉积，也未见巨噬细胞，如图6。模型对照组小鼠主动脉内壁有明显斑块沉积，且斑块内有大量的巨噬细胞，如图7。盐酸苄丝肼低剂量组小鼠主动脉内壁无明显斑块沉积，仅见少量巨噬细胞粘附，如图8。盐酸苄丝肼中剂量组及高剂量组小鼠主动脉内壁，可见明显斑块，斑块内富含巨噬细胞，较模型组减少，但效果不如盐酸苄丝肼低剂量组，如图9、图10。
【附图说明】
[0017]图1是空白对照组小鼠主动脉根HE染色镜检图。
[0018]图2是模型对照组小鼠主动脉根HE染色镜检图。
[0019]图3是盐酸苄丝肼低剂量组小鼠主动脉根HE染色镜检图。
[0020]图4是盐酸苄丝肼中剂量组小鼠主动脉根HE染色镜检图。
[0021]图5是盐酸苄丝肼高剂量组小鼠主动脉根HE染色镜检图。
[0022]图6是空白对照组小鼠主动脉根巨噬细胞免疫组化镜检图。
[0023]图7是模型对照组小鼠主动脉根巨噬细胞免疫组化镜检图。
[0024]图8是盐酸苄丝肼低剂量组小鼠主动脉根巨噬细胞免疫组化镜检图。
[0025]图9是盐酸苄丝肼中剂量组小鼠主动脉根巨噬细胞免疫组化镜检图。
[0026]图10是盐酸苄丝肼高剂量组小鼠主动脉根巨噬细胞免疫组化镜检图。
【具体实施方式】
[0027]实施例一
[0028]I)高脂饲料配方
[0029]15%猪油，2%胆固醇，1.5%全脂奶粉，1.5%蛋黄粉，0.2%胆酸钠+79.8%普通饲料。
[0030]2) HE 染色
[0031](I)石蜡切片常规脱蜡:二甲苯(I)15min — 二甲苯(II)(应完全透明)1min ；
(2)逐级下行梯度乙醇浸泡水化:100%乙醇(I)2min — 100%乙醇(II) 2min — 95%乙醇2min —80%乙醇2min —自来水冲洗片刻；(3)染色:蒸馏水洗片刻一苏木素液染核5min —自来水冲洗片刻一I %盐酸乙醇分化30s (提插数下)一流水冲洗片刻一弱氨水水溶液反蓝数秒一流水冲洗1min —置0.5%伊红水溶液中复染1min ； (4)逐级上行梯度乙醇脱水:自来水冲洗片刻(分化伊红)一95%乙醇(I)2min —95%乙醇(II) 2min — 100%乙醇(I) 2min — 100% 乙醇(II) 2min ； (5)透明:二甲苯(I) 5min — 二甲苯(II) 5min ； (6)固定、封片:盖玻片下中性树脂固定、封片。
[0032]3)免疫组化染色
[0033]1.石蜡切片完成以后，先放于铁架上烘箱60°C烘片lh，结束后可抽查下切片石蜡是否融化。
[0034]2.然后依次二甲苯I 15min，二甲苯II 15min，无水乙醇5min，95%乙醇5min，85%乙醇5min，75%乙醇5min，H20 5min，PBS 5min。注意:液面都要浸过切片上的组织。
[0035]3.在烧杯中中加入足量的柠檬酸缓冲液，先让液体沸腾(要求沸腾不要太剧烈)，然后加入切片，20min后烧杯停止加热，让其自然冷却，然后PBS洗，3*3min。
[0036]4.切片甩干，然后横放于湿盒，滴加3% H202，盖上盖子室温孵育lOmin。
[0037]5.?83洗，3*311^11。切片甩干，然后用3% BSA封闭切片组织，湿盒室温孵育30min。
[0038]6.切片去封闭液，然后滴加第一抗体，湿盒4°C过夜。
[0039]7.第二天取出湿盒，并放于室内30min，让其复温。
[0040]8.PBS洗，3*3min。切片甩去PBS，然后切片滴加第二抗体湿盒室温孵育20min。
[0041]9.PBS洗，3*3min。切片甩去PBS，然后切片滴加第三抗体湿盒室温孵育20min。
[0042]10.PBS洗，3*3min。切片甩去PBS，然后切片滴加新鲜配制的DAB显色液，3_5min后用水冲洗掉DAB液体。苏木素复染，l_3min后用水洗掉苏木素。注意:具体染色时间根据实际情况来定。
[0043]11.切片脱水干燥。程序如下:H20 3min，75%乙醇3min，85%乙醇3min，95%乙醇3min，无水乙醇3min，二甲苯I 15min，二甲苯II 15min。
[0044]12.待二甲苯挥干，中性树胶封片。
【主权项】
1.盐酸苄丝肼用于动脉粥样硬化疾病防治的药物用途。
【专利摘要】本发明公开了盐酸苄丝肼在动脉粥样硬化防治方面的效果。本发明通过动物实验研究了盐酸苄丝肼的对于动脉粥样硬化疾病的防治作用，此研究符合我国药物现代化的发展方向，在基础研究领域和应用研究领域内具有重要的社会意义和潜在的经济效益。
【IPC分类】A61K31/165, A61P9/10
【公开号】CN104940180
【申请号】CN201510407527
【发明人】何书英, 余新超, 吴杰, 方婷欢, 季璇馨
【申请人】中国药科大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年7月9日