本发明属于复合生物材料制备领域，具体涉及一种胎盘干细胞复合壳聚糖组织修复材料的制备方法。
背景技术：
近年来，具有增殖和分化潜能的干细胞己经成为皮肤组织工程中好的种子细胞。胚胎干细胞在皮肤组织工程中应用研究，为构建组织工程皮肤在皮肤损伤修复的应用提供了理论依据。但是胚胎干细胞在医学应用上存在道德伦理问题和致瘤性等限制因素，而具有多向分化潜能的多能干细胞一一间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)作为良好的种子细胞，在皮肤组织工程研究中倍受关注。以往的研究主要是集中于骨髓来源的bmscs但bmscs需要通过骨髓穿刺而获得，且数量随年龄增长而下降，这都限制了bmscs的应用，且支架材料的选择和应用一直影响该技术发展的重要难题。
技术实现要素：
根据现有技术中存在问题，本发明采用新生儿娩后“废弃物”的胎盘组织获取cmscs，并选用壳聚糖材料作为支架材料，制得胎盘干细胞复合壳聚糖组织修复材料。
本发明采用以下技术方案：
一种胎盘干细胞复合壳聚糖组织修复材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：机械剥除胎盘羊膜组织，将剥离后剩下的绒毛组织，过质量浓度75％的酒精，再用pbs冲洗洗尽血渍，并将其剪成1mm2小块后，浸没于含有质量浓度0.1％的iv型胶原酶的低糖基础培养基(l-dmem)中，37℃消化15-45分钟,得细胞组织液；
步骤二：细胞组织液经200目筛网过筛后转移至干净的离心管，1200rpm离心lomin，弃上清液后接种于含有质量浓度10％的胎牛血清的低糖基础培养基(l-dmem)中，于37℃、5％co2的培养箱中培养5天后进行第一次换液，随后每隔两天进行换液，待细胞融合至90％使用质量浓度0.25％的胰酶进行消化，得胎盘绒毛膜来源间充质干细胞(cmscs)；
步骤三：称取0.2g壳聚糖，溶于40ml去离子水中，配制质量体积比为20％的壳聚糖溶液，另加入0.32g氯化钠晶体及0.5ml冰醋酸，调节ph至5.0混合搅拌均匀得壳聚糖溶液；
步骤四：称取8g明胶，溶于40m1去离子水中，充分振荡后将溶液置于50℃水浴箱，待溶解后转入培养皿中，放入4℃冰箱，凝固后得固体凝胶；
步骤五：将壳聚糖溶液加入固体凝胶表面，浸泡5-7分钟，然后移出壳聚糖溶液，再加入清水浸泡1分钟，每浸泡一次壳聚糖溶液为1层，共做15层；将固体凝胶取出，放入装有37℃水的容器中，随着明胶基底逐渐熔化，其表面有薄膜析出，即得壳聚糖纳米膜；
步骤六：取生长状况良好的胎盘绒毛膜来源间充质干细胞(cmscs)接种于壳聚糖纳米膜上，接种时间为2-12h，即得胎盘干细胞复合壳聚糖组织修复材料。
优选的，所述的步骤一还包括：将剥离后剩下的绒毛组织制成面积为10cm2。
优选的，步骤一中所述的pbs中含有质量浓度0.1％的青-链霉素。
优选的，所述的步骤五还包括：将壳聚糖纳米膜冷冻干燥，并置于24孔板中，于放射co60辐射消毒。
优选的，所述的步骤五中浸泡均在20℃室内环境下进行。
本发明的有益效果在于：
1)胎盘绒毛膜来源间充质干细胞(cmscs)具有较强的增殖、分化能力，且取材的便利，不涉及社会伦理等问题的优势，其作为种子细胞在皮肤组织工程中具有极大的运用前景。
2)壳聚糖被视为细胞支架材料并广泛运用在组织工程领域。壳聚糖是一种来源于海洋蟹类生物的天然多糖，生物相容性好，可降解，无毒性而且有其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等均具有一定的抗菌效果。对细胞的粘附、迁移有促进作用。
3)本发明制得的组织修复材料，可以加快皮肤修复，具有优良的组织修复的功效。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
一种胎盘干细胞复合壳聚糖组织修复材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：机械剥除胎盘羊膜组织，将剥离后剩下的绒毛组织制成面积为10cm2，过质量浓度75％的酒精，再用含有质量浓度0.1％的青-链霉素的pbs冲洗洗尽血渍，并将其剪成1mm2小块后，浸没于含有质量浓度0.1％的iv型胶原酶的低糖基础培养基(l-dmem)中，37℃消化15-45分钟,得细胞组织液；
步骤二：细胞组织液经200目筛网过筛后转移至干净的离心管，1200rpm离心lomin，弃上清液后接种于含有质量浓度10％的胎牛血清的低糖基础培养基(l-dmem)中，于37℃、5％co2的培养箱中培养5天后进行第一次换液，随后每隔两天进行换液，待细胞融合至90％使用质量浓度0.25％的胰酶进行消化，得胎盘绒毛膜来源间充质干细胞(cmscs)；
步骤三：称取0.2g壳聚糖，溶于40ml去离子水中，配制质量体积比为20％的壳聚糖溶液，另加入0.32g氯化钠晶体及0.5ml冰醋酸，调节ph至5.0混合搅拌均匀得壳聚糖溶液；
步骤四：称取8g明胶，溶于40m1去离子水中，充分振荡后将溶液置于50℃水浴箱，待溶解后转入培养皿中，放入4℃冰箱，凝固后得固体凝胶；
步骤五：于20℃室内环境下，将壳聚糖溶液加入固体凝胶表面，浸泡5-7分钟，然后移出壳聚糖溶液，再加入清水浸泡1分钟，每浸泡一次壳聚糖溶液为1层，共做15层；将固体凝胶取出，放入装有37℃水的容器中，随着明胶基底逐渐熔化，其表面有薄膜析出，即得壳聚糖纳米膜，将壳聚糖纳米膜冷冻干燥，并置于24孔板中，于放射co60辐射消毒；
步骤六：取生长状况良好的胎盘绒毛膜来源间充质干细胞(cmscs)接种于消毒后的壳聚糖纳米膜上，接种时间为2-12h，即得胎盘干细胞复合壳聚糖组织修复材料。
取200g左右sd大鼠12只，将sd大鼠麻醉后造模处理，背部剃毛消毒灭菌后，剪开5cm直径大小圆形皮肤缺损创面，将实施例制得的胎盘干细胞复合壳聚糖组织修复材料植入其中，得实验组；空白对照组在相同创面处，覆盖凡士林纱布。于术后每天观察创面情况，并于30天后进行组织切片he染色，将实验组、空白组进行比较。
实验结果显示，与未加入任何材料的空白对照组相比，本发明制得的胎盘干细胞复合壳聚糖组织修复材料能够更好更快的修复大鼠皮肤损伤。手术5天后，实验组大鼠背部创面伤口缝线处己经愈合，创面干燥，无分泌物。lod后，实验组大鼠的创面基本愈合，创口伴有鲜红色的肉芽组织生成，空白对照组创面可见大量脓性分泌物。30天后，实验组的大鼠创面面积缩小，创面完全愈合，创面处己生长毛发，与周围皮肤几乎融为一体；空白对照组创面结痴，暗红色血块，皮肤未修复完成。