一种胎盘造血干细胞的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体的说是设及一种胎盘造血干细胞的制备方法。
【背景技术】
[0002] 造血干细胞化emopoieticStemcell,服C)是存在于造血组织中的一群原始造血 细胞，它不是组织固定细胞，可存在于造血组织及血液中。造血干细胞是所有造血细胞和免 疫细胞的起源，具有自我更新和多向分化能力。它的基本特性是具有自我更新能力，即经过 一个细胞周期活动之后，可W产生两个与分裂前性质相同的造血干细胞，同时又具有多向 分化能力，即在一定的环境条件下，造血干细胞具有向各系血细胞分化的能力。
[0003] 随着对造血干细胞化SC)日渐深入的研究，HSC移植已经成为治疗许多恶性血液 系统疾病及其他肿瘤的有效手段。目前，服C的主要来源是骨髓、外周血及厮血，骨髓和外 周血HSC增殖和分化能力下降，并且易受供者健康状态影响，而厮血HSC数量有限，该些限 制因素使其不能满足日渐增长的服C临床应用需求。近年来，国内外学者研究发现，胎盘中 含有大量的早期干细胞，包括数量丰富的造血干细胞。该些干细胞在胎盘中行使着造血的 功能。小孩出生后剥离的胎盘内所含的造血干细胞，是厮带血的8-10倍，可供小孩自用几 次，甚至可提供给多个成人患者的治疗。胎盘造血干细胞的成功分离和提取可解决临床上 HSC的来源问题，具有广阔的临床应用前景。
[0004] 目前，胎盘HSC的分离提取方法主要采用机械法、机械酶解法等。机械法所获取 的细胞数量较少，且含有大量的细胞碎片，细胞活率低；而机械酶解法能获取数量充足的细 胞，但其中的造血干细胞含量较低。此外，整个提取过程操作繁复、耗时长、成本高；提取出 来的细胞活率低。
[0005] 美国专利US20120177616"Methodsforaugmentationcollectionof placentalhematopoieticstemcellsandusesthereof"公开了一种采用动员剂获取造 血干细胞的方法，其将动员剂灌注至胎盘动静脉，动员胎盘组织中的造血干细胞进入到血 管中，W此方式获得造血干细胞，此动员剂方法虽然较之机械法和机械酶解法在细胞数量 和细胞活率方面有一定优势，但是其效果仍然不够理想，需要进一步改进制备整个制备技 术。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种胎盘造血干细胞的制备方法，使得所述制 备方法能够提高包含造血干细胞的单个核细胞数量及其活细胞数量。
[0007] 本发明的另一个发明目的在于提供一种胎盘造血干细胞的制备方法，使得所述制 备方法能够提高CD34阳性细胞数量，即造血干细胞数量。
[000引为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0009] 一种胎盘造血干细胞的制备方法，包括W下步骤：
[0010]步骤1、胎盘预处理后，用灌洗液灌注清洗胎盘；
[0011] 步骤2、将动员剂从胎盘动脉灌注至胎盘静脉流出动员剂停止并结扎胎盘动静脉 静置，所述动员剂为包括AMD3100、构檢酸盐缓冲溶液、青-链霉素双抗、磐粟碱、N-己酷半 脱氨酸、维生素C和Z-VAD-FMK的DMEM高糖基础培养基；
[0012] 步骤3、松开胎盘动静脉并从动脉灌注与步骤2同量的动员剂，从静脉处收集全部 液体，离屯、取细胞沉淀，然后依次经哲己基淀粉法和红细胞裂解法回收纯化包含造血干细 胞的单个核细胞，重悬后获得所述胎盘造血干细胞。
[0013] 针对现有动员剂灌注法获取的胎盘造血干细胞数量W及活率不高的问题，本发明 从改进动员剂组成出发，W多种适宜的组分组成全新的动员剂，使其不仅能够动员胎盘内 部的造血干细胞并在短时间内迅速进入血液循环系统，同时提高了造血干细胞的数量和活 率，解决了现有技术的问题。
[0014] 本发明所用胎盘由某医院妇产科提供，选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性 且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书。术前准备无菌聚苯己 締胎盘采集盒作为运送容器，内装胎盘保存液，采集后4°c条件下12小时内送到制备处分 离制备胎盘造血干细胞。
[0015] 本发明技术方案中所用AMD3100、青-链霉素双抗、Z-VAD-FMK、DMEM高糖基础培 养基均为本领域市售的产品，其中AMD3100 (商品名Plerixa化r)是一种人工合成的大环类 SDF-1受体CXCR4特异性括抗剂，可购自于sigma公司；Z-VAD-FMK是一种泛化spase抑制 剂/调亡抑制剂，可购自于BioVision公司；DMEM高糖基础培养基可购自于Gibco公司。
[0016] 作为优选，步骤1所述灌洗液灌注清洗胎盘为：
[0017] 将0-4°C灌洗液灌注进胎盘中的动脉，直至胎盘内血清清洗干净。
[001引为了进一步配合所述动员剂，共同作用于胎盘制备出大量高活力的胎盘造血干 细胞，本发明所述灌洗液优选为包括青-链霉素双抗、邸TA、构檢酸盐缓冲溶液、磐粟碱和 N-己酷半脱氨酸的PBS缓冲液；更优选地，所述灌洗液为包括1-3倍的青-链霉素双抗、 0. 01-0. 04% (质量百分比化DTA、1倍的构檢酸盐缓冲溶液、0. 01-0.Img/mL的磐粟碱和 0. 5-2mmol/L的N-己酷半脱氨酸的抑值为7. 0的PBS缓冲液。
[0019] 本发明所述1-3倍的双抗或1倍的构檢酸盐缓冲液均为本领域常规的试剂浓度表 示方法，一般所购买的青-链霉素双抗或所配置的构檢酸盐缓冲液均为高倍母液，在使用 时会稀释配置成低倍数，如所购买的青-链霉素双抗多数为100倍，而构檢酸盐缓冲液一般 配制成5倍或10倍，其配制方法如磯酸缓冲液属于本领域公知，作为优选，本发明提供5倍 构檢酸盐缓冲液配制方法，如下：
[0020] 称取构檢酸钢粉末26. 3g、构檢酸粉末3. 27g、葡萄糖12. 7g、磯酸二氨钢4. 44g、腺 嚷岭0. 55g，把上述各组分溶于400血的去离子水中，充分揽拌混匀后形成5倍构檢酸盐缓 冲溶液，0.22ym过滤，分装。
[0021] 在本发明所述制备方法的起始阶段，需要对胎盘进行预处理，该一措施属于本领 域公知，即对胎盘进行消毒、除去胎盘羊膜W及洗漆等步骤，在制备造血干细胞前，本领域 技术人员均知晓该些预处理步骤并能够根据实际情况选择具体的预处理步骤。作为优选， 本发明所述预处理为剥离羊膜并用灌洗液清洗胎盘。
[0022] 作为优选，所述动员剂为包括0. 3-3mg/LAMD3100、1倍的构檢酸盐缓冲溶液、1倍 的青-链霉素双抗、0. 01-0.Img/mL的磐粟碱、0. 5-2mmol/L的N-己酷半脱氨酸、0. 3mg/mL 维生素C和50ng/mL的Z-VAD-FMK的DMEM高糖基础培养基。
[0023] 作为优选，所述哲己基淀粉法具体步骤为：
[0024] 将细胞沉淀和哲己基淀粉按体积比细胞沉淀；哲己基淀粉=1:1-3的比例，用哲 己基淀粉重悬细胞沉淀，室温下静置20-40min，吸取上清离屯、，离屯、后弃上清。
[0025] 作为优选，所述红细胞裂解法具体步骤为：
[0026] 将经哲己基淀粉法处理后的细胞沉淀和1倍的红细胞裂解液，按体积比细胞沉 淀；1倍红细胞裂解液=1:5-10的比例，用1倍的红细胞裂解液重悬细胞沉淀，祸旋振荡 5s，室温下裂解残留的红细胞lOmin，离屯、后弃上清获得包含造血干细胞的单个核细胞。
[0027] 作为优选，步骤3所述重悬WDMEM高糖基础培养基重悬。
[002引在造血干细胞数量和活率的对比试验中，W本发明所述制备方法、美国专利US20120177616的方法（区别在于动员剂的组成不同）W及现有机械酶解法（I型胶原酶） 进行对比，结果显示，在包含造血干细胞的单个核细胞数量及其活细胞数量、CD34阳性细胞 数量上均显著高于两种现有对照方法。
[0029] 由W上技术方案可知，本发明改善动员剂灌注法工艺，选择多种相互适宜的组分 组成新型动员剂应用于胎盘造血干细胞制备过程中，不仅能够动员胎盘内部的造血干细胞 并在短时间内迅速进入血液循环系统，而且同时提高了包含造血干细胞的单个核细胞数量 及其活细胞数量W及CD34阳性细胞数量。
【附图说明】
[0030] 图1所示为本发明实施例1方法制备的造血干细胞的流式检测图；
[0031] 其中，图1-A和图1-B为不加抗体的对照组，图1-C和图1-D为添加抗体的检测组， 图1-A和图1-C均为检测单个核细胞总数的流式检测图，所圈区域P4即表示单个核细胞总 数所占百分比（图1-A中为6. 6%，图1-C中为6. 9% )，图1-B和图1-D均为检测CD34阳 性细胞数的流式检测图，右侧百分比为CD34阳性细胞在单个核细胞中的百分比；
[0032] 图2所示为对照方法1制备的造血干细胞的流式检测图；
[003引其中，图2-A和图2-B为不加抗体的对照组，图2-C和图2-D为添加抗体的检测组， 图2-A和图2-C均为检测单个核细胞总数的流式检测图，所圈区域P2即表示单个核细胞总 数所占百分比（图2-A中为3. 5%，图2-C中为3. 6% )，图2-B和图2-D均为检测CD34阳 性细胞数的流式检测图，右侧百分比为CD34阳性细胞在单个核细胞中的百分比；
[0034] 图3所示为对照方法2制备的造血干细胞的流式检测图；
[003引其中，图3-A和图3-B为不加抗体的对照组，图3-C和图3-D为添加抗体的检测组， 图3-A和图3-C均为检测单个核细胞总数的流式检测图，所圈区域P1即表示单个核细胞总 数所占百分比（图3-A中为4. 0%，图3-C中为3. 4% )，图3-B和图3-D均为检测CD34阳 性细胞数的流式检测图，右侧百分比为CD34阳性细胞在单个核细胞中的百分比。
【具体实施方式】
[0036] 本发明实施例公开了一种胎盘造血干细胞的制备方法。本领域技术人员可W借鉴 本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技 术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施 例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的产品及 方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0037] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种胎盘造血干细胞的 制备方法进行详细说明。
[003引实施例1 ;本发明所述胎盘造血干细胞的制备方法
[0039] 选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇 知情同意并签署知情同意书。术前准备无菌聚苯己締胎盘采集盒作为运送容器，内装胎盘 保存液，采集后4°C条件下12小时内送到制备处分离制备胎盘造血干细胞。
[0040] 在无菌超净台内，取l-2ml胎盘采集液做无菌检测，然后将胎盘剥离