一种重楼珠心细胞的悬浮培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种重楼的组织培养方法，特别是涉及一种重楼珠心细胞的悬浮培养方法。
【背景技术】
[0002]重楼是名贵中药材之一，其主要有效成分是留体皂苷。现代药理研宄表明，重楼具有抗肿瘤、止血、止咳平喘、抗菌、抗病毒等作用，其良好的疗效已被众多的制药工业用于药剂的使用，是云南白药、宫血宁、热毒清等重要中成药的主要成分。
[0003]随着中医药产业的快速发展，重楼药材的需求正以每年20%的幅度递增，而其野生资源却逐年减少，导致重楼价格迅速上涨，严重制约了制药企业的产量和质量。当前，重楼主要靠采挖野生资源，由于长期过度采挖，并缺乏对其生态环境的保护，致使野生重楼资源遭到了毁灭性的破坏，现己濒临灭绝。
[0004]目前重楼主要是靠种子和根茎进行繁殖，由于重楼种子存在种胚发育不完全，胚乳坚硬，胚轴后熟等明显“双重休眠”特性，因此重楼种子在播种后通常需要经历两个冬天才能萌发成苗，是典型的“ 二年生种子”，而且在自然状态下重楼种子出苗率很低、生长周期长，从出苗到成材需要8-10年的时间；而使用重楼根茎进行营养繁殖，由于重楼根茎本身就是其药用有效部位，因此利用根茎切块生产重楼种苗存在用种量大、生产成本高等问题。
[0005]利用生物工程的悬浮培养技术生产药用植物具有周期短、生长速度快和工业上可利用发酵进行大规模生产等优点。目前还未见任何有关重楼珠心细胞悬浮培养方面的研宄报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种重楼珠心细胞的悬浮培养方法，该方法能实现重楼珠心细胞的快速增殖，以缓解当前重楼药材资源紧缺的问题。
[0007]为达到上述目的，本发明采用的解决方案由如下步骤构成:
[0008](I)重楼种子的预处理:选取尚未完全成熟的重楼果实，去掉果皮后先进行浸泡，然后将浸泡后的重楼种子搓去外种皮后，再用升汞溶液进行消毒，将消毒后的重楼种子用无菌水冲洗后，用滤纸吸干内种皮表面的水分，再用小刀划伤重楼种子的内种皮，并将划伤内种皮的重楼种子放置一段时间，使重楼种子内种皮产生爆裂，露出大量重楼珠心细胞；
[0009](2)重楼珠心细胞的预培养:取内种皮产生爆裂的重楼种子，放在超净工作台上用0.1%的升汞溶液消毒2?4分钟，用无菌水冲洗后，用解剖刀切取重楼种子的珠心细胞接入液体培养基 B5+ 赤霉素 200-600mg/L+KTl.0-3.0mg/L+IAA 0.5-1.5mg/L 中进行 25 ?35天的预培养；
[0010](3)重楼珠心细胞的悬浮培养:选取预培养后处于悬浮培养液中部或/和下部的重楼珠心细胞和细胞团块，以40?80g.I/1的接种量转接到B5+6-BA0.5?2.0mg/L+NAA0.5?2.0mg/L+2, 4-D 1.0?3.0mg/L液体培养基中进行细胞悬浮培养；
[0011](4)细胞的继代培养:在细胞悬浮培养了 40?60天进行第一次继代培养，以后每隔35?45天继代一次，每次的接种量为30?60g.L—1;
[0012]上述⑵、(3)、⑷步骤中重楼珠心细胞的液体培养条件均为温度20?25°C，pH值5.0?7.0，无光照，摇床转速为120?180r.mirT1。
[0013]进一步地，步骤(I)中所述浸泡是指用浓度为1/104的高锰酸钾溶液浸泡24?72小时。
[0014]进一步地，步骤(I)中所述用升汞溶液进行消毒是指放入浓度为0.01%的升汞溶液中消毒4?7分钟。
[0015]进一步地，步骤(I)中所述将划伤内种皮的重楼种子放置一段时间是指将划伤内种皮的重楼种子在温度为25?30°C、光照强度为1500?20001x的条件下放置3?5小时。
[0016]本发明通过对重楼珠心细胞进行悬浮培养，可实现大规模快速生产出有效成分含量高的重楼细胞培养物，从而可有效解决当前重楼植物资源和药材资源短缺的问题。
【具体实施方式】
[0017]实施例1
[0018](I)重楼种子的预处理:选取八月下旬采摘的尚未完全成熟的重楼果实，去掉果皮后将带外种皮的重楼种子用浓度为I/?ο4的高锰酸钾溶液浸泡24小时，期间每隔12小时换高锰酸钾溶液一次，取出浸泡后的重楼种子，搓去外种皮后，放入浓度为0.01 %的升汞溶液中消毒4分钟，用无菌水冲洗2次后，迅速用已消毒的滤纸吸干内种皮表面的水分，接着用小刀划伤重楼种子的内种皮，并将划伤内种皮的重楼种子在温度为25°C、光照强度为15001x的条件下放置3小时，有89.5%的重楼种子内种皮产生爆裂，露出大量结构较松散的重楼珠心细胞；
[0019](2)重楼珠心细胞的预培养:取内种皮产生爆裂的重楼种子，放在超净工作台上用0.1%的升汞溶液消毒2分钟，用无菌水冲洗后，用解剖刀切取结构较松散的重楼珠心细胞接入液体培养基B5+赤霉素200mg/L+KTl.0mg/L+IAA 0.5mg/L中进行25天的预培养；
[0020](3)重楼珠心细胞的悬浮培养:选取预培养后处于悬浮培养液中部和下部的重楼珠心细胞和细胞团块，以40g.I/1的接种量转接到B5+6-BA0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+2, 4-D1.0mg/L液体培养基中进行细胞悬浮培养；
[0021](4)细胞的继代培养:在细胞悬浮培养了 40天进行第一次继代培养，以后每隔35天继代一次，每次的接种量为30g.L—1;
[0022](5)细胞增殖生长倍数的计算:取继代培养3代的重楼珠心细胞在3000r/min的离心机上离心5min后，倒掉上清液进行称重，按如下公式计算出重楼珠心细胞的增殖倍数为2.03倍；
[0023]细胞增殖倍数=(收获量鲜重一接种量鲜重)/接种量鲜重；
[0024]上述⑵、(3)、⑷步骤中重楼珠心细胞的液体培养条件均为温度20°C，pH值5.0，无光照，摇床转速为120r.mirT1。
[0025]实施例2
[0026](I)重楼种子的预处理:选取八月下旬采摘的尚未完全成熟的重楼果实，去掉果皮后将带外种皮的重楼种子用浓度为I/?ο4的高锰酸钾溶液浸泡48小时，期间每隔12小时换高锰酸钾溶液一次，取出浸泡后的重楼种子，搓去外种皮后，放入浓度为0.01%的升汞溶液中消毒5分钟，用无菌水冲洗3次后，迅速用已消毒的滤纸吸干内种皮表面的水分，再用小刀划伤重楼种子的内种皮，并将划伤内种皮的重楼种子在温度为27°C、光照强度为18001x的条件下放置4小时，有92%的重楼种子内种皮产生爆裂，露出大量重楼珠心细胞；
[0027](2)重楼珠心细胞的预培养:取内种皮产生爆裂的重楼种子，放在超净工作台上用0.1%的升汞溶液消毒3分钟，用无菌水冲洗5次后，用解剖刀切取结构较松散的重楼珠心细胞接入液体培养基B5+赤霉素400mg/L+KT 2.0mg/L+IAA 1.0mg/L中进行30天的预培养;
[0028](3)重楼珠心细胞的悬浮培养:选取预培养后处于悬浮培养液中部的重楼珠心细胞和细胞小团块，以60g.1/1的接种量转接到B5+6-BA1.0mg/L+NAA 1.5mg/L+2, 4-D 2.0mg/L液体培养基中进行细胞悬浮培养；
[0029](4)细胞的继代培养:在细胞悬浮培养了 50天进行第一次继代培养，以后每隔40天继代一次，每次的接种量为45g.L—1;
[0030](5)细胞增殖生长倍数的计算:取继代培养3代的重楼珠心细胞在3000r/min的离心机上离心5min后，倒掉上清液进行称重，按如下公式计算出重楼珠心细胞的增殖倍数为2.48倍；
[0031]细胞增殖倍数=(收获量鲜重一接种量鲜重)/接种量鲜重；
[0032]上述⑵、(3)、⑷步骤中重楼珠心细胞的液体培养条件均为温度22°C，pH值6.5，无光照，摇床转速为150r.m