专利名称：悬浮培养传代细胞及利用其生产猪瘟疫苗的方法
技术领域：
本发明涉及医药生物领域，具体涉及悬浮培养传代细胞的方法，所述传代细胞包括猪睾丸细胞或猪肾细胞；进一步涉及利用该细胞生产猪瘟疫苗的方法。
背景技术：
体外细胞的培养方法包括贴壁培养和悬浮培养，其中悬浮培养又可分为微载体悬浮培养及全悬浮培养。与贴壁培养相比，悬浮培养具有如下优点(1)可连续扩大生产量；有利于细胞培养基中的营养物质和气体充分接触，而且易于控制培养条件(温度、pH、 氧分压和CO2等)；C3)培养条件稳定，趋于均一，便于进行定量研究；(4)易于在连续密闭的系统中进行，减少了操作步骤和污染的机会；(5)可以长期连续培养，既可节省人力，又使细胞能持续维持在对数生长期；(6)悬浮培养的细胞仍保持原先对病毒的敏感性和生物学特性。而与微载体悬浮培养相比，全悬浮培养有以下优势无需昂贵的微载体，从而有效降低生产成本；可省去微载体培养中附加步骤如消化收获细胞等，从而简化生产过程，缩短生产时间，提高生产效率，并易于进行扩大培养。现有研究已发现影响细胞粘附的一些基因。例如人类siat7e基因被认为在控制细胞贴附程度中起着一定的作用，增加的siat7e基因的表达可减少细胞粘附 (Jaluria P,Betenbaugh M,Konstantopoulos K,Frank B,Shiloach J(2007)Application of microarrays to identify and characterize genes involved in attachment dependence in HeLa cells. Metab Eng 9:241-251·)。猪瘟(HC)是由猪瘟病毒(Hog cholera virus, HCV)引起的猪的一种高度传染性疾病，它流行广泛，发病率、死亡率高，给养猪业造成了严重的经济损失。现有预防和控制猪瘟的最有效的方法是接种猪瘟疫苗现用于猪瘟病毒培养的细胞基质主要有牛睾丸原代细胞(BT细胞)、猪肾细胞(PK 细胞或IBRS-2细胞)、猪睾丸细胞(ST细胞)等。由于我国牛群较普遍存在BVD/MBV病，用牛睾丸细胞原代细胞制苗，易造成细胞外源病毒污染，且产毒滴度不高，批间差异大，给疫苗产量、效力的提高带来困难。而且牛睾丸细胞为原代细胞，细胞的寿命有限，每次制苗需重新获得细胞。而猪肾细胞、猪睾丸细胞为连续传代细胞系，取材容易易于放大进行规模化培养，有逐渐取代牛睾丸细胞生产猪瘟疫苗的趋势。非专利文献1表明H(、ST、MH(细胞对猪瘟病毒敏感，多种猪瘟疫苗株在猪肾细胞或猪睾丸细胞上适应而得到疫苗株。非专利文献1 猪瘟病毒及其疫苗研究进展，中国病毒学，第11卷第3期第201 207 页，1996 年 9 月。但是，现有以猪睾丸细胞或猪肾细胞作为细胞基质的猪瘟疫苗生产工艺均为转瓶贴壁培养或微载体悬浮培养，还未能实现细胞全悬浮培养，在生产成本、生产效率以及满足市场需求方面都具有较大局限性
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中培养猪睾丸细胞或猪肾细胞的方法中存在的问题，提供一种大规模悬浮培养猪睾丸细胞或猪肾细胞的方法。本发明的悬浮培养猪睾丸细胞或猪肾细胞的方法包括如下步骤(1)利用包含能减弱细胞粘附性能基因序列的表达载体稳定转染猪睾丸细胞或猪肾细胞；(2)筛选并分离稳定转染细胞克隆；(3)检测稳定转染细胞克隆中的基因表达；(4)稳定转染细胞克隆的悬浮培养。本发明进一步的目的是提供一种悬浮培养猪睾丸细胞或猪肾细胞以生产疫苗的方法。
图1表示实施例1中稳定转染猪睾丸细胞克隆的RT-PCR检测图。其中，GAPDH和 18s RNA为内参基因，对照为未经转染的猪睾丸细胞。A、B和C分别为分离到的稳定转染细胞克隆。RT-PCR结果显示，A、B和C三个稳定转染细胞克隆中均有siat7e基因的表达。图2表示实施例1中稳定转染猪睾丸细胞克隆的细胞生长曲线。结果显示稳定转染猪睾丸细胞克隆的生长特性正常。
具体实施例方式通过对猪睾丸细胞或猪肾细胞基因组进行基因改造，获得适于悬浮培养的猪睾丸细胞或猪肾细胞，结合细胞培养工艺，实现通过大规模悬浮培养猪睾丸细胞或猪肾细胞以生产疫苗。本发明的悬浮培养猪睾丸细胞或猪肾细胞的方法包括如下步骤(1)利用包含能减弱细胞粘附性能基因序列的表达载体稳定转染猪睾丸细胞或猪肾细胞；(2)筛选并分离稳定转染细胞克隆；(3)检测稳定转染细胞克隆中的基因表达；(4)稳定转染细胞克隆的悬浮培养。在所述的步骤(1)中，所述的基因序列为siat7e基因；载体可以是本技术领域内常规的表达载体，例如质粒。所述的表达载体既可以根据本领域的常规技术手段自行制备， 还可以购买获得。将DNA导入真核细胞的方式有两种瞬时转染与稳定转染。在瞬时转染中重组DNA 导入感染性强的细胞系以获得目的基因暂时但高水平的表达。转染的DNA不必整合进宿主染色体，当有大量样品需要在短时间内分析时，尤其是在转染后的1到4天内收获细胞，所得的溶解产物用于检测目的基因的表达时，可以采用瞬时转染的方式。瞬时转染中DNA的暂时表达即为瞬时表达。稳定或持久的转染用于建立克隆的细胞系，这种细胞系中转染的目的基因整合到染色体DNA中并指导适量目的蛋白的合成。一般来说(由细胞类型决定)，形成稳定转染细胞的效率比瞬时转染的效率低1到2个数量级。利用可选择的遗传标记物有利于在非转染细胞的背景中分离出稀少的稳定转染体。稳定转染中整合基因的表达即为稳定表达。将基因导入真核细胞的方法有许多种，包括生化方法转染，物理方法转染以及病毒介导的转化等。具体而言包括DEAE (二乙氨乙基)-葡聚糖介导法，磷酸钙介导法，脂质体介导法，聚阳离子-DMSO转染法，生物粒子介导法，电穿孔转染法，显微注射法，病毒介导法等，优选采用脂质体介导法。所述的步骤(1)进一步包括如下步骤(a)用全长人类siat7e基因表达载体转染大肠杆菌DH5ci感受态细胞，纯化质粒； 纯化质粒的方法可以是本领域常规的技术手段，可以采取试剂盒或非试剂盒的方法；(b)转接1 X 105-5X 105猪睾丸细胞或猪肾细胞于细胞培养板中，孵育细胞 20-Mh，约40-90%汇合度；所述猪睾丸细胞或猪肾细胞可以是例如商品名为ATCC，Cat. No. CCL-34的市售商品；(c)取1-10 μ g的质粒DNA稀释于250 μ L转染培养基(如Opti-MEM培养基)中， 混勻；2-50 μ L脂质体稀释于250 μ L转染培养基中，轻轻混勻，静置5-15min ；(d)将上述制备的溶液混合，室温静置10-20min ；将步骤(b)中所述的细胞培养板中各个孔换成无血清无抗生素的0.5-2mL转染培养基；将上述步骤(c)中的混合物转入步骤(b)所述的孵育细胞的细胞培养板孔中，轻轻前后晃动混勻；(e)37°C培养，l_24h后，将各个孔中的培养基换成完全培养基于37°C培养；(f) 24h后，将细胞从细胞培养板中传至细胞培养瓶中。在所述步骤O)中，由于摄取、整合和表达外源DNA是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。一般情况下，这种表型由共同转染的编码抗生素抗性的基因提供。表达一个DNA分子上的基因标记的细胞经常也表达另一 DNA分子携带的基因标记。因此，稳定表达选择性标记(如抗生素抗性)的细胞很可能也表达载体DNA上的其他DNA序列。这种物理上不相连的基因被整合到同一转化细胞内表达的现象叫做共转化。现有常用筛选标记包括氨基葡萄糖苷磷酸转移酶(对G418或新霉素有抗性)、潮霉素-B磷酸转移酶(对潮霉素-B有抗性)、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(对霉酚酸、氨喋呤有抗性)与嘌呤霉素-N-乙酰基转移酶(对嘌呤霉素有抗性)。本发明优选采用G418加压筛选。所述的步骤( 进一步包括如下步骤细胞转染Μ-4 !后，将细胞培养瓶中的完全培养基更换为选择性培养基，以后每 2-4天更换一次培养基，持续培养14-21天，观察是否形成克隆，分离、扩增独立细胞克隆。 所述筛选的标记可以是本领域技术人员所熟知的筛选标记，包括但不限于G418筛选标记， 所述的选择性培养基优选为G418选择性培养基。利用选择性培养基促进抗性细胞生长，无抗性细胞即死亡。所述的步骤( 进一步包括如下步骤待形成克隆后，挑取克隆进行鉴定，所述鉴定方法主要为对获得的克隆在插入基因的RNA水平和蛋白水平表达的检测，其中RNA水平的检测方法主要有RT-PCR(反转录聚合酶链式扩增反应)、荧光定量PCR (荧光定量聚合酶链式扩增反应),Northern杂交等。蛋白水平的检测方法主要有=Western杂交、ELLSA (酶联免疫吸附试验)、免疫荧光检测、免疫组织化学技术检测等。在所述步骤(4)中，将筛选获得并经过检测证明人类siat7e基因稳定表达的细胞
6克隆在细胞培养瓶中(方瓶或摇瓶)驯化至悬浮培养。将驯化悬浮培养细胞取一部分冻存， 另一部分在细胞培养瓶中继续培养。当细胞在细胞培养瓶中生长形态正常、活力大于90% 时接种至摇瓶中。在摇瓶及生物反应器中扩增培养细胞，最后按适宜细胞接种密度接种至生产规模的生物反应器中，调节生物反应器的温度、培养液PH值、溶氧浓度等参数，使细胞生长于最适宜环境进行细胞培养。所述的步骤的悬浮培养的条件为容器悬浮培养容器，优选为摇瓶(shake bottle)、搅拌瓶(Spinner Bottle)、生物反应器等；细胞接种密度1X 105-1 X 106，优选 2X105-6X IO5 ；细胞培养温度33-38°C，优选36-37°C ；pH 值6. 0-7. 5，优选 6. 8-7. 2 ；溶氧浓度20%-100%，优选 30% -80 %。细胞培养方式可为批培养、流加培养与灌注培养。所述生物反应器包括但不限于搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、固定床和流化床生物反应器、中空纤维反应器、膜生物反应器、一次性生物反应器等。在本发明的各种实施方式中，所选用的细胞培养基并不是关键的，原则上所有能够用于猪睾丸细胞或猪肾细胞悬浮培养所用的细胞培养基都可以使用，优选为无血清细胞培养基。很多培养基都已经是商业化产品，可以通过商业途径获得。本发明还涉及悬浮培养猪睾丸细胞或猪肾细胞以生产猪瘟疫苗的方法。大规模悬浮培养稳定转染的猪睾丸细胞或猪肾细胞，待猪睾丸细胞或猪肾细胞的细胞密度增殖至ι χ IO6细胞/mL以上时，将细胞培养液更换为维持培养液，用病毒悬液接种猪睾丸细胞或猪肾细胞。其条件如下用病毒感染增殖的猪睾丸细胞或猪肾细胞(细胞密度为至少约IXlO6)病毒感染复数(m.ο. i) 0. 0001-10，优选 0. 001-5，更优选 0. 01-1 ；病毒培养温度33-38 °C，优选36-37 °C ；pH 6. 5-8. 0，优选 7. 2-7. 8 ；溶氧20%-100%，优选30%-80%。可采用批培养、流加培养与灌注培养方式培养细胞繁殖病毒，并可适时一次性或连续收获细胞培养毒液。优选流加培养或灌注培养。即在病毒感染猪睾丸细胞或猪肾细胞一段时间后，比如6-18hr后，可以采用流加或灌注的连续培养方式往生物反应器中添加病毒维持液，不断收获上清病毒液。收获的病毒液置于_15°C以下保存。可以采用各种方法进一步制备疫苗，例如收获病毒液放置于2-8°C中，并保存在-20°C，冻融1次，过滤、灭活、乳化后制备疫苗。在本文中，术语“病毒感染复数MOI (multiplicity of infection) ”是指每一个细胞上所感染病毒的数量。MOI =有感染力的病毒量/细胞总量。在本发明的各种实施方式中，所选用的病毒株为生产或研制所述疫苗的常用病毒株，可由疫苗生产厂家或研究机构获得。本发明实现了悬浮培养猪睾丸细胞或猪肾细胞并利用该细胞生产猪瘟疫苗，与现有贴壁培养细胞或微载体悬浮培养生产工艺相比具有如下有益效果
(1)实现猪睾丸细胞及猪肾细胞的全悬浮培养，无需购置微载体，极大降低了猪瘟疫苗生产成本；(2)可省去微载体悬浮培养中附加步骤如消化收获细胞等，从而简化生产过程，缩短生产时间，提高生产效率；(3)在生物反应器微载体培养工艺中，微载体放大工艺具有较大技术难度，且增加了生产工艺的复杂性。而实现猪睾丸细胞及猪肾细胞悬浮培养，则细胞的放大培养工艺较为简单，易于实现且极大简化了生产工艺。(4)生产工艺改进可满足猪瘟疫苗不断增长的市场需求。实施例以下通过实施例和对比例对本发明作进一步具体的说明，但不作为对本发明的限制。实施例1利用基因改造悬浮培养ST细胞1)利用含有siat7e基因的表达载体稳定转染ST细胞；(1)用全长人类 siat7e 基因表达载体(Cat. No. EX-V1581-M03，Genecopoeia)转染大肠杆菌DH5ci感受态细胞。利用无内毒素质粒抽提试剂盒01IAGEN)提取质粒DNA。(2)第一天转接5X IO5ST细胞(中国兽医药品监察所提供)于6孔板中，孵育 24h细胞约90%汇合度。(3)第二天，取10 μ g的质粒DNA稀释于250 μ L Opti-MEM培养基中，混勻；50 μ L 脂质体稀释于250yL Opti-MEM培养基中，轻轻混勻，静置15min。(4)将上述制备的溶液混合，室温静置20min ；将步骤O)中所述的6孔板中各个孔换成无血清无抗生素的2mL Opti-MEM培养基；将上述步骤(3)中的混合物500 μ L转入 6孔板孔中，轻轻前后晃动混勻。 37°C培养24h后将各个孔中的培养基换成完全培养基DMEM(含10%小牛血清)，37°C于CO2培养箱培养。(6) 24h后，将其从6孔板中传至细胞培养瓶中。2)G418加压筛选以获得稳定表达细胞株；48h后，将细胞培养瓶中的完全培养基更换为G418选择性培养基，以后每4天换一次液，持续培养14天，每天观察，看是否形成克隆。当有抗性克隆出现后，按照单细胞分离培养方法(鄂征，组织培养和分子细胞学技术，北京出版社.100 107，2001年1月)单细胞分离培养得到5株单克隆细胞株，分别扩大培养。3)验证基因的稳定转染；利用RNA提取试剂盒(Qiagen公司)提取获得单克隆细胞及对照ST细胞的总RNA。 根据siat7e基因序列设计引物如下正向弓I物5，-ttactcgccacaagatgctg-3，反向弓I物5，-gcaccatgccataaacattg-3，利用superscrpt反转录-聚合酶式反应试剂盒(invitrogen公司)进行反转录-聚合酶式反应检验所获单克隆细胞中siat7e基因的表达。证明所获单克隆细胞中 siat7e基因均有表达(如图1所示)。将筛选获得并经过检测证明人类siat7e基因稳定表达的细胞克隆在细胞培养瓶中(方瓶或摇瓶)驯化悬浮培养。绘制细胞生长曲线细胞可稳定悬浮培养后，取生长状态良好的细胞，制成细胞悬液；以4X IO5细胞/mL将细胞接种于摇瓶中置于37°C培养箱进行培养，每天取出细胞进行计数，计算均值。以培养时间为横轴，细胞密度为纵轴(对数)，绘制细胞生长曲线(如图2 所示)。实施例2-4除了按照表1改变实验条件以外，进行与实施例1相同的操作。表 权利要求
1.一种悬浮培养猪睾丸细胞或猪肾细胞的方法，其包括如下步骤(1)利用包含能减弱细胞粘附性能基因序列的表达载体稳定转染猪睾丸细胞或猪肾细胞；(2)筛选并分离稳定转染细胞克隆；(3)检测稳定转染细胞克隆中的基因表达；(4)稳定转染细胞克隆的悬浮培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(1)中利用含有siat7e基因的表达载体稳定转染猪睾丸细胞或猪肾细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，所述转染的方法包括二乙氨乙基-葡聚糖介导法，磷酸钙介导法，脂质体介导法，聚阳离子-DMSO转染法，生物粒子介导法，电穿孔转染法，显微注射法，病毒介导法。
4.根据权利要求3所述的方法，所述转染的方法为脂质体介导法。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的步骤( 包括如下步骤细胞转染对-4他后，细胞培养瓶中的完全培养基更换为选择性培养基，以后每2-4天更换一次培养基，持续培养14-21天，观察是否形成细胞克隆，分离、扩增独立细胞克隆。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的步骤C3)包括如下步骤利用RNA水平检测方法或蛋白水平检测方法检测稳定转染细胞克隆中的基因表达，其中，所述的RNA水平检测方法包括反转录聚合酶链式扩增反应、荧光定量聚合酶链式扩增反应、Northern杂交； 所述的蛋白水平检测方法包括Western杂交、酶联免疫吸附试验、免疫荧光检测、免疫组织化学技术检测。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的步骤的悬浮培养的条件为 容器悬浮培养容器；细胞接种密度1 X 105-1 X 106; 细胞培养温度33-38°C ； pH 值6. 0-7. 5 ； 溶氧20% -100%。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述的悬浮培养容器为摇瓶、生物反应器；所述细胞接种密度为2X 105-6X IO5 ；所述细胞培养温度为36-37°C;所述pH为6. 8-7. 2 ；所述溶氧为 30% -80%。
9.一种采用权利要求1-8中任意一项所述的方法得到的猪睾丸细胞或猪肾细胞生产猪瘟疫苗的方法。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，生产疫苗的条件为 用病毒感染猪睾丸细胞或猪肾细胞；病毒感染复数0. 001-5 ； 病毒培养温度33-38 °C ； pH 值6. 5-8. 0 ； 溶氧20% -100%。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述猪睾丸细胞或猪肾细胞的培养密度至少为1 X IO6 ；所述病毒感染复数为0. 01-1 ；所述病毒培养温度为36-37°C ；所述pH为7. 2-7. 8 ；所述溶氧为30% -80%。
全文摘要
本发明提供一种悬浮培养传代细胞的方法，其包括如下步骤(1)利用包含能减弱细胞粘附性能基因序列的表达载体稳定转染猪睾丸细胞或猪肾细胞；(2)筛选并分离稳定转染细胞克隆；(3)检测稳定转染细胞克隆中的基因表达；(4)稳定转染细胞克隆的悬浮培养。本发明进一步涉及利用所述悬浮培养的猪睾丸细胞或猪肾细胞生产猪瘟疫苗的方法。
文档编号C12N5/10GK102453698SQ20101051755
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月18日 优先权日2010年10月18日
发明者张韧, 王建超, 陈文庆 申请人:北京清大天一科技有限公司