一种白背三七细胞悬浮培养体系的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物技术中植物细胞培养的方法，具体地说，涉及一种白背三七细胞悬浮培养体系的构建方法。
【背景技术】
[0002]白背三七(divaricata (L.)DC.),又名白子菜、白红菜、厚面皮等,为菊科三七属植物。主要分布于两广、福建一带，喜生于潮湿的阴地上。民间以白背三七地上部分作为食药两用，广泛用于高血压病、高血脂血症及糖尿病等治疗，具有较高的药用价值，市场前景广阔。
[0003]白背三七植物主要含有生物碱类，黄酮类，三萜类及一些长链脂肪族类化合物，具有一定的抗癌作用。由于白背三七全株含有致肝毒性吡咯里西啶生物碱(HPAs)及其氮氧化物而使其广泛应用受到一定制药。因此应用植物细胞工程技术减少甚至脱除HPAs并生产有用的次生代谢产物并生产有用的次生代谢产物具有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种白背三七细胞悬浮培养体系的构建方法，本发明以白背三七幼叶为外植体，通过白背三七愈伤组织诱导、胚性愈伤筛选及增殖等步骤建立了白背三七细胞悬浮培养体系，为通过组织培养技术脱除白背三七吡咯里西啶生物碱(HPAs)并积累有效成分提供技术支持。进而实现了本发明的目的。
[0005]本发明的一种白背三七细胞悬浮培养体系的构建方法，包括以下的工艺步骤: (I)外植体消毒:选取白背三七嫩叶用清水洗净，在超净工作台中用2%?5%的洗洁精溶液漂洗I?5min,无菌水冲洗3?5次后用75%?80%乙醇溶液浸泡10?30s, 0.1%?0.2%升萊溶液消毒5?1min, 2%?4%次氯酸钠溶液消毒10?20min,无菌水冲洗4?6次，然后接种到诱导培养基上进行诱导培养。接种后先在25?28°C条件下全暗培养20?30天，然后置于每天光照12?15小时，光照强度为1500?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养起直至形成愈伤组织。
[0006](2)增殖培养:挑选状态较为一致的愈伤组织接种到增殖培养基上进行增殖培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养7?14天，然后置于每天光照12?15小时，光照强度为1500?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养，15?20天转接一次。
[0007](3)液体培养:选取疏松易碎、有金属光泽、生长旺盛的胚性愈伤组织用镊子夹碎后接种于液体培养基中在转速为100?150r/min，光照强度为800?12001x，培养温度为25?28°C的条件下进行振荡培养。
[0008](4)悬浮细胞系建立:用40?50目的过滤筛对悬浮初期培养物进行过滤，以除去大细胞团，保留分散程度好的小细胞及单细胞，按1:3?1:2的体积转入新鲜培养液，悬浮培养周期为6?9天，多次继代建立悬浮细胞系。
[0009]上述步骤(I)所述的诱导培养基为MS+1?4mg/L ΚΤ+0.2?0.8mg/L NAA+0.5?2.0mg/L 6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼脂，pH 值为 5.4 ?5.8。
[0010]上述步骤(2)所述的增殖培养基为:B5+0.1?0.5mg/L NAA+1?3.0mg/L6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼脂，pH 值为 5.4 ?5.8。
[0011]上述步骤(3)所述的液体培养基为:B5+0.1?0.3mg/L NAA+0.5?1.5mg/L6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖，pH 值为 5.4 ?5.8。
[0012]上述步骤(4)所述的条件为:接种密度为70?90g/L (鲜质量)，装液量为30?40%。
[0013]与现有技术相比本发明的优点是:本发明通过植物细胞离体培养技术手段积累并生产有效成分的方法。以白背三七幼叶为外植体，通过白背三七愈伤组织诱导、胚性愈伤筛选及增殖等步骤建立了白背三七细胞悬浮培养体系，为通过组织培养技术脱除白背三七吡咯里西啶生物碱(HPAs)并积累有效成分提供技术支持。
【具体实施方式】
[0014]以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0015]实施例1:
(I)外植体消毒:选取白背三七嫩叶用清水洗净，在超净工作台中用2%的洗洁精溶液漂洗Imin,无菌水冲洗3次后用75%乙醇溶液浸泡1s, 0.1%升萊溶液消毒5min,2%次氯酸钠溶液消毒lOmin，无菌水冲洗4次，然后接种到诱导培养基上进行诱导培养。接种后先在25°C条件下全暗培养20天，然后置于每天光照12小时，光照强度为15001x，培养温度为25°C的条件下培养31天即形成愈伤组织，诱导率85.3%。所述诱导培养基为MS+lmg/LKT+0.2mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+2.5% 蔗糖 +0.35% 琼脂，pH 值为 5.8。
[0016](2)增殖培养:挑选状态较为一致的愈伤组织接种到增殖培养基上进行增殖培养，接种后先在25°C条件下全暗培养7天，然后置于每天光照12小时，光照强度为15001x，培养温度为25°C的条件下培养，15天转接一次。所述增殖培养基为B5+0.lmg/L NAA+lmg/L6-BA+2.5% 蔗糖 +0.35% 琼脂，pH 值为 5.8。
[0017](3)液体培养:选取疏松易碎、有金属光泽、生长旺盛的胚性愈伤组织用镊子夹碎后接种于液体培养基中在转速为100r/min，光照强度为800x，培养温度为25°C的条件下进行振荡培养。所述的液体培养基为B5+0.lmg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+2.5%蔗糖，pH值为5.8。
[0018](4)悬浮细胞系建立:用40目的过滤筛对悬浮初期培养物进行过滤，以除去大细胞团，保留分散程度好的小细胞及单细胞，按1:3的体积、接种密度为70g/L (鲜质量)，装液量为30%转入新鲜培养液，悬浮培养周期为6天，多次继代即可建立悬浮细胞系。
[0019]实施例2:
(I)外植体消毒:选取白背三七嫩叶用清水洗净，在超净工作台中用3%的洗洁精溶液漂洗5min，无菌水冲洗3次后用78%乙醇溶液浸泡10s，0.15%升汞溶液消毒5min，3%次氯酸钠溶液消毒15min，无菌水冲洗4次，然后接种到诱导培养基上进行诱导培养。接种后先在25°C条件下全暗培养20天，然后置于每天光照14小时，光照强度为20001χ，培养温度为25°C的条件下培养28天即形成愈伤组织，诱导率89.8%。所述诱导培养基为MS+1.5mg/L KT+0.5mg/L NAA+0.7mg/L 6-BA+2.5% 蔗糖 +0.35% 琼脂，pH 值为 5.8。
[0020](2)增殖培养:挑选状态较为一致的愈伤组织接种到增殖培养基上进行增殖培养，接种后先在25°C条件下全暗培养10天，然后置于每天光照12小时，光照强度为15001x，培养温度为25°C的条件下培养，18天转接一次。所述增殖培养基为B5+0.4mg/L NAA+1.2mg/L 6-BA+2.5% 蔗糖 +0.35% 琼脂，pH 值为 5.8。
[0021](3)液体培养:选取疏松易碎、有金属光泽、生长旺盛的胚性愈伤组织用镊子夹碎后接种于液体培养基中在转速为130r/min，光照强度为ΙΟΟΟχ，培养温度为25°C的条件下进行振荡培养。所述的液体培养基为Β5+0.3mg/L NAA+0.9mg/L 6-BA+3.5%蔗糖，pH值为5.8ο
[0022](4)悬浮细胞系建立:用50目的过滤筛对悬浮初期培养物进行过滤，以除去大细胞团，保留分散程度好的小细胞及单细胞，按1:2的体积、接种密度为80g/L (鲜质量)，装液量为35%转入新鲜培养液，悬浮培养周期为8天，多次继代即可建立悬浮细胞系。
【主权项】
1.一种白背三七细胞悬浮培养体系的构建方法，其特征在于包括以下工艺步骤: (1)外植体消毒:选取白背三七嫩叶用清水洗净，在工作台中用2%?5%的洗洁精溶液漂洗I?5min，无菌水冲洗3?5次后用75%?80%乙醇溶液浸泡10?30s，0.1%?0.2%升萊溶液消毒5?1min, 2%?4%次氯酸钠溶液消毒10?20min,无菌水冲洗4?6次，然后接种到诱导培养基上进行诱导培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养20?30天，然后置于每天光照12?15小时，光照强度为1500?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养起直至形成愈伤组织； (2)增殖培养:挑选状态较为一致的愈伤组织接种到增殖培养基上进行增殖培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养7?14天，然后置于每天光照12?15小时，光照强度为1500?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养，15?20天转接一次； (3)液体培养:选取疏松易碎、有金属光泽、生长旺盛的胚性愈伤组织用镊子夹碎后接种于液体培养基中在转速为100?150r/min，光照强度为800?12001x，培养温度为25?28°C的条件下进行振荡培养； (4)悬浮细胞系建立:用40?50目的过滤筛对悬浮初期培养物进行过滤，以除去大细胞团，保留分散程度好的小细胞及单细胞，按1:3?1:2的体积转入新鲜培养液，悬浮培养周期为6?9天，多次继代建立悬浮细胞系。
2.根据权利要求1所述的一种白背三七细胞悬浮培养体系的构建方法，其特征在于步骤(I)所述的诱导培养基为MS+1?4mg/L ΚΤ+0.2?0.8mg/L ΝΑΑ+0.5?2.0mg/L6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼脂，pH 值为 5.4 ?5.8。
3.根据权利要求1所述的一种白背三七细胞悬浮培养体系的构建方法，其特征在于步骤(2)所述的增殖培养基为:B5+0.1?0.5mg/L NAA+1?3.0mg/L 6-BA+2.5%?3.5%蔗糖+0.35% ?0.5% 琼脂，pH 值为 5.4 ?5.8。
4.根据权利要求1所述的一种白背三七细胞悬浮培养体系的构建方法，其特征在于步骤(3)所述的液体培养基为:B5+0.1 ?0.3mg/L ΝΑΑ+0.5 ?1.5mg/L 6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖，pH值为5.4?5.8。
5.根据权利要求1所述的一种白背三七细胞悬浮培养体系的构建方法，其特征在于步骤(4)所述的条件为:接种密度为70?90g/L，装液量为30?40%。
【专利摘要】本发明公开了一种白背三七细胞悬浮培养体系的构建方法，涉及白背三七（Gynura divaricata(L.)DC.）通过植物细胞离体培养技术手段积累并生产有效成分的方法。本发明以白背三七幼叶为外植体，通过白背三七愈伤组织诱导、胚性愈伤筛选及增殖等步骤建立了白背三七细胞悬浮培养体系，为通过组织培养技术脱除白背三七吡咯里西啶生物碱（HPAs）并积累有效成分提供技术支持。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104686340
【申请号】CN201510085930
【发明人】杨业容
【申请人】杨业容
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年2月22日