专利名称：通过对悬浮的动物细胞进行灌流式培养来生产生物物质的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产生物物质的方法，所述方法通过在不含血清的细胞培养基中对悬浮的动物细胞进行灌流式培养来进行，其中，通过过滤从细胞中分离出生物物质。
本领域中已知有类似的方法，例如Tokashiki et al.1993.Cytotechnology，vol.13149-159所著的关于灌流式培养的综述。在通过过滤从细胞中分离出生物物质的灌流式培养中，优选的过滤是这样的1)细胞被过滤器保留，同时2)包含生物物质的液体通过过滤器。对过滤器开展这两项任务的效果的量度标准是细胞培养物中平均的细胞总浓度和通过过滤器的总体积的乘积(过滤器性能)。过滤器性能与生物物质的产量是成比例的。
但是，通过过滤从细胞中分离出生物物质的灌流式培养的不好之处在于，该过程中会发生过滤器堵塞。过滤器堵塞限制了能通过过滤器的体积总量，因而限制了过滤器性能，也就还限制了生物物质的产量。
本发明的目的是提供一种生产生物物质的方法，所述方法通过在不含血清的细胞培养基中对悬浮的动物细胞进行灌流式培养来进行，其中，通过过滤从细胞中分离出生物物质，其中过滤器堵塞减少(即，过滤器性能提高)。
该目的是通过本发明达成的，通过在细胞培养基中存在至少为0.001w/w％的一定量的非离子表面活性剂来实现。
非离子表面活性剂在用于哺乳动物细胞的不含血清的细胞培养基的用途可从US 5,372,943中已知，但是，在US 5,372,943中，该用途用于在细胞培养基中提供以生物可利用形式存在的必要脂类。本申请人吃惊地发现，在用于哺乳动物细胞的不含血清的培养基中使用非离子表面活性剂还会减少过滤器堵塞。
原则上，用于不含血清的培养基中的非离子表面活性剂的量的上限并不是关键的。但是，其可以例如被非离子表面活性剂的毒性水平和/或溶解性所限制。上限进一步地可取决于方法中所用的条件，本领域的技术人员可以很容易地确定该上限。通常，细胞培养基中存在的非离子表面活性剂的量的上限是1w/w％。
在本发明的方法中，非离子表面活性剂优选是脂肪酸酯，例如脂肪酸的甘油酯或双甘油酯，或如结构式1所示的聚氧化烯山梨聚糖脂肪酸酯(polyoxyalkylene sorbitan fatty acid ester)， 其中，R1、R2、R3和R4每个都独立代表H或脂肪酸残基，即脂肪酸和醇缩合后的残留部分，前提条件是R1至R4中的至少一个是脂肪酸残基，其中A代表乙烯或丙烯基团，n、o、p和q每个都独立代表0至100之间的值，其中优选地，n、o、p和q的总和为50至300之间。
优选地，脂肪酸残基含有10-20个C原子。脂肪酸的例子包括癸酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、塔罗油酸等。
结构式1的商业可获得的化合物的例子包括TweenTM化合物，例如TweenTM-80、TweenTM-21、TweenTM-40、TweenTM-60、TweenTM-20、TweenTM-61、TweenTM-65、TweenTM-81、TweenTM-85。当然，在本发明的方法中使用不同非离子表面活性剂的组合也是可能的。
在本发明的方法中，脂肪酸酯是特别有利的，因为这些酯的少量存在对生物物质的医药用途不会有阻碍。
优选地，细胞培养基中非离子表面活性剂的量为至少0.005w/w％，更优选地，至少0.01w/w％，最优选地，至少0.02w/w％。
可用于本发明方法中的动物细胞是，例如哺乳动物细胞，例如CHO(Chinese Hamster Ovary，中国仓鼠卵巢)细胞、杂交瘤、BHK(BabyHamster Kidney，幼仓鼠肾)细胞、骨髓瘤细胞和人类细胞，例如HEK-293细胞和人淋巴母细胞。
原则上，所有适合保留细胞的过滤器都可以用来进行过滤。此类过滤器的例子是静止过滤器(static filter)，例如中空纤维过滤器或切向流过滤器或旋转式过滤器，例如旋转过滤器。优选地，如果生物物质是生物药物产品，则使用内部过滤器，因为使用外部过滤器需要额外的认证，以使对生物药物产品的生产过程合乎GMP(优良生产操作)标准。合适的内部过滤器的例子是内部旋转过滤器。
最合适的过滤器孔径取决于要被保留下来的细胞的细胞直径，其可被本领域的技术人员很容易地确定。优选地，孔径被选择为筛网上的孔的大小接近于悬浮的细胞的直径，确保细胞的高保留率而细胞残骸能通过过滤器。优选地，孔径在500×3000-50×300之间。
本发明原则上可用于适合培养动物细胞的任何类型的细胞培养基。选择细胞培养基和细胞培养条件的原则都是公知的，例如Freshney，R.I.Culture of animal cells(a manual of basic techniques)，4th edition 2000，Wiley-Liss的第8和9章以及Doyle，A.，Griffiths，J.B.，Newell，D.G.Cell&TissuecultureLaboratory Procedures 1993，John Wiley&Sons中所提供的。
对生物药物产品进行生产时，不含血清的培养基相对含有血清源的培养基是优选的，因为血清源的培养基通常是被病毒污染的，存在朊病毒感染的风险，可能对生物药物产品的下游加工(即，从细胞培养基中纯化出生物药物产品来)造成大的阻碍。因为来自哺乳动物源的化合物也存在感染风险，优选地，细胞培养基不仅仅不含血清，还不含哺乳动物源。更优选地，细胞培养基不仅不含哺乳动物源，而且还不含动物源。
细胞培养基的pH、温度、溶解氧浓度和渗量(osmolarity)原则上并不是很关键的，其取决于所选用的细胞的种类。优选地，pH、温度、溶解氧浓度和渗量被选为最适于细胞生长和繁殖的。本领域的技术人员知道怎么样找到用于灌流式培养的最佳pH、温度、溶解氧浓度和渗量。通常，最佳pH在6.6至7.6之间，最佳温度在30至39℃之间，最佳渗量在260至400mOsm之间，细胞培养基中的溶解氧浓度在5至95％空气饱和度之间。
适于通过灌流式培养由动物细胞生产的生物物质原则上是所有可由动物细胞生产的生物物质，例如，治疗和诊断用的蛋白质，例如单克隆抗体、生长因子和酶，DNA，例如可在基因疗法中使用的，疫苗，激素等。优选地，根据本发明的方法用于生产生物药物产品，其是具有医药用途的生物物质。生物药物产品的例子是以下这些(括号内是相关生物药物产品的示例性商标名称)替特普酶Tenecteplase(TN KaseTM)、(重组)抗血友病因子(ReFactoTM)、淋巴母细胞干扰素α-n1(WellferonTM)、(重组)凝血因子(NovoSevenTM)、依那西普Etanercept(EnbrelTM)、曲妥珠单抗Trastuzumab(HerceptinTM)、英利昔单抗Infliximab(RemicadeTM)、巴利昔单抗Basiliximab(SimulectTM)、达昔单抗Daclizumab(ZenapaTM)、(重组)凝血因子IX(BenefixTM)、促红细胞生成素alpha(Epogen)、G-CSF(NeupogenFilgrastim)、干扰素alpha-2b(Infergen)、重组胰岛素(Humulin)、干扰素beta 1a(Avonex)、因子VIII(KoGENate)、葡糖脑苷脂酶(CerezymeTM)、干扰素beta 1b(Betaseron)、TNF alpha受体(Enbrel)、卵泡刺激素(Gonal-F)、阿昔单抗Mab abcixmab(Synagis，ReoPro)、Mab ritiximab(Rituxan)、组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(Activase，Actilyase)、人生长激素(Protropin，Norditropin，GenoTropinTM)。可能具有医药应用的DNA的例子是基因治疗用的质粒DNA。目前正在临床试验中对一些基因治疗用的DNA的医药应用进行试验。疫苗的例子是活的、口服的、四价轮状病毒疫苗(RotaShieldTM)、狂犬病疫苗(RanAvertTM)、肝炎B疫苗(RECOMBIVAX HB，Engerix)和灭活肝炎A疫苗(VAQTATM)。
在所谓的下游加工中，可对通过过滤器的生物物质进行进一步的纯化。下游加工通常包含若干纯化步骤，其组合方式和顺序可以多种多样。下游加工中纯化步骤的例子是分离步骤(例如，通过亲和色谱和/或离子交换色谱)、生物物质的浓缩步骤(例如，通过超滤或渗滤(diafiltration))、交换缓冲液的步骤和/或去除或灭活病毒的步骤(例如，通过过滤灭病毒、改变pH或溶剂的去垢剂处理)。
下述实施例用于对本发明进行阐述，但并非加以限制。
实施例1PFU-83杂交瘤细胞是大鼠/小鼠异源杂交瘤细胞，其产生对抗促肾上腺皮质激素释放因子的大鼠IgG(J.W.A.M.van Oers et al.1989，Endocrinology，124，pp1239-1246)。PFU-83杂交瘤细胞于37℃下被培养于最少限度的不含哺乳动物源的培养基中。所用的最少限度的不含哺乳动物源的培养基是3∶1 DMEM/Ham’s F12培养基，其中含有抗坏血酸(5mg/l)、重组人胰岛素(5mg/l)、谷胱甘肽(1mg/l)、PluronicTMF68(500mg/l)、以Na2SeO3形式存在的硒(15μg/l)、碳酸氢钠(3g/l)、乙醇胺(7μg/l)，添加有谷氨酰胺(glutamin)(终浓度为584.5mg/l)、丙酮酸钠(终浓度为110mg/l)和转铁蛋白(5mg/l)，渗量为320mOsm。pH被调为7.0，溶解氧浓度被设为30％空气饱和度。在7l的Applikon发酵罐中对培养物进行处理，工作体积设为4l，其中使用孔径为325×2300的旋转过滤器，存在有不同浓度的Tween-80(0、15mg/l和50mg/l；相应于大约0、0.015和0.050w/w％)。存活细胞浓度在4至5日后达到大约5×106。
所有不同的批次细胞保留率都为100％。观察达到过滤器被完全堵塞的时间(当旋转过滤器被注满淹没时的时间点)，计算旋转过滤器性能。旋转过滤器性能被定义为通过旋转过滤器的总体积和发酵罐中平均的细胞总浓度的乘积。用Fuchs-Rosenthal血球计数器和用于对死细胞进行染色的台盼蓝(trypan-blue)拒染法，在光学显微镜下计算发酵罐运行期间取得的细胞培养物样品中存活和死亡细胞的总数，由此确定发酵罐中的细胞浓度。本实验的结果显示于下表1中。从表1可见，加入Tween-80后，达到堵塞的时间，以及旋转过滤器性能都增加了。
表权利要求
1.一种生产生物物质的方法，所述方法通过在不含血清的细胞培养基中对悬浮的动物细胞进行灌流式培养来进行，其中，通过过滤从细胞中分离所述的生物物质，所述方法的特征在于，所述细胞培养基中存在有至少0.001w/w％的如结构式1所示的聚氧化烯山梨聚糖脂肪酸酯， 其中，R1、R2、R3和R4每个都独立代表H或脂肪酸残基，即脂肪酸和醇缩合后的残留部分，前提条件是R1至R4中的至少一个是脂肪酸残基，其中A代表乙烯或丙烯基团，n、o、p和q每个都独立代表0至100之间的值。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，结构式1中，n、o、p和q的总和在50至300之间。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，细胞培养基中存在至少0.01w/w％的如结构式1所示的化合物。
4.如权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于，所述动物细胞是哺乳动物细胞。
5.如权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于，所述如结构式1所述的化合物是TweenTM化合物。
6.如权利要求1-5中任意一项所述的方法，其特征在于，所述的过滤是用内部过滤器来进行的。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述内部过滤器是旋转过滤器。
8.如权利要求1-7中任意一项所述的方法，其特征在于，所述生物物质是生物药物产品。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述不含血清的细胞培养基也是不含哺乳动物源的。
10.如权利要求1-9中任意一项所述的方法，其特征在于，所述生物物质通过下游加工被进一步纯化。
全文摘要
本发明涉及一种生产生物物质的方法，所述方法通过在不含血清的细胞培养基中对悬浮的动物细胞进行灌流式培养来进行，其中，通过过滤从细胞中分离出生物物质，所述方法的特征在于，细胞培养基中存在有至少0.001w/w％的非离子表面活性剂。已发现，非离子表面活性剂存在于细胞培养基中能改善过滤性能。
文档编号C12M3/00GK1780905SQ200480011791
公开日2006年5月31日 申请日期2004年5月3日 优先权日2003年5月1日
发明者兰纳德斯·阿杜尔夫斯·保罗范德尔 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司