专利名称：一种天然高分子多孔微球及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可生物降解的天然高分子多孔微球，这种微球的制备方法，该微球和治疗剂组成的治疗组合物，以及这种微球用于胃腔内漂浮的药物传递系统载体，和动物细胞悬浮培养过程中的贴壁载体。
背景技术：
对于口服缓控释药物传递系统，为了克服胃排空时间、以及利用胃内的特殊pH环境，开发延长在胃腔内停留时间的药物传递系统具有重要意义。一方面，它能延长那些需要在胃内起作用的药物以及主要在胃内及小肠上端被吸收的药物在胃里的停留时间；另外，对于那些在肠道环境中不稳定易被分解的药物，以及在肠道环境中溶解度低而在胃腔内溶解度高的药物也需要使用这种药物传递系统。例如Verapamil HCl(异博定，维拉帕米)是一种罂粟碱的衍生物，分子量为491.08Da，该药物的溶解度与pH值依赖性非常明显。在pH值为1.2、6.8和7.4时，溶解度分别为150，2.71和0.75mg/ml(Streubelet al.，2000，Journal of controlled release 67，101-110)。若采用常规的控释剂型，当药物从胃内进入到小肠内时就有可能发生药物释放速率下降，从而导致体内药物浓度的波动以及生物利用度的问题。为了保证更可靠的药物疗效，延长药物在胃内低pH值时的释放时间，将是非常理想的方法。
目前，提高药物在胃内停留时间的药物传递系统主要包括如下几种(i)生物黏附性释放系统，亦即黏附在粘膜表面；(ii)大尺寸剂型释放系统，即提高剂型的尺寸延迟了药物通过幽门的时间；(iii)密度控制释放系统，即控制药物载体的密度，使其能漂浮在胃流体(胃糜)中，从而延长了药物在胃内的通过时间。绝大部分胃滞药物释放系统都是单个单元装置(如单个的漂浮片、漂浮胶囊等)，由于可能被一次性排空或者不能被排空，通常都存在太早失效的可能性(Hwang，S.J.et.al.1998，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.15，243-284)。所以多单元的、能均分散在胃容物内的漂浮系统将是一种更佳的选择。一般来说，单个单元装置整个体积较大，当量直径达到厘米级，或者几十毫米级。而多单元系统中每一粒微粒或者多孔微球即相当于一个单元装置，但是粒径很小，只有毫米级，或者微米级，能均匀分散于胃容物中。
制备低密度的微球给药系统来延长药物在胃腔内的停留时间将是一种非常有效的方法。目前研究最多的主要是一些合成的高分子材料微球，如聚丙烯泡沫微粒等。这类合成的高分子材料微球，在制备过程中必须加入引发剂、交联剂、有机溶剂等试剂，而这些试剂大部分都存在生物毒性，残留较大；另外这些试剂以及制备出的高分子微球大部分不能生物降解，不具备生物相容性。
高分子材料微球如Atyabi等人(1996，Journal of controlledrelease 42，25-28)开发了一种产生CO2多单元的、口服漂浮系统，首先将装载有碳酸盐的离子交换树脂颗粒表面包覆上一层半透膜。这种颗粒一旦接触到胃液，就会发生碳酸根离子和氯离子的离子交换而导致CO2的形成，而气体被包覆在膜内，这样就引起了微粒的悬浮。但是这种泡腾系统通常存在着不能立即悬浮的缺点，因为产生CO2气体需要一定的时间。Kawashima等人(1991，1992，Journal of PharmacySciences 81，135-140；Journal of controlled release 16，279-290)开发了一种中空微球(微气球)系统。这种微球表面包覆有一层肠溶性聚合物(聚丙烯酸树脂)，药物就装载在外层的聚合物壳内。将聚合物和药物溶解在乙醇/二氯甲烷溶液中，然后将该溶液倒入正在搅拌的聚乙烯醇溶液中。乙醇快速分配到外水相中，聚合物在二氯甲烷液滴周围沉淀。蒸发掉包含在内部的二氯甲烷就会在聚合物微粒内形成空腔。但是在这种微粒在胃流体pH条件下，大部分药物不能充分释放(Lee，J.H.Journal of Microcapsulation 16，715-729)。
利用天然高分子制备药物控制释放系统载体的研究较多，主要以海藻酸盐、淀粉及其衍生物、纤维素及其衍生物、阿拉伯胶、瓜尔豆胶、透明质酸、硫酸软骨素、肝素和壳聚糖等为原料，制成微球或微囊作为药物载体，或者制成含有药物的、用于在体内包埋的凝胶。(Chen，Jun et.al.，Carbohydrate Polymers 28(1)1995，69-76；Sinha，V.R.et.al.，International Journal of Pharmaceutics224(1-2)，2001，19-38)。这类控释药物传递系统主要利用多糖载体在体内包埋部位或者胃肠道内缓慢溶蚀、降解，或者载体对药物扩散的限制，影响药物在载体中的扩散系数，从而达到药物在体内控制释放的目的。但是到目前为止，利用天然高分子制备多孔微球作为密度控制释放系统的药物载体的研究未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种毒性小，生物可降解的天然高分子多孔微球。
本发明的另一目的是提供一种制备这种天然高分子多孔微球的方法。
本发明的再一目的是提供这种天然高分子多孔微球用于作为治疗剂的可药用载体，以及这种天然高分子多孔微球作为载体在细胞贴壁培养中的应用。
本发明的目的是通过如下的方式实现的本发明涉及的天然高分子多孔微球具有如下特性该微球包括30％-98％(w/w)的明胶和2％-70％(w/w)的黄原胶；所述的微球的粒径为0.1-3mm，密度为0.2-1.0g/cm3。密度不同，各成分所占比例亦不同。
所述的天然高分子多孔微球，优选明胶占70％-95％(w/w)，黄原胶占30％-5％(w/w)，余量为水份。
所述的天然高分子多孔微球，优选包括有0.01-5％(w/w)的交联剂，交联剂可以是醛类交联剂和环氧氯丙烷中的一种或者其中的几种合用。
醛类交联剂优选戊二醛、甲醛、乙醛和甘油醛。
制备本发明所述的天然高分子多孔微球的方法包括如下步骤(1)配制明胶与黄原胶的混合溶液a、取无毒性的油作为油相，加热至40℃-120℃；b、在油相中边加热边加入由明胶与黄原胶组成的水相；水相中的明胶溶液的浓度为0.5-50％(w/v)，黄原胶溶液的浓度为0.1-2％(w/v)；明胶溶液和黄原胶溶液两者的体积比为1∶0.1-6；所述的油相的体积为水相的体积4-15倍；c、将油相和水相的混合液的温度保持在40-120℃之间，
搅拌0.1-3小时后，再快速冷却至0℃-15℃之间，迅速降温使其固化；(2)将步骤(1)得到的固化物在-10℃～30℃下真空干燥后制得天然高分子多孔微球。
优选采用油相为矿物油和植物油，进一步优选采用葵花籽油、菜籽油、大豆油、花生油等。
进一步优选在步骤(1)之后还包括如下步骤将固化物继续搅拌0.1-3小时，再加入占水相体积1-10％(V/V)、浓度为0.01-2M的醛类或环氧氯丙烷交联剂进行交联反应，其反应时间为0.1-3小时，接着洗涤交联产物。优选采用挥发性有机溶剂和去离子水充分洗涤交联产物。挥发性有机溶剂优选石油醚、乙醚、乙醇和异丙醇等。
优选上述步骤中的醛类交联剂为戊二醛、甲醛、乙醛、甘油醛。
本发明的关键技术有下面几点一是天然高分子原料的选择明胶是一种天然多肽的聚合物，结构中含有羧基和氨基，具有热凝固性，加热时熔化，冷却时凝固的特性。黄原胶是一种细菌多糖，含有羧基基团。明胶分子链上的氨基与黄原胶分子链中的羧基发生化学作用，从而使得微球得以稳定。关键技术之二是确定黄原胶溶液与明胶溶液的浓度以及二者相互之间的体积比因为这是制备多孔微球的先决条件。本发明制备方法中选择的明胶溶液的浓度为0.5-50％(w/v)。黄原胶溶液的浓度为0.1-2％(w/v)，明胶溶液和黄原胶溶液两者的体积比为1∶0.1-6。关键技术之三是采用油水两相法，升温再降温固化的方法制备多孔微球，这样有利于多孔微球的形成，并且粒径分布较均匀，提高了防聚性。关键技术之四是通过调节明胶和黄原胶的使用量的摩尔比，可以实现对制备的微球的密度的控制。关键技术之五是在制备过程中温度的控制，加热时温度过高，会引起明胶的不可逆变性，过低则不能熔化，不利于明胶与黄原胶之间的化学作用的形成。本发明中采用的温度为40-120℃。关键技术之六是在制备过程中经过交联反应等步骤的处理，醛类交联剂可与明胶分子链上的胺基反应形成希夫碱；而环氧氯丙烷可与羟基发生交联反应，经过交联反应后，有利于提高微球的强度，从而提高抗压性，并可同时改善微球表面的物理化学性质或者引入新的功能基团，有利于进一步对微球进行修饰改性。在本发明中，交联剂使用量很少，而且可以通过后处理过程进一步除掉残留的交联剂；另外在制备过程中，没有引入有毒性的有机溶剂或者反应试剂；再者，明胶和黄原胶均为天然高分子具有很好的生物可降解性和生物相容性，而且已经应用于食品、医药行业，所以与合成高分子材料制成的载体相比优点明显。
本发明还提供这种天然高分子多孔微球用于作为治疗剂的可药用载体。治疗剂是指化学合成药物、生物工程药物，以及从生物体中提取的药用活性成分。如异博定、茶碱等。在制备载药微球时，先配制明胶溶液与黄原胶溶液二者的混合溶液，再向混合溶液中加入一定量的治疗剂并搅拌均匀，然后按照制备多孔微球的方法制备载药多孔微球。用挥发性有机溶剂、去离子水充分洗涤生成物，干燥后即得载药多孔天然高分子微球。载药微球的密度为0.20-1.0g/cm3。包封在微球载体中的治疗剂的量将随该药达到的治疗目的以及该药在胃内的溶解度而改变。
本发明的另一个用途是这种天然高分子多孔微球作为载体在细胞贴壁培养中的应用。动物细胞由于没有细胞壁保护，不能像微生物那样在通气搅拌反应器内悬浮培养。因为在使用搅拌反应器时，液体间的剪切应力远大于动物细胞的承受能力而使动物细胞遭到破坏，甚至气升式反应器的液体剪切应力也超过要求。另外，大部分动物细胞需附着在固体或半固体表面才能生长，细胞在载体表面上生长并扩展成一单层，即贴壁培养。这样就必须有密度与培养基相近或者低的载体。而这种天然高分子多孔微球正好可以满足要求，一方面，密度比较低，可以满足悬浮的要求；另一方面，比表面积较大，适合细胞贴壁培养；再者，微球由天然高分子制备而成，避免了使用对细胞有毒副作用的多种有机试剂、有机溶剂。这种微球的表面带有许多活性基团，可以进行表面修饰改性，使其符合特殊细胞贴壁生长的要求。采用低密度的微球载体进行细胞贴壁培养与传统的贴壁培养相比，具有更好的传质、传氧的性能。
本发明制备的天然高分子多孔微球同现有的常见的多孔微球相比，其明显的优点是制备过程经济，对设备要求不高；制备出的微球具有生物相容性，可以生物降解；微球上活性基团多，易于修饰改性，可以制备出具有不同表面性质的微球；制备的微球内部多孔，密度低，而且按照不同的工艺参数，密度可以调节；由于微球具有较低的密度，可以作为微球载体用于在胃腔内漂浮的微球药物传递系统，以及动物细胞贴壁悬浮培养载体。
图1为天然高分子多孔微球放大30倍的电镜照片此图为电镜照片，圆形突出部分即为微球内部的小孔小气泡，图中的标尺表示1000微米。
图2为天然高分子多孔微球放大60倍的电镜照片图2为图1的局部放大图，图中的标尺表示100微米。
具体实施例方式
实施例1取液体石蜡100ml，搅拌(n＝500rpm)同时进行加热，当温度上升到80℃时，加入10ml 15％(w/v)明胶溶液与10ml 1％(w/v)黄原胶溶液相混合后的溶液，温度保持在80-90℃之间，搅拌10分钟后，快速冷却至15℃，继续搅拌10分钟后停止。用石油醚、去离子水充分洗涤生成物，30℃干燥后即得多孔天然高分子微球。微球粒径为0.95-1.10mm(＞90％)，分散性较好，密度为0.3g/cm3，微球中明胶占93.0％(w/w)，黄原胶占7.0％(w/w)。见附图1、图2。此图为电镜照片，圆形突出部分即为微球内部的小孔。
实施例2取葵花籽油400ml，搅拌(n＝1000rpm)同时进行加热，当温度上升到40℃时，加入10ml 5％(w/v)明胶溶液与40ml 2％(w/v)黄原胶溶液相混合后的溶液，温度保持在40℃左右，搅拌80分钟后，快速冷却至10℃，继续搅拌20分钟后加入1ml 0.025M的戊二醛，交联反应1.5小时后停止。用乙醚、去离子水充分洗涤生成物，在20℃干燥后即得多孔天然高分子微球。测得微球密度为0.8g/cm3，微球粒径为0.46-0.50mm(＞80％)。微球中明胶占38.3％(w/w)，黄原胶占61.5％(w/w)，交联剂占0.2％。
实施例3取花生油300ml，搅拌(n＝300rpm)同时进行加热，当温度上升到100℃时，加入10ml 30％(w/v)明胶溶液与5ml 1.5％(w/v)黄原胶溶液相混合后的溶液，温度保持在100℃左右，搅拌40分钟后，快速冷却至5℃，继续搅拌20分钟后停止。用挥发性有机溶剂(如石油醚、乙醚、乙醇和异丙醇等)、去离子水充分洗涤生成物，再将微球在0.01M的环氧氯丙烷碱性溶液中(pH＝10)交联2小时，然后用挥发性有机溶剂、去离子水洗涤，在15℃干燥后得到交联的多孔低密度天然高分子微球。测得微球密度为0.5g/cm3，微球粒径为2.52-2.84mm(＞95％)。微球中明胶占97.0％(w/w)，黄原胶占2.95％(w/w)，其余为交联剂。
实施例4取液体石蜡800ml，搅拌(n＝1000rpm)同时进行加热，当温度上升到60℃时，加入20ml 20％(w/v)明胶溶液与80ml 2％(w/v)黄原胶溶液相混合后的溶液，温度保持在60℃左右，搅拌120分钟后，快速冷却至0℃，继续搅拌50分钟后加入10ml 0.03M的甲醛，交联反应0.2小时后停止。用挥发性有机溶剂乙醇、去离子水充分洗涤生成物，3℃干燥后即得多孔天然高分子微球。测得微球密度为0.7g/cm3，微球粒径为0.15-0.33mm(＞80％)。微球中明胶占70.5％(w/w)，黄原胶占28.5％(w/w)，交联剂为1％。
实施例5取葵花籽油1000ml，搅拌(n＝800rpm)同时进行加热，当温度上升到90℃时，加入10ml 40％(w/v)明胶溶液与8ml 2％(w/v)黄原胶溶液相混合后的溶液，温度保持在90℃左右，搅拌200分钟后，快速冷却至2℃，继续搅拌100分钟后停止。用挥发性有机溶剂异丙醇、去离子水充分洗涤生成物，再将微球在0.5M的环氧氯丙烷碱性溶液中(pH＝10)交联1小时，然后用挥发性有机溶剂、去离子水洗涤，0℃干燥后得到交联的多孔低密度天然高分子微球。测得微球密度为0.46g/cm3，微球粒径为0.65-0.78mm(＞93％)。微球中明胶占94％(w/w)，黄原胶占4.2％(w/w)，其余为交联剂。
实施例6取葵花籽油300ml，搅拌(n＝700rpm)同时进行加热，当温度上升到70℃时，加入10ml 0.5％(w/v)明胶溶液与20ml 0.1％(w/v)黄原胶溶液相混合后的溶液，温度保持在75℃左右，搅拌60分钟后，快速冷却至10℃，继续搅拌40分钟后加入10ml 0.04M的甘油醛，交联反应2小时后停止。用挥发性有机溶剂、去离子水充分洗涤生成物，7℃干燥后即得多孔天然高分子微球。测得微球密度为0.78g/cm3，微球粒径为0.84-0.92mm(＞80％)。微球中明胶占70.4％(w/w)，黄原胶占27.2％(w/w)，余量为交联剂。
实施例7取液体石蜡200ml，搅拌(n＝600rpm)同时进行加热，当温度上升到60℃时，加入20ml 0.5％(w/v)明胶溶液与2ml 2％(w/v)黄原胶溶液相混合后的溶液，温度保持在65℃左右，搅拌60分钟后，快速冷却至5℃，继续搅拌30分钟后加入10ml 0.01M的戊二醛，交联反应3小时后停止。用挥发性有机溶剂、去离子水充分洗涤生成物，-10℃干燥后即得多孔天然高分子微球。测得微球密度为0.46g/cm3，微球粒径为0.58-0.70mm(＞80％)。微球中明胶占70.3％(w/w)，黄原胶占28.0％(w/w)，余量为交联剂。
实施例8取花生油200ml，搅拌(n＝680rpm)同时进行加热，当温度上升到75℃时，加入10ml 25％(w/v)明胶溶液与20ml 2％(w/v)黄原胶溶液相混合后的溶液，在混合溶液中加入茶碱0.005g并搅拌均匀，温度保持在75℃左右，搅拌20分钟后，快速冷却至5℃，继续搅拌20分钟后停止。用挥发性有机溶剂、去离子水充分洗涤生成物，干燥后即得载药多孔天然高分子微球。测得载药微球密度为0.84g/cm3，微球粒径为0.80-0.92mm(＞80％)。微球中明胶占86.5％(w/w)，黄原胶占13.5％(w/w)。
实施例9取葵花籽油200ml，搅拌(n＝700rpm)同时进行加热，配制10ml10％(w/v)明胶溶液与10ml 2％(w/v)黄原胶溶液相混合后的溶液，在混合溶液中加入Verapamil HCl(异博定，维拉帕米)1.5g并搅拌均匀，当温度上升到70℃时，再加入混合有药物的明胶和黄原胶混合溶液，温度保持在70℃左右，搅拌50分钟后，快速冷却至12℃；继续搅拌20分钟后加入1ml 0.025M的戊二醛，交联反应0.5小时后停止。用挥发性有机溶剂、去离子水充分洗涤生成物，-5℃干燥后即得载药多孔天然高分子微球。测得载药微球密度为0.68g/cm3，微球粒径为0.45-0.52mm(＞85％)。
实施例10取液体石蜡油250ml，搅拌(n＝600rpm)同时进行加热，配制15ml 20％(w/v)明胶溶液与10ml 1.5％(w/v)黄原胶溶液相混合后的溶液，在混合溶液中加入Verapamil HCl(异博定，维拉帕米)1.0g并搅拌均匀，当温度上升到80℃时，再加入混合有药物的明胶和黄原胶混合溶液，温度保持在80℃左右，搅拌40分钟后，快速冷却至5℃；继续搅拌20分钟后加入1ml 0.02M的乙醛，交联反应2小时后停止。用挥发性有机溶剂(如石油醚、乙醚、乙醇和异丙醇等)、去离子水充分洗涤生成物，-8℃干燥后即得载药多孔天然高分子微球。测得载药微球密度为0.75g/cm3，微球粒径为0.98-1.32mm(＞85％)。
权利要求
1.一种天然高分子多孔微球，该微球包括30％-98％(w/w)的明胶和2％-70％(w/w)的黄原胶；所述的微球的粒径为0.1-3mm，密度为0.2-1.0g/cm3。
2.根据权利要求1所述的天然高分子多孔微球，其特征在于该微球包括70％-95％(w/w)的明胶，5％-30％(w/w)的黄原胶。
3.根据权利要求1所述的天然高分子多孔微球，其特征在于所述的微球还包含有占微球原料总量的0.01-5％(w/w)交联剂，该交联剂为醛类交联剂或环氧氯丙烷中的一种。
4.根据权利要求3所述的天然高分子多孔微球，其特征在于所述的醛类交联剂选自戊二醛、甲醛、乙醛或甘油醛。
5.一种制备权利要求1所述的天然高分子多孔微球的方法，包括如下步骤(1)配制明胶与黄原胶的混合溶液a、取无毒性的油作为油相，加热至40℃-120℃；b、在油相中边加热边加入由明胶与黄原胶组成的水相；水相中的明胶溶液的浓度为0.5-50％(w/v)，黄原胶溶液的浓度为0.1-2％(w/v)；明胶溶液和黄原胶溶液两者的体积比为1∶0.1-6；所述的油相的体积为水相的体积4-15倍；c、将油相和水相的混合液的温度保持在40-120℃之间，搅拌0.1-3小时后，再快速冷却至0℃-15℃之间，迅速降温使其固化；(2)将步骤(1)得到的固化产物在-10℃～30℃下真空干燥后制得天然高分子多孔微球。
6.根据权利要求5所述的天然高分子多孔微球的制备方法，其特征在于在步骤(1)之后，还包括如下步骤固化物继续搅拌0.1-3小时，再加入占水相体积1-10％(V/V)、浓度为0.01-2M的醛类或环氧氯丙烷交联剂进行交联反应，其反应时间为0.1-3小时，接着洗涤交联产物。
7.根据权利要求6所述的天然高分子多孔微球的制备方法，其特征在于所述的醛类交联剂选自戊二醛、甲醛、乙醛或甘油醛。
8.根据权利要求5所述的天然高分子多孔微球的制备方法，其特征在于所述的油相为矿物油或植物油。
9.一种权利要求1所述的天然高分子多孔微球用于作为治疗剂的可药用载体。
10.一种权利要求1所述的天然高分子多孔微球作为载体在细胞贴壁培养中的应用。
全文摘要
本发明提供一种可生物降解的天然高分子多孔微球及该微球的制备方法，该微球和治疗剂组成的治疗组合物，以及这种微球用于胃腔内漂浮的药物传递系统载体，和动物细胞悬浮培养过程中的贴壁载体；该天然高分子多孔微球的制备，首先将明胶和黄原胶分散在油相中，降温使其固化，接着进行交联，反应结束后分离、清洗和干燥后即得到天然高分子多孔微球；本发明制备过程经济，得到的微球毒性低、生物相容性好；而且按照不同的工艺参数，密度可以调节；可用于在胃腔内漂浮的药物传递系统载体，以及动物细胞贴壁悬浮培养载体。
文档编号A61K31/337GK1485094SQ0213127
公开日2004年3月31日 申请日期2002年9月24日 优先权日2002年9月24日
发明者仰振球, 宋宝珍 申请人:中国科学院过程工程研究所