专利名称：一种异亚丙基莽草酸的制备方法及新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种莽草酸衍生物的制备方法及新用途，特别是涉及一种异亚丙基莽草酸的制备方法及新用途。
莽草酸(Shikmicacid，SA-1)，为中草药木兰科八角属多种植物果实中含有的药效成分，其来源由八角科多蕊红茴香Illicium henrvivar.multistamineum的果实及角属其它植物的成熟果实经甲醇等溶剂提取，精制而成。其分子式为C7H10O5，分子量为174.15。近年来，对血栓形成机制的研究及抗血栓药物的开发深受各国医药界的关注，并已有部分有效化合物处于临床和临床前研究阶段。
抗血栓药物根据其作用机理分为三类抗凝药物、抗血小板药物和溶栓药物。抗凝药物中，除了天然和重组。人类抗凝血酶-III外，还有凝血酶的直接抑制剂水蛭素、阿加曲班以及中药花椒、丹参、赤芍的粗提物；抗血小板药物目前取得不少新的进展，有抑制花生四烯酸代谢的药物钩藤碱、毛冬青甲素、芍药酚，抑制血小板激活因子的粉防已碱，银杏内脂B和海风藤酮，也发现有些中药或成分通过提高血小板内cAMP水平，降低血小板内Ca2+浓度从而抑制血小板聚集。随着血栓性疾病病理机制及体内纤溶机制的进一步阐明。抗栓和溶栓药物的研究越来越多，该类药物在急性心肌梗塞的溶栓治疗中占有重要的地位。已发现中药蒲黄的水溶液具有不依赖纤溶酶系的直接促纤溶作用。大蒜可明显降低血浆纤维蛋白原，并可直接激活纤溶酶、使分解纤维蛋白产生的片断显著增多，赤芍和蚯蚓水提物也均可在不同环节产生溶栓作用，总之，抗血栓药物的研究开发工作十分活跃，对药物作用机理的研究已深入到分子和受体水平；尽管目前的工作取得不少成绩，但存在问题也较多，主要问题是中药的研究制剂纯度不够，粗制剂中杂质多，对药效、作用机理及临床给药途径带来很大的局限性。因此，纯的单体药物是今后开发的主要方面。
脑卒中是中老年人的常见病，尤其缺血性脑卒中往往由于后遗症等原因，严重影响病人生活质量，增加家庭和社会负担。因此，研制和开发临床疗效较好的防治脑缺血的药物是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明目的在于提供一种3，4-O-异亚丙基莽草酸及其制备方法；本发明目的在于提供一种3，4-O-异亚丙基莽草酸的药物用途。本发明目的是通过如下技术方案实现的。
异亚丙基莽草酸(3，4-oxo-isopropylidene-shikimic acid，ISA)是从中药木兰科植物八角茴香(Fructus Anisi stellati)中提取的有效成分莽草酸的活性衍生物之一，中文名3，4-O-异亚丙基莽草酸，分子式及分子量C10H14O5214，化学名3，4-O-异亚丙基莽草酸英文化学名3，4-oxo-isopropylidene-shikimic acid。本发明3，4-O-异亚丙基莽草酸的结构式为 本发明异亚丙基莽草酸的制备方法取莽草酸1重量份，加80体积份丙酮，再加0.05重量份对甲苯磺酸，水浴回流2小时，回收丙酮至干，加水40体积份，乙酸乙酯40体积份分配，水层再用20体积份乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯，用20体积份水洗涤2次，20重量份Na2SO4脱水，回收乙酸乙酯，得异亚丙基莽草酸1重量份。
本发明异亚丙基莽草酸的纯度测定方法为采用硅胶TLCS法及HPLC法，吸附剂，硅胶G预制板；展开剂为，8-12∶0.5-1.5∶2-5滴氯仿-甲醇-甲酸；显色剂为3-6％硫酸乙醇溶液，喷后加热显色，T＝28℃，RH＝80％，点样量从左至右依次为8-12μg、18-22μg、μg、28-32、38-42μg、58-62μg、78-82μg、98-102μg，测定纯度可达98％以上。
本发明3，4-O-异亚丙基莽草酸定量方法为仪器及测定条件，色谱柱luna C184.6×250mm，5μm，移动相50％MeOH-冰HAC(1000∶3)，测定波长220nm，流速1ml/min，室温；标准曲线制备，精密称取3，4-O-异亚丙基莽草酸对照品1.15mg，5.14mg，10.83mg，20.45mg，30.65mg，50.52mg于50.0ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻液，摇匀，为标准溶液；分别吸取10.0μl进样测定，并进行线性回归，求得回归方程为A＝20934C+235，r为0.9996，线性范围为0.23～10.10μg；对照品溶液的制备，精密称取3，4-O-异亚丙基莽草酸对照品约20mg于50.0ml容量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，做为对照品溶液；3，4-O-异亚丙基莽草酸原料药含量测定，精密称取3，4-O-异亚丙基莽草酸原料20mg于50.0ml容量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，取少量以微孔滤膜滤过，滤液做为样品供试液；精密吸取样品供试液、对照品溶液各10μ1注入HPLC仪测定，外标法计算含量。
实验例1异亚丙基莽草酸对大脑中动脉栓塞大鼠脑组织自由基代谢的影响材料与方法动物 体重180～200g，♂，Wistar大鼠，由医科院动物研究所提供，合格证号SCXK11-00-0006。
药品与试剂 异亚丙基莽草酸(ISA，纯度＞98％)，无色片状结晶，由北京中医药大学植化教研室郭亚建教授提供；尼莫地平(Nim)片剂，天津中央药业有限公司，批号20000903；SOD、MDA和GSH-PX测定试剂盒，南京建成生物工程研究所产品，批号分别为20011109、20011106、20011108。
实验仪器 XTT实体显微镜云南光学仪器厂；722型光栅分光光度计，上海第三分析仪器厂。
大脑中动脉血栓模型的制备 大鼠随机分为6组，(1)假手术组(2)MCAT组(3)ISA50mg·kg-1组(4)ISA100mg·kg-1组(5)ISA200mg·kg-1组(6)NIM5mg·kg-1组，3～6组大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液0.4mL·kg-1麻醉。按Tamura等[3]的方法，稍加改进。大鼠右侧卧位固定，在眼外眦和外耳道连线中点作一弧形切口，长约1.5cm，夹断颞肌并切除，暴露颞骨，用牙科钻在颧骨与颞鳞骨接合处靠近口侧1mm处作一直径2.5mm骨窗，清理残渣，暴露大脑中动脉(位于嗅束及大脑下静脉之间)。置一小片塑料薄膜保护血管周围组织。将吸有50％氯化铁溶液10μL的小片定量滤纸敷在此段大脑中动脉上，30min后取下滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，回笼饲养。假手术组，除不滴加氯化铁溶液外，其余手术步骤同模型组。造模后立即灌胃给药一次，60min后再给药1次。
脑组织T-SOD、Cu-Zn-SOD、MDA和GSH-PX的测定 动物手术后24h，断头取脑。去除嗅球、小脑和低位脑干，取手术侧(右侧)半脑，在4℃下沿冠状面去掉脑前端约2mm，取随后约4mm(大脑中动脉区域)称重，制成10％匀浆。按试剂盒说明测定T-SOD、GSH-PX活力和MDA含量。脑组织匀浆按样品∶SDS＝4∶1容积比，混匀，37℃水浴30min，4℃冷却，加10％KCl充分混匀，置4℃冰箱30min，取出，3000r·min-1离心，取上清液200μL，按T-SOD测定法测定Cu-Zn-SOD含量。
结果1 ISA对MCAT大鼠脑组织T-SOD和Cu-Zn-SOD的影响脑组织缺血缺氧后，组织氧化和抗氧化平衡被打破，表1结果显示模型组T-SOD和Cu-Zn-SOD活力明显降低，表明机体清除超氧阴离子自由基的能力降低。给予ISA后，200，100mg·kg-1可明显升高脑组织T-SOD活力；200，100，50mg·kg-1对Cu-Zn-SOD活力均有增高。NIM对Cu-Zn-SOD表现出较明显的升高作用。
表1、ISA对MCAT大鼠脑组织T-SOD和Cu-Zn-SOD活力的影响组别剂量 T-SOD Cu-Zn-SOD/mg·kg-1NU·mg prot-1NU·mg prot-1假手术 - 3.12±0.17 2.48±0.11模型 - 2.51±0.49ΔΔ1.74±0.48ΔΔ尼莫西 5 3.04±0.41 2.65±0.35**平ISA 2003.30±0.45**2.56±0.25**1003.13±0.46*2.53±0.23**50 2.92±0.36 2.45±0.24**与模型组比较.*P＜0.05，**P＜0.01与假手术组比较ΔΔP＜0.012 ISA对MCAT大鼠脑组织MDA的影响脑组织缺血缺氧后产生大量的自由基，攻击生物膜中的多种不饱和脂肪酸，生成MDA等脂质过氧化物，表2显示模型组脑组织MDA明显升高，给予ISA200，100，50mg·kg-1后均有不同程度的降低，表明ISA对脑组织缺血后自由基的生成有一定抑制作用。NIM5mg·kg-1也表现出相似的作用。
表2、ISA对MCAT大鼠脑组织MDA的影响组别 剂量 MDA/mg·kg-1/nmol·mg prot-1假手术 - 1.37±0.07模型- 1.67±0.11ΔΔ尼莫地平5 1.45±0.25*ISA 200 1.36±0.13**100 1.45±0.12**501.46±0.22*与模型组比较.*P＜0.05，**P＜0.01与假手术组比较ΔΔP＜0.013 ISA对MCAT大鼠脑组织GXH-PX的影响脑缺血缺氧后通过CoQ途径产生H2O2等过氧化物，GXH-PX可催化过氧化物分解，保护细胞膜结构和功能的完整。表3表明模型组GXH-PX活力降低，NIM5mg·kg-1和ISA200，100，50mg·kg-1均可明显提高GXH-PX活力。
表3、ISA对MCAT大鼠脑组织GXH-PX的影响组别剂量GXH-PX/mg·kg-1U·mg prot-1假手术 -1.11±0.66ΔΔ模型 -0.80±0.10尼莫地平 51.16±0.26**ISA 200 3.37±0.51**100 3.24±0.49**50 2.95±0.34**与模型组比较.*P＜0.05，**P＜0.01与假手术组比较ΔΔP＜0.01实验结果显示异亚丙基莽草酸(ISA)对脂质过氧化产物MDA的生成有明显的抑制作用，对抗氧化系统T-SOD、Cu-Zn-SOD和GSH-PX的活性有明显的升高，因此ISA可通过调节自由基的代谢保护局灶性脑缺血损伤。实验例2ISA对大鼠原代神经细胞缺血再灌注损伤的保护作用材料和方法动物 新生Wistar大鼠(24小时)，雌雄兼用，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。
药品和试剂 异亚丙基莽草酸(ISA，纯度＞98％)，无色片状结晶，由本校植物化学教研室郭亚健教授提供；尼莫地平注射液山东新华制药厂产品批号00090399；乳酸脱氢酶试剂盒南京建成生物工程研究所，批号20010614；DMEM高糖培养基Gibco公司产品；马血清 Hyclone公司产品；胎牛血清 Gibco公司产品；胰蛋白酶 Gibco公司产品；HEPES 德国B.M公司产品；胰岛素 上海生物化学制药厂；阿糖胞苷 北京医科大学实验药厂；多聚赖氨酸 美国Sigma公司产品。苏木精-伊红染液。
其它试液的配制DMEM培养液 DMEM高糖培养基1袋，NaHCO33.7g，HEPES5g。
解剖液A液glucose/sucrose＝3g/7.5g，加蒸馏水50ml；B液HEPES 2.3464g加水100ml，调pH至7.3～7.4；C液NaCl8g，Na2HPO4·7H2O0.18g，KCI0.4g，KH2PO40.03g，加水50ml。A、B、C三液混合后加水至1000ml，过滤除菌，4℃贮存备用。
接种培养液79.5％DMEM培养液，10％马血清，10％胎牛血清，0.5％青霉素(2u/ml)维持培养液88.5％DMEM培养液，10％马血清，1％N3，0.5％青霉素，N3牛血清白蛋白0.15μM，亚硒酸钠0.06μM，黄体酮0.04μM，氢化可地松0.1μM，胰岛素237.6IU/L。
无糖Earle`s液NaCl116.4mM，KCl5.4mM，CaCl21.8mM，MgSO40.8mM，NaH2OP42.6mM，NaHCO326.2mM，HEPES20.1mM，含糖Earle`s液再加5.5mM葡萄糖。
仪器 CJT型超净工作台 北京昌平长城空气净化工程公司；DMIL HC倒置显微镜德国徕卡公司；Olympus生物显微镜 日本；X5Z-H型生物显微镜，重庆光学仪器厂RCO-3000T-5V型CO2培养箱 美国N.C公司；细胞培养板 丹麦NUNC公司；缺氧罐 北京科普仪器厂。
神经细胞原代培养[1]取新生的Wistar大鼠，75％酒精消毒，在无菌条件下解剖分离大鼠双侧大脑皮层，切碎后0.25％胰蛋白酶37℃消化30分钟，终止后吹打，制备成1～2×106个细胞/ml的单细胞悬液，接种于12孔培养板(经0.01％多聚赖氨酸处理)中，0.5ml/孔，37℃、6％CO2培养箱中培养24小时后，更换为维持培养液，以后隔日更换维持培养液，在培养4～5天时，加入浓度为8μM的细胞分裂抑制剂阿糖胞苷，作用48小时。培养9天后进行指标检测。
缺糖缺氧拟神经细胞再灌注损伤模型 取培养9天的细胞，撤去原培养液，用无糖Earle`s液洗两次，加入无糖Earle`s液，置缺氧罐中通入6％CO2和94％N2，30分钟后夹闭通气，并将缺氧罐置37℃培养箱中继续培养3小时，然后取出培养板，换高糖DMEM和血清等，恢复供氧，模拟缺血再灌注状态。正常对照组用含糖Earle`s液孵育，药物分别于换Earle`s液和高糖DMEM时加入，体积为10μl/1ml培养液。
细胞正常形态观察 在相差显微镜下观察不同处理后的细胞胞体、胞核及突触形态和生长情况，并进行定性比较。
HE染色 按常规方法采用伊红-苏木精染色观察不同处理后细胞突触、胞体及胞核形态的差别进行定性比较。
乳酸脱氢酶漏出率的测定 分别于缺糖/缺氧3h，复糖复氧3h、6h、18h取上清液测定LDH活力，然后将细胞置-20℃冰箱中过夜，冻融后同法测定LDH活力。细胞损伤程度以培养细胞释放的LDH和总LDH活力的百分比(LDH％)表示，LDH释放率越高表示细胞受损伤程度越严重。在缺糖缺氧3h和缺糖缺氧3h/复糖复氧18h时，通过组间比较观察药物作用。
LDH的测定原理在波长440nm处比色，测定丙酮酸二硝基苯腙的含量，推算出乳酸脱氢酶(LDH)的活力(u/100ml)。
统计学处理 实验数据以X±S表示，用t检验判断差异的显著性。
结果1异亚丙基莽草酸对细胞缺糖缺氧后形态的影响 正常培养9天后，相差显微镜下直接观察可见神经细胞胞体呈锥体、卵圆形或梭形，周围光晕明显，核及核仁清楚，突触丰富并交织成网状。缺糖缺氧3h后复糖复氧18h，神经细胞胞体变大，突触减少，光晕变暗，出现肿胀等损伤征象。给予ISA10-5、10-6、10-7mol·L-1，细胞形态均出现相应改善，且大剂量最为明显。Nim10-5mol·L-1亦表现出明显保护作用2HE染色 正常组细胞呈锥体，突触丰富，细胞核膜清晰，核染色质细致，核仁明显，胞浆呈淡红色；模型组细胞突触减少，细胞核固缩，浓染出现明显的损伤，ISA治疗后各组细胞细胞核固缩浓染等损伤明显减轻，Nim也表现出同样的作用。
3缺糖缺氧及缺糖缺氧后复糖复氧不同时间神经细胞LDH漏出率的影响缺糖缺氧后神经细胞受损，膜通透性增加，LDH漏出到培养液中。从及表4可以看出，神经细胞缺血缺氧3h时，LDH漏出率开始增加，复糖复氧3h、6h、18h时，LDH漏出率继续升高，这表明复糖复氧较单纯缺糖缺氧对神经细胞损伤更严重。
表4、缺糖缺氧及缺糖缺氧后复糖复氧不同时间神经细胞LDH漏出率的影响LDH％组别 缺血缺氧3h 缺血缺氧3h 缺血缺氧3h缺血缺氧3h再灌注3h 再灌注6h再灌注18h对照21.4±7.428.0±5.729.0±4.2 35.0±8.0模型28.8±3.8ΔΔ43.0±5.0ΔΔ62.0±9.0ΔΔ66.0±5.0ΔΔ与对照组比较.ΔΔP＜0.014ISA对缺糖缺氧和缺糖缺氧后复糖复氧神经细胞LDH漏出率的影响如表5所示，神经细胞缺糖缺氧3h和复糖复氧18h，溶剂对照组 漏出率明显高于正对照组，而ISA10-5、10-6mol·L-1表现出明显的降低作用。尼莫地平10-5mol·L-1对缺糖缺氧及复糖复氧后LDH升高也有明显降低作用。表5、ISA对缺糖缺氧和缺糖缺氧后复糖复氧神经细胞LDH漏出率的影响剂量 LDH漏出百分率％组别 Nmol·L-1缺糖缺氧3h 缺糖缺氧3h-再灌注18h对照 - 12 14.51±8.7629.13±6.93模型 - 12 21.16±4.43Δ39.78±6.50ΔΔ尼莫地平10-512 11.50±4.22**14.08±8.59**ISA 10-512 13.22±3.94**16.89±7.09**10-612 12.91±3.93**29.32±5.82**10-712 19.73±4.8641.65±5.52
与模型组比较**P＜0.01与对照组比较ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01实验例3异亚丙基莽草酸对皮层原代神经细胞凋亡的影响材料与方法动物 24小时内的新生Wistar大鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供药品与试剂 ISA无色片状结晶，由本校植物化学教研室郭亚健教授提供；尼莫地平(Nimodipine，NIM)注射液 山东新华制药股份有限责任公司产品批号00090399；碘化丙啶RNA酶 美国Sigma公司产品；TDT，末端脱氧核糖核酸转移酶 美国Promega公司；地高辛标记的dUTP 德国B.M公司；FLUO-3，AM Ester Biotium公司产品；SABC，链酶亲和素-过氧化物酶，中国Boster公司产品；Anti-DIG-Biotin，美国Sigma公司产品；Caspase-3兔源多抗为Santa Cruz公司产品。
仪器 FACS-420型流式细胞仪 美国B.D公司；Leica TCS-NT型激光共聚焦显微镜 德国徕卡公司；Olympus生物显微镜 日本；X5Z-H型生物显微镜，重庆光学仪器厂；Meta Morph图像软件分析系统 美国Universal Imaging corporation产品。
皮层原代神经细胞的培养[2]取新生的Wistar大鼠，75％酒精消毒，再无菌条件下解剖分离大鼠双侧皮层，切碎后0.25％胰蛋白酶37℃消化30分钟，终止后吹打，制备成1-2×106个细胞/mL的单细胞悬液，接种于50ml培养瓶(经0.01％多聚赖氨酸处理)中，10mL/瓶，37℃，6％CO2培养箱中培养24小时后，更换为维持培养液，以后隔日更换维持培养液，在培养4-5天时，加入浓度为8μM的细胞分裂抑制剂阿糖胞苷，作用48小时。培养9天后进行指标检测。
缺糖缺氧拟神经细胞再灌注损伤模型的建立 取培养9天的细胞，撤去原培养液，用无糖Earle`s液洗两次，加入无糖Earle`s液，置一缺氧罐中通入5％CO2和95％N2，30分钟后夹闭通气，并将缺氧罐置37℃培养箱中继续培养4小时，然后取出培养瓶，换高糖DMEM和血清等，恢复供氧，模拟缺血再灌注状态。正常对照组用含糖Earle`s液孵育，药物分别于换Earle`s液和高糖DMEM时加入，体积为10μl·mL-1培养液。
凋亡细胞计数流式细胞仪检测[3]神经细胞培养9天后，分别于缺糖/缺氧3h，缺糖缺氧3h再灌3h、再灌18h、再灌24h。收集细胞悬液，1000rpm离心5分钟，PBS洗两次，70％乙醇4℃固定24小时。固定后的细胞用PBS洗两次，悬浮，加入终浓度20mg·L-1的RNAaseA，37℃恒浴45分钟，再加入PI染色剂终浓度为50mg·L-1，混匀后4℃避光1小时，经300目细胞筛过滤，在流式细胞仪上检测10,000个细胞，测定各期DNA含量并计算细胞凋亡率。
TUNEL法检测[4]神经细胞培养9天后，分别于缺糖/缺氧3h，缺糖缺氧3h再灌2h、再灌18h、再灌24h。按照试剂盒方法略作调整去掉细胞培养液，4％多聚甲醛/0.1PBS室温固定30分钟。PBS洗2分钟×2次，蒸馏水洗2分钟×2次；新鲜配制3％H2O2，室温处理7分钟，蒸馏水洗2分钟×3次；标本片加TBS1∶100新鲜稀释Proteinase K 37℃消化3分钟，TBS洗2分钟×3次。；按每张片取TDT和DIG-d-UTP各1μl，加入18μl标记缓冲液，混匀。甩去切片上多余液体后加标记液，20μl每片。置湿盒中4℃标记过夜，再加37℃标记2小时；TBS洗2分钟×3次；加封闭液50μl/片，室温30分钟，甩掉封闭液，不洗；用封闭液1∶100稀释生物素化抗地高辛抗体，50μl加至标本片上。置样品于湿盒中，37℃反应30分钟。TBS洗2分钟×3次；用封闭液1∶100稀释SABC，混匀加至标本片，37℃反应30分钟。TBS洗5分钟×4次；DAB显色取1ml蒸馏水，分别加入DAB试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至标本上，显色30分钟。水洗；脱水，透明，封片。显微镜计算阳性细胞数。
一般形态学观察观察阳性细胞的形态、数量和阳性反应部位等。
阳性细胞计数在光镜200×下，以每张盖玻片中央为中心视野，再取其上下左右相邻视野各个，共5个视野，计数TUNEL阳性细胞数。每组取4张盖玻片，以一个视野为样本，共计20个样本。
Caspase-3的免疫组织化学检测 切片制作同。组织切片PBS洗5min×3，0.3％H2O2溶液阻断内源性过氧化酶5min；PBS洗5min×3；1.5％正常羊血清封闭30min；滴加一抗(抗Caspase-3抗体)，4℃过夜；PBS洗5min×3；加生物素化二抗，室温反应1.5h；PBS洗5min×3；加SABC室温反应2小时；PBS洗5min×3；DAB显色15min，蒸馏水漂洗，脱水，透明，封片。
一般形态学观察观察阳性细胞的形态、数量和阳性反应部位等。
阳性细胞计数在光镜200×下，以每张盖玻片中央为中心视野，再取其上下左右相邻视野各个，共5个视野，计数Caspase-3阳性细胞数。每组取4张盖玻片，以一个视野为样本，共计20个样本。
神经细胞内钙的测定[5]原代神经细胞培养9天后，模拟缺血再灌注损伤造模，再灌注18小时后，用Hank`s液漂洗各组细胞2-3次，吸取细胞表面的残渣以及其它杂质，加入含有5μmol·L-1FLUO-3/AM，ester的维持培养液，37℃温育40min，再用Hank`s液洗2-3次，充分洗去没有负载的荧光探针，上机检测。
将负载好的神经细胞方在LCSM载物台上，先用倒置镜观察细胞状态，再在荧光显微镜下调平面，观察细胞负载情况，用氪氩离子激光预扫描后设置各种条件，选择扫描时间间隔、扫描时间，然后正式选择整个细胞，扫描并记录Ca2+荧光强度。
统计学处理 实验数据以 X±S表示，用t检验判断差异的显著性。结果1、缺糖缺氧后不同时间神经细胞凋亡率 神经细胞凋亡后，染色质DNA被核酸内切酶切割，形成小分子DNA片段，从细胞内扩散出，细胞内DNA含量降低。PI染色后在流式细胞仪上分析细胞各期DNA含量，在DNA直方图中，正常细胞G1峰前出现一DNA减少的“亚二倍体峰”或“G1亚峰”(Sub-G1-Peak)，该峰的出现被认为是凋亡发生的标志之一。
流式细胞仪分析结果表明，神经细胞缺糖缺氧3h后神经细胞G1峰前出现一DNA减少的“亚二倍体峰”，既细胞出现凋亡现象，而且复糖复氧时间的延长，神经细胞凋亡率增加，缺糖缺氧3h后复糖复氧18h细胞凋亡率最高为22.03％，至复糖复氧24h细胞凋亡率有所降低，因此下面的实验均选择缺糖缺氧3h后复糖复氧18h制备细胞“缺血再灌注模型”，观察ISA对神经细胞凋亡率的影响。
2、ISA对神经细胞凋亡的影响流式细胞仪检测 根据前面的实验，溶剂对照组神经细胞缺糖缺氧3h后复糖复氧18h，作为细胞损伤模型组。结果表明，溶剂对照组神经细胞缺糖缺氧3h后复糖复氧18h，细胞凋亡率为22.03％；给予不同浓度的ISA(10-5、10-6、10-7mol·L-1)和尼莫地平(10-5mol·L-1)，细胞凋亡率分别为9.44％，7.96％，7.94％和9.76％，细胞凋亡率分别下降了63.87％，63.96％，55.70％和57.15％。结果见表6。
表6、ISA对体外培养皮层神经细胞凋亡百分率的影响剂量/组别 凋亡百分率/％抑制百分率/％mol·L-1正常 - 7.78±2.79 -模型 - 22.03±3.65ΔΔ-尼莫地平 10-59.44±1.96**57.15**ISA 10-57.96±1.12**63.87**10-67.94±1.44**63.96**10-79.76±1.01**55.70**
与模型组比较**P＜0.01与正常组比较ΔΔP＜0.01.
TUNEL检测 神经细胞TUNEL染色后，阳性细胞(即凋亡细胞)细胞核呈蓝紫色，可见核固缩、裂解，染色质呈颗粒状或块状凝集，边聚于核膜周围，而胞浆不着色。阴性细胞(即正常细胞)胞核形态正常不着色。溶剂对照组复糖复氧18h，阳性细胞计数明显高于正常细胞；而ISA和NIM组阳性细胞数与溶剂对照组比较明显减少。结果见表7。
表7、ISA对体外培养皮层神经细胞凋亡百分率的影响剂量组别 阳性细胞数量 抑制百分率/％mol·L-1正常 -1.50±1.36-模型 -13.15±7.83ΔΔ-尼莫地平 lO-56.00±2.05**54.37ISA 10-62.70±1.52**79.47与模型组比**P＜0.01与正常组比较ΔΔP＜0.01.
3、ISA对神经细胞Caspase-3表达的影响免疫细胞化学染色，DAB显色后，阳性细胞胞浆呈棕黄色，而胞核不着色。正常细胞胞核、胞浆均不着色，而且细胞形态较好。各组阳性细胞在显微镜下计数结果和比较结果如表8所示，溶剂对照组缺糖缺氧后复糖复氧18h，阳性细胞计数明显高于正常细胞；而给予ISA和NIM干预后，阳性细胞数与溶剂对照组比较，细胞计数明显减少。
表8、ISA对体外培养皮层神经细胞Caspase-3表达的影响剂量 组别 阳性细胞数 抑制百分率/％mol·L-1- Normal 12.85±4.78ΔΔ-- Vehicle 58.35±9.90 -10-5NIM 25.95±13.88**55.6510-6ISA 27.2±10.29**53.38与模型组比较**P＜O.Ol与正常组比较ΔΔP＜0.014、ISA对神经元[Ca2+]i的影响神经细胞缺糖缺氧3h后复糖复氧18h后，加入含有5μmol·L Ca2+探针FLUO-3/AM，ester的维持培养液，37℃温育40min，即在激光共聚焦显微镜下检测，根据细胞内荧光强度推测[Ca2+]i，结果如附图
6所示，溶剂对照组细胞荧光强度明显增高，而ISA10-6mol·L-1和尼莫地平10-5mo·L-1细胞荧光强度明显降低。图像分析结果见表9。
表9、ISA对体外培养皮层神经细胞[Ca2+]i的影响组别 剂量/mo·L-1荧光强度正常- 84.99±24.59模型- 144.64±14.70ΔΔ尼莫地 10-553.36±27.74**平ISA10-686.71±34.80**与模型组比较**P＜0.01；与正常组比较ΔΔP＜0.01.
实验例4、对实验性血栓的影响1对大鼠动静脉环路血栓形成的影响方法大鼠腹腔注射10％水合氯醛0.32ml/100g麻醉，仰卧位固定，分离右侧颈总动脉和左侧颈外静脉。在10cm长的聚乙烯管中段放入一根提前称重的7号手术线(长约8cm)并充满生理盐水，其两端连接充满肝素的插管(长约3cm)，一端插管插入颈静脉，另一端插入颈总动脉，打开动脉夹后，血液从右侧颈总动脉经聚乙烯管流入左侧颈外静脉，形成体外环路血流。15分钟后中断血流，迅速取出血栓称重，该重量减去丝线重量即得血栓湿重；血栓60℃干燥45分钟，称重，该重量减去丝线重量即得血栓干重。实验结果表10 ISA对大鼠动静脉旁路血栓的影响(X±SD，n＝10-12)剂量 血栓湿重抑制率 血栓干重 抑制率组别(mg/kg) (mg) (％) (mg) (％)空白组- 182.9±53.2 42.40±11.72ISA 200 107.2±16.92**41.425.34±3.91**40.2ISA 100 119.1±23.17**34.927.87±5.22**34.3ISA 50 129.8±48.34*29.029.38±11.73*30.7ISA 25 136.15±38.88*25.531.59±9.02*25.5ISA 12.5144.05±35.47 21.133.42±8.23 21.0ASA 50 128.35±32.85**29.829.27±7.65**31.0
注*P＜0.05，**P＜0.01表示与空白组比较结果表明ISA50、100、200mg/kg组，均可明显降低大鼠体外血栓重量(含湿重和干重)，且有一定量效关系。阿斯匹林50mg/kg组也显示明显的血栓抑制作用。
2对电刺激大鼠颈总动脉血栓形成的影响方法实验动物采用10％水合氯醛麻醉(0.35ml/100g)，仰位固定，分离左侧颈总动脉，分别将血栓形成测定仪刺激电极放于颈总动脉近心端，热敏温度计放于远心端，设定检测仪温度为80℃，刺激电流1.5mA打开电极和计时器开关，刺激7min，7min时仪器自动断开，屏幕显示的时间即为血管阻塞时间，即为血栓形成时间(OT)。按下面公式计算延长率。实验结果表11 SA对电刺激大鼠颈总动脉血栓形成时间的影响(X±SD)剂 量动物数 血栓形成时间 延长率组别(mg/kg) (n) (s) (％)空白组- 12 535.80±99.2-ISA 20012 796.61±70.7**48.7ISA 10012 701.81±69.1**31.0ISA 50 12 644.31±40.6*20.3ASA 50 12 714.21±70.9**33.3注*P＜0.05，**P＜0.01与空白组比较结果显示，ISA50、100、200mg/kg组可显著延长血栓形成时间，ASA组也呈现明显延长作用。
实验例5异亚丙基莽草酸(ISA)对大鼠局灶性脑栓塞的影响方法与结果1 ISA对大脑中动脉血栓模型(MCAO)神经症状的影响实验动物分为6组，(1)假手术组(2)MCAO组(3)ISA50mg/kg组(4)ISA100mg/kg组(5)ISA200mg/kg组(6)NIM5mg/kg组，3-6组造模后立即灌胃给药一次，60分钟再给药一次。
大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液0.4ml/kg，麻醉。按Tamura等的方法，稍加改进。大鼠右侧卧位固定，在眼外眦和外耳道连线中点作一弧形切口，长约1.5cm，夹断颞肌并切除，暴露颞骨，用牙科钻在颧骨与颞鳞骨接合处靠近口侧1mm处作一直径2.5mm骨窗，清理残渣，暴露大脑中动脉(位于嗅束及大脑下静脉之间)。置一小片塑料薄膜保护血管周围组织。将吸有50％氯化铁溶液10μl的小片定量滤纸敷在此段大脑中动脉上，30min后取下滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，回笼饲养。假手术组，除不滴加氯化铁溶液外，其余手术步骤同模型组。
行为检测，在术后不同时间(6h，24h)，按Bederson等的方法并加以改进，对动物进行行为评分。满分为4分，分数越高，动物的行为障碍越严重。对行为检测打分值进行组间比较，t检验。结果见表12。
表12 ISA对模型大鼠行为学评分的影响(X±SD)注*P＜0.05，**P＜0.01与模型组比较剂量 例数 分值组别(mg/kg) (n) 6h 24h假手术组-12 0±0**0±0**模型组 -10 3.50±0.71 3.10±0.70ISA200 11 1.82±0.75**1.36±0.48**ISA100 11 1.91±0.70**1.64±0.48**ISA5010 2.40±0.70**2.20±0.75*NIM5 11 2.64±0.67**1.64±0.64**结果显示，ISA各剂量组和尼莫地平组对模型大鼠的行为学均有显著的改善(P＜0.05，P＜0.01)。
2、ISA对MCAO大鼠脑梗塞范围的影响动物经末次行为评分后，断头取脑。去掉嗅球、小脑和低位脑干，剩余部分在4℃下冠状切成5片。迅速将脑片置于TTC染液中(每5ml染液中含4％TTC1.5ml，1MK2HPO40.1ml)，37℃避光温孵30分钟，再取出，置于10％甲醛中避光保存。经染色后非缺血区为玫瑰红色，梗塞区为白色。将白色组织仔细挖下称重，以梗塞组织重量占全脑重量的百分比作为脑梗塞范围。结果进行组间比较，t检验。结果见表13
表13 ISA对模型大鼠脑梗塞范围的影响(X±SD)剂量 例数 梗塞范围占全脑的重量比组别(mg/kg) (n) (％)假手术组 - 120±0**模型组 - 103.42±1.08ISA 200 112.34±0.63*ISA 100 112.47±0.88*ISA 50 102.59±0.78NIM 5112.50±0.71*注*P＜0.05，**P＜0.01与模型组比较结果显示，ISA大、中剂量及尼莫地平组可明显减小模型大鼠脑梗塞范围(P＜0.05)。
3、ISA对MCAO大鼠脑含水量的影响动物分组、给药、造模方法同前面实验，造模24小时后断头取脑，用滤纸吸干表面水分，称量全脑湿重。再置于烘箱中，105℃烘烤48小时至恒重，精确称量干重，计算含水量，组间比较，进行t检验。结果见表14。
表14 ISA对模型大鼠脑含水量的影响(X±SD)剂量 例数 全脑含水量组别(mg/kg) (n) (％)假手术组 -1280.04±0.34**模型组 -1080.46±0.35ISA 200 1180.09±0.41*ISA 100 1180.15±0.37ISA 501080.3±0.62NIM 5 1180.49±0.54注*P＜0.05，**P＜0.01与模型组比较结果表明，模型大鼠脑含水量明显增加，ISA大剂量组可明显改善模型大鼠脑水肿程度(P＜0.05)。
实验例6ISA对血小板聚集功能的影响1 ISA体外实验对ADP、胶原诱导的家兔血小板的聚集的影响方法家兔用1.5％戊巴比妥耳缘静脉注射麻醉。颈总动脉取血，3.8％枸橼酸钠抗凝(1∶9)，800rpm离心8min，分离PRP，3000rpm离心15min，分离PPP，在显微镜下计数，用PPP调PRP血小板数约4×108/L。取300μlPRP，加入10μl不同浓度药物，温育10min，加入诱导剂ADP5μl或胶原7.5μl，分别检测5或10min，记录最大聚集率，空白组加入10μl蒸馏水，溶媒组加入4％乙醇液10μl，检测同上。结果表15、ISA体外实验对ADP诱导的家兔血小板聚集的影响(X±SD)组别 药物终浓度(mol/L)最大聚集率(％)抑制率(％)空白组 - 62.80±19.21溶媒组4％乙醇 60.43±20.30ISA10-336.72±21.29**41.5ISA10-444.36±15.96**29.4ISA10-547.49±18.70*24.4ISA10-649.69±22.2920.9ISA10-756.48±21.5710.1ASA10-444.05±18.94#27.1注*P＜0.05，**P＜0.01与空白组比较；#P＜0.05与溶媒组比较结果表明，体外给药，ISA终浓度10-3-10-5mol/L浓度组对ADP诱导的血小板聚集均有明显的抑制作用，且有一定量效关系。溶媒组与空白组比较无差异。
表16 ISA体外实验对胶原诱导的家兔血小板聚集的影响(X±SD)组别 药物终浓度 最大聚集率 抑制率(％)(mol/L) (％)空白组- 68.67±15.97ISA 10-331.80±18.12**53.7ISA 10-438.74±17.70**43.6ISA 10-547.53±20.83**30.8ISA 10-648.02±19.06**30.1ISA 10-755.78±17.5918.8ASA 10-442.40±20.31**38.3
注**P＜0.01与空白组比较结果表明，体外给药，ISA10-3-10-6浓度组对胶原诱导的血小板聚集均有明显的抑制作用，也有一定的量效关系。
2 ISA体内给药对ADP、胶原、AA、凝血酶诱导的大鼠血小板聚集的影响方法(1)分组与给药实验动物随机分为5组，即ISA 50、100、200mg/kg组；阳性药组(阿斯匹林50mg/kg)；空白对照组。除空白组给予等量蒸馏水外，其余各组均按1ml/100g给药，每日一次，连续三天。
(2)方法大鼠实验前禁食12h(不禁水)，于末次给药后1.5h颈总动脉取血，3.8％枸橼酸钠抗凝(1∶9)，800rpm离心10min，分离PRP，2500rpm离心10min，分离PPP，在显微镜下计数，用PPP调PRP血小板数约6-8×108/L。取300μlPRP，加入诱导剂ADP4μmol/L或胶原7.5μl，或AA200μmol/L及凝血酶50U/L按Born比浊法测定血小板最大聚集率。
结果表17体内给药ISA对胶原、ADP诱导大鼠血小板聚集的影响(X±SD)胶原ADP剂量组别 最大聚集率 抑制率 最大聚集率(％) 抑制率(mg/kg)(％) (％)(％)空白组- 79.02±8.4268.23±14.51ISA 200 40.47±28.88**48.439.68±13.74**43.3ISA 100 54.71±26.76**30.849.82±7.92**27.0ISA 50 67.25±10.72**14.952.23±11.90**23.5ASA 50 32.81±24.32**58.549.13±8.44**28.0注**P＜0.01与空白组比较。
结果表明，ISA连续灌胃3天可显著抑制胶原、ADP、AA、凝血酶诱导的大鼠血小板聚集，并有一定量效关系。
表18 ISA体内给药对AA、凝血酶诱导的大鼠血小板聚集的影响(X±SD)，n＝9～10剂量 AA凝血酶组别mg/kg 聚集率(％) 抑制率(％) 聚集率(％) 抑制率(％)空白 -- 56.51±9.82 -- 55.21±16.00 --ISA 200 36.21±15.80**35.9 36.99±15.09*33.0ISA 100 41.40±17.80*26.7 38.94±22.54*29.5ISA 50 42.92±17.46*25.8 42.68±20.8522.7ASA 50 32.72±15.40**42.1 41.70±12.7922.5注*、**表示与空白组比较P＜0.05、P＜0.01实验例7ISA对凝血系统的影响1 ISA对正常大鼠凝血因子的作用实验方法(1)分组与给药动物随机分为5组，即空白组，ISA50、100、200mg/kg组和阳性药ASA50mg/kg组，除空白组给予等量蒸馏水外，其余各组均按1ml/100g体重给药，每日一次连续三天，于末次给药后1h取血测定。
(2)方法大鼠于末次给药后1h 10％水合氯醛0.35ml/kg腹腔注射麻醉，颈总动脉取血，3.8％枸橼酸钠(1∶9)抗凝，3500rpm离心10min，分离PPP，取100μl放于比浊杯中，按试剂盒说明分别加入TT、PT、aPTT试剂，测定各项指标。结果进行t检验。
结果表19 ISA对大鼠凝血因子的影响(X±SD)剂量组别 N TT(s)PT(s) APTT(s)(mg/kg)空白组 - 10 34.04±3.17 14.71±1.69 17.76±1.40ISA20010 37.25±3.39 15.55±1.40 19.41±2.28ISA10010 37.14±5.70 15.13±1.08 17.97±1.41ISA50 10 36.95±4.95 15.46±1.36 17.80±1.61ASA50 949.86±9.98**##47.57±17.23**#38.52±15.97**###注*P＜0.05，**P＜0.01与空白组比较；##P＜0.01与ISA200mg/kg组比较。
结果表明，ISA各剂量组对大鼠TT、PT、aPTT无明显影响，ASA组对TT、PT、aPTT均有明显延长作用。
实验例8ISA对球囊导管所致大鼠内皮损伤模型的影响血小板聚集活性的测定，大鼠实验前禁食12h(不禁水)，于末次给药后1.5h颈总动脉取血，3.8％枸橼酸钠抗凝(1∶9)，800rpm离心10min，分离PRP，2500rpm离心10min，分离PPP，在显微镜下计数，用PPP调PRP血小板数约6-8×108/L。取300μlPRP，加入诱导剂ADP4μl(终浓度为4μmol/L)或胶原7.5μl，诱导集终浓度为ADP10μmmol/L，胶原40μm/L，按Born比浊法测定血小板最大聚集率。血小板聚集测定均在采集血样后3h完成。
可溶性P-选择素释放的测定，术后三天收集血液标本，大鼠颈总动脉取血，2％的EDTA-Na2抗凝，体积比为1∶9，-20度保存，按放免法测定，双抗夹心法测定。
血小板vWF释放的测定，大鼠颈总动脉取血，2％的EDTANa2抗凝，体积比为1∶10，-20保存，。按试剂盒要求用ELISA法测定各孔A值，以A492对vWF标准血浆稀释度(含量％)在双对数坐标纸上做标准曲线，待测样品vWF含量由标准曲线读出。
血清中NOS、NO含量的测定，取全血3mL，室温放置1h，4℃离心3500rpm，15min，分离血清，放-20℃保存。按试剂盒要求处理样品，于722分光光度计上测定。
血浆中TXB2和6-酮PGF1a含量的测定，取一次性5ml离心管加入消炎痛-EDTA·Na20.2ml，动脉插管取血3Ml，混匀，4℃离心3500rpm，15min，分离血浆，放-20℃保存。用放免法测定TXB2和6-酮PGF1a的含量。
结果球囊导管损伤后三天血小板聚集性的变化及ISA的干预作用球囊剥脱术后大鼠的血小板聚集明显高于空白组，空白组的血小板最大聚集率分别为43.7±15.4％和43.4±11.7％，模型组的血小板最大聚集率分别为70.0±20.7％和62.6±17.0％，血小板聚集反应性明显增加，说明血小板处于激活状态。ISA连续给药三天可明显抑制胶原和ADP诱导的大鼠血小板最大聚集率，其中200mg/kg的抑制率分别为38.0％，56.6％。
表20球囊导管损伤后三天血小板聚集性的变化及ISA的干预作用组别剂量 聚集率(％) 抑制(％)(mg/kg) ADP Col ADPCol对照 - 43.7±15.4 43.4±11.7 -- --模型 - 70.0±20.7#62.6±17.0##-- --ISA 200 30.4±16.7**38.8±14.8*56.6 38.0ISA 100 38.1±19.3*42.1±16.2*45.6 32.7ISA 50 45.0±13.5 46.1±15.7**35.7 26.4阿司匹林 50 41.7±11.8*41.4±12.3**40.4 33.9由表20可知，球囊导管所致大鼠主动脉壁损伤后三天血小板对ADP、胶原诱导的聚集性明显增高，表明该模型中血小板的活性增强，ISA200mg/kg连续给药三天可显著降低ADP、胶原诱导的血小板聚集性。
球囊导管损伤后三天血浆中GMP-140和vWF含量的变化及ISA的影响。
鼠后第三天取血检测血浆中GMP-140水平，模型组血浆中GMP-140含量水平为41.6±16.7ng/ml，ISA50mg/kg有降低血浆中GMP-140含量水平的趋势，但无统计学差异，ISA200mg/kg和100mg/kg能显著降低血浆中GMP-140含量水平，提示ISA了明显抑制球囊括中术后早期血小板的活化，ASA也表现出了明显的抑制作用。
结果显示，球囊导管损伤内皮后血浆中vWF的含量高于空白组(Control)，但无明显差异(P＞0.05)。灌胃给药ISA200、100、50mg/kg组血浆中vWF的含量与诱导组相比均有所降低，其中200mg/kg组差异显著(P＜0.05)。说明TSA体外给药可部分抑制血小板激活时血浆中vWF含量的升高。ISA200mg/kg可明显降低血浆中GMP140含量，ASA液表现出了明显的抑制作用。结果见表21。
表21 ISA对血浆vWF和P-选择素的影响(x±SD，n＝8～10)浓度组别剂量(mol/L) nVWF(％) P-选择素(ng/ml)对照 - 422.95±0.95---模型 - 423.77±0.99 41.6±16.7ISA 200 421.74±1.38**20.9±9.8**ISA 100 422.60±1.35*30.0±13.0ISA 50 422.86±1.24 33.2±12.8阿司匹林50 421.92±2.14 27.0±8.1*
4.1 ISA连续三天给药对内皮模型血清中NO、NOS的影响结果表明，球囊导管所致内皮损伤的第三天血清中所测的NOS活性较空白组明显降低，血清中NO含量也有一定的减少。本实验中观察到ISA连续三天给药可以明显的增加血清中NOS的活性，升高血清中NO的含量。NO可以活化可溶性含血红素的鸟苷酸环化酶，使血管平滑肌和血小板中的cGMP水平升高，促进血管平滑肌松弛，抑制血小板凝聚和粘附到内皮细胞上。在球囊导管损伤血管内皮后的早期，血管平滑肌细胞iNOS产生的大量NO可以抑制血小板粘附与聚集，保持损伤部位的抗血栓特性。本实验中阿司匹林也可以明显增加血清中NO的含量，但对NOS活性影响不明显。
表22 ISA连续三天给药对内皮损伤模型血清中NO、NOS的影响组别 NO含量(umol/L)NOS活性(U/mL)空白组 24.81±18.61 22.85±2.17模型组 21.42±12.40 19.91±2.85#ISA200mg/kg 36.06±13.32*20.40±3.55ISA100mg/kg 37.18±21.17 22.52±3.57ISA50mg/kg 26.64±10.55 23.21±3.85*ASA50mg/kg 34.46±14.01*21.31±2.10注*P＜0.05表示同模型组比较，#P＜0.05表示同空白组比较。
5.ISA连续给药对球囊导管损伤内皮模型血浆中TXB2、6-PGF1α含量的影响结果表明正常大鼠血浆中TXB2为222.9±87.45pg/ml，实施大鼠胸、腹主动脉内皮剥脱术后三天血浆中TXB2含量明显增高(502.9±295.1，p＜0.05vsmormal)，ISA200mg/kg、100mg/kg灌胃给药能明显降低血浆中TXB2的水平(P＜0.05)，抑制率为47.4％，45.5％，ISA50mg/kg对模型血浆中TXB2含量无明显影响，但同空白组相比较没有显著性差异(p＞0.05)，环氧化酶抑制剂ASA能显著降低血浆中TXB2的含量(P＜0.01)，抑制率达76.2％。
表23 ISA连续3天给药对内皮损伤模型血浆中TXB2、6-PGF1α含量的影响(x±SD)(n＝8～10)组别 TXB2(pg/ml) 6-PGF1α(pg/ml) TXB2/6-PGF1aratio空白组222.9±87.45 717.9±405.2 0.80±0.44模型组502.9±295.1#428.1±316.5 1.89±1.21##ISA200mg/kg 264.3±90.3*594.4±247.8 0.88±0.36*ISA100mg/kg 274.2±130.2*612.2±558.2 0.97±0.47*ISA50mg/kg467.4±324.4 681.1±461.9 1.19±0.65ASA50mg/kg119.6±104.1**139.3±50.54*1.38±0.30另外，正常大鼠血浆中6-keto-PGF1a含量为717.9±405.2pg/ml，实施大鼠胸、腹主动脉内皮剥脱术后三天血浆中6-PGF1α含量明显降低(428.1±3 16.5，P＞0.05vs mormal)，给予ISA200、100、50mg/kg三天后对血浆中6-keto-PGF1a含量水平桶模型比较有一定的增加趋势，但无统计学意义(p＞0.05 vs model)。ASA则能显著降低血浆中6-keto-PGF1a的含量(139.3±50.54，P＜0.01)，抑制率达80.6％。
正常大鼠血浆中TXB2/6-keto-PGF1a的比值为0.80±0.44，实施大鼠胸、腹主动脉内皮剥脱术后三天血浆中TXB2/6-keto-PGF1a的比值明显增高(1.89±1.21，p＜0.01vsmodel)ISA200、100mg/kg能明显降低血浆中TXB2/6-keto-PGF1a的比值(p＜0.05)，50mg/kg虽然有降低血浆中TXB2/6-keto-PGF1a币值的趋势，但同模型组相比较无显著差异(P＞0.05)，ASA显著降低血浆中TXB2、6-keto-PGF1a的含量，但对血浆中TXB2/6-keto-PGF1a的比值无明显影响。
实验结果显示，正常大鼠血浆中6-keto-PGF1a含量为553.3±507pg/ml，实施大鼠胸、腹主动脉内皮剥脱术后三天血浆中6-PGF1α含量明显降低(275.7±239.1，p＜0.05vsmormal)，给予ISA200、100、50mg/kg三天后对血浆中6-keto-PGF1a含量水平桶模型比较有一定的增加趋势，但无统计学意义(p＞0.05 vs model)。ASA则能显著降低血浆中6-keto-PGF1a的含量(P＜0.01)。
实验例9异亚丙基莽草酸对第二信使的影响血小板环核苷酸cAMP、cGMP的测定 大鼠10％水合氯醛腹腔注射麻醉，颈总动脉放血，2％EDTA·Na219抗凝，以100×g离心5min制备PRP，PRP继续以500×g离心5min，所得沉淀物为所需血小板样品。沉淀物中加入0.3％NaCl溶液1.5mL，保存2min，使残存的红细胞溶解，再加入4.5％NaCl溶液0.25mL恢复等渗，1800×g离心10min，弃上清液，沉淀物加入双蒸水0.5mL和10％三氯醋酸0.25mL，用硅化玻璃棒轻轻搅拌，置冰浴中15min，1800×g离心15min，上清液用水饱和乙醚6mL分三次提取上清液中三氯醋酸，将水层置60℃水浴10min，蒸去残余乙醚，-20℃保存。按放免法测定血小板环核苷酸cAMP、cGMP的含量。
结果ISA连续三天灌胃给药对大鼠血小板cAMP和cGMP生成的影响用放射免疫法测定正常大鼠血小板内cAMP的含量为11.55±3.69pg/4×108platelet，ISA100、200mg/kg连续灌胃给药三天均明显升高血小板内cAMP的含量，分别为15.98±5.01、18.36±5.85pg/4×108platelet(p＜0.05，p＜0.01，vs control)，但对血小板内cGMP无明显影响。见表24。表24 ISA连续三天灌胃给药对大鼠血小板cAMP和cGMP生成的影响(X±SD)n＝9～12.
组别 剂量(mg/kg) CAMP(ng/mL)CGMP(ng/mL)空白 -- 11.55±3.690.62±0.36ISA 20015.42±8.970.67±0.40ISA 10015.98±5.01*0.84±0.45ISA 50 18.36±5.85**0.85±0.34ASA 50 14.37±5.030.84±0.41注*、**表示与空白组比较P＜0.05、P＜0.01实施例1亚丙基莽草酸的制备方法取莽草酸1g，加80ml丙酮，再加0.05g对甲苯磺酸，水浴回流2小时，回收丙酮至干，加水40ml，乙酸乙酯40ml分配，水层再分别用20ml乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯，分别用20ml水洗涤2次，20gNa2SO4脱水，回收乙酸乙酯，得异亚丙基莽草酸1g，再用10倍量丙酮重结晶。
实施例2异亚丙基莽草酸的测定方法纯度测定采用硅胶TLCS法及HPLC法测定3，4-O异亚丙基莽草酸原料的纯度，纯度可达98％以上。
纯度检查(TLC法)，吸附剂硅胶G预制；展开剂10∶1∶4d氯仿-甲醇-甲酸；显色剂5％硫酸乙醇溶液，喷后加热显色。
点样量从左至右依次为10μg、20μg、30μg、40μg、60μg、80μg、100μg；3，4-O-异亚丙基莽草酸定量方法色谱柱luna C184.6×250mm，5μm，移动相1000∶350％MeOH-冰HAC，测定波长220nm，流速1ml/min，室温；标准曲线制备，精密称取3，4-O-异亚丙基莽草酸对照品1.15mg，5.14mg，10.83mg，20.45mg，30.65mg，50.52mg于50.0ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻液，摇匀，为标准溶液；分别吸取10.0μl进样测定，并进行线性回归，求得回归方程为A＝20934C+235，r为0.9996，线性范围为0.23～10.10μg；对照品溶液的制备精密称取3，4-O-异亚丙基莽草酸对照品约20mg于50.0ml容量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，做为对照品溶液；3，4-O-异亚丙基莽草酸原料药含量测定精密称取3，4-O-异亚丙基莽草酸原料约20mg于50.0ml容量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，取少量以微孔滤膜滤过，滤液做为样品供试液；精密吸取样品供试液、对照品溶液各10μl注入HPLC仪测定，外标法计算含量。
权利要求
1.一种化合物3，4-O-异亚丙基莽草酸，其特征在于该化合物结构式为
2.一种异亚丙基莽草酸的制备方法，其特征在于该方法为莽草酸1重量份，加丙酮20-80体积份，再加对甲苯磺酸0.04-0.06重量份，回流1-2小时，回收丙酮，反应物加水约10-40份，乙酸乙酯10-40体积份分配，水层再用乙酸乙酯10-20倍萃取3-5次，或逆流萃取，合并乙酸乙酯液，无水Na2SO4脱水，回收乙酸乙酯至干，即得。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于该方法为取莽草酸1重量份，加80体积份丙酮，再加0.05重量份对甲苯磺酸，水浴回流2小时，回收丙酮至干，加水40体积份，乙酸乙酯40体积份分配，水层再用20体积份乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯，用20体积份水洗涤2次，20重量份Na2SO4脱水，回收乙酸乙酯，得异亚丙基莽草酸1重量份。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于该方法得到异亚丙基莽草酸后，还可以再用10倍量丙酮重结晶。
5.异亚丙基莽草酸的测定方法，其特征在于该方法为仪器及测定条件，色谱柱luna C184.6×250mm，5μm，移动相800-1200∶32-3850％MeOH-冰HAC()，测定波长220nm，流速1ml/min，室温；标准曲线制备，精密称取3，4-O-异亚丙基莽草酸对照品1.15mg，5.14mg，10.83mg，20.45mg，30.65mg，50.52mg于50.0ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻液，摇匀，为标准溶液；分别吸取10.0μl进样测定，并进行线性回归，求得回归方程为A＝20934C+235，r为0.9996，线性范围为0.23～10.10μg；对照品溶液的制备，精密称取3，4-O-异亚丙基莽草酸对照品约20mg于50.0ml容量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，做为对照品溶液；3，4-O-异亚丙基莽草酸原料药含量测定，精密称取3，4-O-异亚丙基莽草酸原料20mg于50.0ml容量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，取少量以微孔滤膜滤过，滤液做为样品供试液；精密吸取样品供试液、对照品溶液各10μl注入HPLC仪测定，外标法计算3，4-O-异亚丙基莽草酸含量。
6.如权利要求5所述的异亚丙基莽草酸的测定方法，其特征在于该方法移动相为50％MeOH-冰HAC1000∶35。
7.异亚丙基莽草酸的纯度测定方法，其特征在于该方法为采用硅胶TLCS法及HPLC法，吸附剂，硅胶G预制板；展开剂为，8-12∶0.5-1.5∶2-5滴氯仿-甲醇-甲酸；显色剂为3-6％硫酸乙醇溶液，喷后加热显色，点样量从左至右依次为8-12μg、18-22μg、28-32μg、38-42μg、58-62μg、78-82μg、98-102μg，测定纯度可达98％以上。
8.如权利要求7所述的异亚丙基莽草酸的纯度测定方法，其特征在于该方法中展开剂为10∶1∶4d氯仿-甲醇-甲酸；显色剂5％硫酸乙醇溶液，喷后加热显色；点样量从左至右依次为10μg、20μg、30μg、40μg、60μg、80μg、100μg。
9.异亚丙基莽草酸在制备治疗脑血栓的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，治疗脑血栓是指异亚丙基莽草酸对神经细胞形态有明显保护作用。
11.如权利要求9所述的应用，治疗脑血栓是指异亚丙基莽草酸对乳酸脱氢酶升高有降低作用。
12.如权利要求9所述的应用，治疗脑血栓是指异亚丙基莽草酸对神经细胞凋亡有抑制作用。
13.异亚丙基莽草酸在制备治疗脑梗塞的药物中的应用。
14.异亚丙基莽草酸在制备抗血栓形成药物中的应用。
15.如权利要求14所述的抗血栓形成是指抑制血小板聚集。
16.如权利要求14所述的抗血栓形成是指增加血清中一氧化氮的含量。
全文摘要
本发明公开了一种异亚丙基莽草酸的制备方法及新用途。本发明异亚丙基莽草酸的制备方法为莽草酸1重量份，加丙酮20－80体积份，再加对甲苯磺酸，回流1－2小时，回收丙酮，反应物加水约10－40份，乙酸乙酯10－40体积份，分配一次后，水层再用乙酸乙酯10－20倍萃取3－5次，或逆流萃取，合并乙酸乙酯液，无水Na
文档编号A61K31/357GK1442415SQ0213077
公开日2003年9月17日 申请日期2002年9月26日 优先权日2002年9月26日
发明者孙建宁, 郭亚健 申请人:北京中医药大学