专利名称：一种利用激流式生物反应器悬浮培养动物细胞的工艺过程及控制方法
一种利用激流式生物反应器悬浮培养动物细胞的工艺过程及控制方法技术领域
本发明属于细胞工程技术，涉及动物细胞大规模培养及生产重组蛋白药物的工艺，具体涉及动物细胞无血清高密度，高表达悬浮培养工艺过程控制方法。
背景技术：
动物细胞大规模培养已成为生物制药领域最重要的关键技术之一，并随着重组治疗性蛋白类药物的广泛应用而迅速发展。目前工业化生产动物细胞表达重组蛋白治疗药物的主要方法是通过生物反应器，在体外大规模高密度培养杂交瘤细胞、工程细胞、昆虫细胞和微生物等，再通过相关的纯化手段制备重组蛋白产品。
用于细胞大规模培养的生物反应器有搅拌式生物反应器，气升式生物反应器，中空纤维生物反应器，固定床式生物反应器，旋转式生物反应器，一次性生物反应器。[SINGH Vijay. Disposable bioreactor for cell cumture using wave-1nduced agitation[J].Cytotechnology, 1999,30 :149-158. ] [2]SlivacI, Srcek V G, Ra(jo§ evic K, Kmetic I and Kniewald Z 2006Aujeszky’ sdisease virus production in disposable bioreact or[JJ.Biosc1. 31 :363-368.]搅拌式生物反应器的最大优点是能培养各种类型的动物细胞，培养工艺容易放大，产品质量稳定，适合于工业化生产，在生物制品开发中潜力很大。但这种生物反应器也有不足之处，即机械搅拌会产生高剪切力，对细胞造成某种程度上的损伤。气升式生物反应器能在通气的同时，利用其独特的回路循环装置使液相达到循环。最常见的为管道或板柱内循环气升式生物反应器。外循环气升式反应器，将下降管置于反应器外部，可用于高细胞浓度灌注培养。缺点相对来说较少，主要是高密度培养时混合不够均匀。中空纤维生物反应器的主要组成部分是一充满培养液的闭合管道，管道中插入半通透性的中空纤维。中空纤维为培养细胞提供营养物质并运走代谢废物。但是细胞密度过高会妨碍氧的扩散，使细胞的得氧量不同。同时，此反应器中还存在着营养物质和代谢产物的浓度差，这就导致了细胞生长的不均一性。[李宝香，郭德伦，张莹三维细胞培养技术及相关仪器的进展和应用]填充床生物反应器中填充了某种材料，作为固定细胞的载体，填料颗粒堆叠成床。培养液可以在床层中流动。它没有机械搅拌和气泡，所以剪切力小，适合细胞培养。但该反应器的最大缺点是混合效果差，传质、传氧效率低。[动植物细胞培养生物反应器的研究进展王志江，郑裕国旋转式生物反应器(RCCS)主要由控制装置和培养容器两部分组成。培养容器主要由内外两个圆筒组成，内、外筒可相对独立地旋转。 整个容器由电机驱动沿水平轴旋转，细胞颗粒在水平轴内建立均质的液体悬浮轨道。由于该系统无推进器、空气升液器、气泡或搅拌器，细胞颗粒不与容器壁或任何其它易致伤的物体相碰，故几乎没有破坏性的剪切力。普通生物反应器由于通过搅拌保持细胞的悬浮而产生的剪切力破坏了细胞间和细胞与基质问的稳定，使组织和细胞集中于自身的修复，而大大影响其生长和其它的正常生理功能。由于有很好的物质交换功能，细胞在RCCS中能以很高的密度生长，其细胞的培养密度可达到108，故可快速大规模地培养细胞。此外，这种培养能提供本能的分化、高细胞增殖、低的细胞死亡率和增加细胞产物的分泌。[Fang A, Pierson D L. Mishra SK. etal. Growth of Streptomyces hygroscopicusinrotating wall bioreactor under simulated microgravity inhibits rapamycin production[J]. Appl Microbiol Biotecknol. 2000,54 :33.] 一次性生物反应器是最近发展起来的新式反应器， 由预先消毒的、可被FDA认可的、对生物无害的聚乙烯塑料箱组成，箱中部分填充培养液并接种细胞，箱中其余部分是空气。使用前箱体用r射线消毒，用后丢弃。特殊的开孔可进行无菌加样、取样，而不必把生物反应器置于层流罩中，装置简单，易于操作，成本低，低剪切力，无空气鼓泡减低了气泡对细胞的损害，可用于培养动物细胞和植物细胞并十分适合生产病毒。此反应器已经成功悬浮培养重组NSO细胞生产单克隆抗体；悬浮培养人293细胞生产腺病毒；用昆虫sf 9细胞生产棒状病毒；用微载体Cytodex 3培养人293细胞。[林福玉，陈昭烈等.大规模动物细胞培养的问题及对策.生物技术通报.1999，1:32-35.]
本发明中激流式生物反应器是一种全新概念的生物反应器，激流式生物反应器由控制系统、激流式振荡器、细胞培养罐、一次性细胞培养袋、灭菌器、取样器、储液袋七大部分组成。基于无鼓泡式新型传氧机制，它通过激流式振荡器机械摇动产生激流而使培养液反复冲刷细胞培养袋内表面的氧分子层，进而使氧，二氧化碳等气体分子层迅速溶解于培养液中，同时带走排除代谢废物，以满足细胞正常生长和代谢的需求。激流式反应器采用具有世界专利的无鼓泡式传氧技术，可支持悬浮细胞高密度培养。细胞培养用塑料反应袋采用符合生物安全性的专用生物EVA膜，经过24kGy钴60幅照灭菌，通过内毒素残留检测，符合GMP生产条件的要求。培养液在菌塑料反应袋中产生激流式的冲刷，袋子内壁和培养液之间完成氧分的传递，从而达到高效的传氧、传质和混合的目的。该系统无气升装置、鼓泡或搅拌器，使剪切力最小化。一次性培养袋使用后就抛弃，可避免交叉污染、缩短批间处理周期，无需清洗、消毒、验证，极大地提高工作效率。
动物细胞大规模培养一般分为分批式(batch)、流加式(Fed-batch)、灌流式 (perfusion)三种操作模式 。当前公开发表的生产工艺占有主流优势的是利用反应器进行的悬浮培养，工艺设计是流加或灌流培养[米力，陈志南，动物细胞大规模培养生产蛋白的工艺选择，中国生物工程杂志，2003，23 (7) :1.]。无血清培养是当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养可简化分离纯化步骤，避免支原体、病毒污染造成的危害。[Anna F. Europa, Anshu Garnbhir, Peng-Cheng Fu, We1-Shou Hu. Multiple States with Distinct Cellular Metabolism in Contiuous Culture of mammalian Cells. Biotechnol Bioeng, 2000,67 (I) :25-34.]流加培养工艺是当前动物细胞大规模培养占有主流优势的培养工艺。在规模化的蛋白质生产中选择使用流加工艺(Fed-batch)的公司有，如美国的Genentech, IDEC, Medlmmune, Merck等。流加培养工艺中的关键技术是基础培养液和流加浓缩营养培养液的设计。1996年谢良志博士运用化学计量法，根据动物细胞生长的需求，设计定量添加浓缩的培养液。[Xie L Z, Wang D1. High cell density and high monoclonal antibody production medium design and rational control in a bioreactor. Biorechnol Bioeg,1996,51 :725-729.]
发明内容
本发明的目的是为了应用一种激流式生物反应器，一次性反应袋，无血清悬浮培养动物细胞(细胞包括重组CHO细胞、杂交瘤细胞等)生产重组蛋白的工艺控制方法。我们的优点是该激流式细胞反应器，成本低，操作控制简单，利于大规模扩大生产。通过细胞反应袋表面冲刷传氧，只需通入一定量空气(O.1 10L/min)和少量氧气，即可维持培养体系中溶解氧20 80% ;培养过程中只需对pH、溶解氧、温度进行在线监控；对细胞密度、活率、葡萄糖、谷氨酰胺、氨、乳酸含量，渗透压进行定时监测，采用自动控制系统进行流加补料。采用连续流加基础培养液的方法来提高细胞密度并扩大培养体积，再通过降低细胞培养温度和流加浓缩培养液来维持细胞密度和活率。如流程图所示，进行每一轮生产时，从一瓶工作细胞库细胞开始，在无血清培养液中悬浮培养，逐级扩增传代，在摇瓶扩增细胞后， 接种至50L激流反应器，再接种至300L反应器进行生产。生产期将持续7-21天，细胞密度 (6X IO6 2X 107cells/ml)，加入丁酸钠等已提高重组蛋白的表达量。培养结束时，收获液直接纯化。
1.细胞培养过程描述
工作细胞库细胞管从冷冻保存的液氮罐内取出，在约37°C快速融化，无菌条件下将细胞移入含有无血清培养液的T25方瓶中，并逐级扩增到T125方瓶。这个时候以及整个培养过程中的特定间隔，测量细胞密度和计算群体倍增水平(TOL)的样品都在无菌的条件下取出。T方瓶在37±2°C培养，细胞保持悬浮，密度维持在O. 5X IO6 2X 106cells/ml,当培养体积达到40ml将细胞移入摇瓶中，在37±2°C摇床中培养，(2 5天后)再以适当的细胞密度将细胞接入含有新鲜培养液的150ml摇瓶，(2 5天后)再以适当的细胞密度将细胞接入含有新鲜培养液的3L摇瓶，在适当的细胞密度(2 5天后)细胞接入6L摇瓶。 在适当的细胞生长时期(2 5天后)，6L摇瓶细胞接入带有气体(02、C02和N2)控制系统的50L反应器，50L反应器扩增至40L至50L体积，细胞密度维持在4X IO6 8X IO6Cells/ ml，用袋传袋地方法直接接种300L反应器，温度控制在37±O. 2°C，通过控制塔用C02和碳酸钠(碱)控制PH，用通入空气恒流来保持反应器内正向压力，用氧气通气量间隔时间来控制溶解氧含量高低。所有气体通过O. 22 μ m或更小孔径的膜过滤，葡萄糖要加入培养液中连续流加使糖含量保持在l_2g/L。并不断扩增培养体积，细胞达到较高密度O. 8 X IO6 2X107cells/ml,降温30 35°C开始生产期培养，流加浓缩的培养液成分的培养液使细胞保持活率，当细胞群体生长处于衰退期且细胞活率在40 80%时，停止培养。
2.细胞培养扩增的各步工艺参数包括
I)基础无血清培养液中葡萄糖起始浓度为3 6g/L ;浓缩的表达无血清培养液葡萄糖起始浓度为40 60g/L ;培养过程中葡萄糖浓度控制为I 2g/L ；
2)无血清培养液中谷氨酰胺起始浓度为2 4mM/L ;培养过程中谷氨酰胺下限为 O. 5 1. 5mM/L ；
3)培养过程乳酸的最高上限为5 20mM/L ；
4)冻存管存放在液氮中。T方瓶培养条件37°C 5% C02培养箱。摇瓶培养条件 37°C摇床，转速100 200rpm。收获方式无菌放料。收获时间细胞密度下降且活率在 40 80%时。
3.细胞培养原材料
所有生产原材料都必须按照GMP中规定 的程序，完成接收、鉴定、抽样、检验、测试和签发。表I列出重组药物细胞培养中所用原材料，必要的情况下相同材料也可以替代。
表I细胞培养原材料
权利要求
1.一种利用激流式生物反应器动物细胞生产重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1).用激流式生物反应器无血清悬浮培养动物细胞，起始接种细胞密度为O.5X106 4X106cells/ml ;根据细胞密度变化流加基础培养液进行扩增培养体积，使细胞密度维持在4X IO6 8X 106cellS/ml，当培养体积扩大到反应器最大培养体积的1/2 3/4时，开始将温度下降到30 35°C并流加浓缩培养液进行表达。
(2).培养过程工艺参数针对不同的细胞株生长代谢需求，通过监测细胞密度及活率，细胞溶液中渗透压，以及葡萄糖、谷氨酰胺、氨、乳酸含量，来控制流加营养物质的速率。
(3).蛋白降温表达过程中细胞由对数生长期进入平台期并维持7 21天，其产物浓度逐渐升高，当细胞群体生长处于衰退期且细胞活率在40 80%时，停止培养。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，此种方法可以用于重组蛋白的生产，包括单克隆抗体和融合蛋白等。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于，其中，使用的反应器为激流式生物反应器是指由控制塔、摇床、罐体、一次性塑料袋组成的反应系统；其特征在于，该反应器系统无气升、鼓泡或搅拌器装置，采用摇动的培养方式，使剪切力最小化。使用的反应容器为一次性塑料反应袋，避免罐体清洗、灭菌等工作。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述的细胞包括重组CHO细胞、杂交瘤细胞等适合悬浮培养的动物细胞。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于，其中，培养温度36 37°C、PH6. 7 7. 4、摇床转动速度30 60rpm、溶氧浓度(空气饱和度)为20 80%;所述控制流加营养物质的速率、培养温度、DO、PH采用细胞反应器控制系统进行在线自动控制。
6.根据权利要求1的方法，其特征在于，其中，培养过程中定时对细胞密度、活率、渗透压、葡萄糖、氨、乳酸含量进行监测。
7.根据权利要求1的方法，其特征在于，其中，所述配制流加用于细胞扩增的基础培养液和流加用于蛋白表达的浓缩培养液采用商品化培养液干粉添加一些营养成分和盐、大豆水解物、生长因子、重组人胰岛素，该培养液不包含任何牛源或猪源成分。
8.根据权利要求1的方法，其特征在于，其中，所述培养反应器中流加基础培养液后，细胞密度达到4X106 lX107cells/ml，细胞培养体积可扩增到50 300L，甚至更大体积；培养反应器中结合流加浓缩表达培养液后，细胞密度可达到8X IO6 2X 107cells/ml。
全文摘要
本发明公开了一种利用激流式生物反应器无血清培养动物细胞生产重组蛋白类药物的工艺过程及控制方法。该工艺采用流加基础培养液来提高细胞密度并扩大细胞培养体积。通过降低培养温度和流加浓缩的表达培养液来维持细胞密度和活率。从而高效、持续的获得重组蛋白。工艺控制方法主要针对不同细胞株生长代谢变化，对pH、溶解氧、温度变化进行在线监测；对细胞密度、活率、培养体系中葡萄糖、谷氨酰胺、氨、乳酸、渗透压进行定时检测。该方法特别适合大规模动物细胞悬浮培养。具有操作控制简单，传质传氧效率高，培养周期稳定、批次间结果差异小、生产成本低、容易实现大体积、高密度等优点。
文档编号C12M1/36GK102994442SQ201110265840
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月8日 优先权日2011年9月8日
发明者张秀芹, 刘铁成, 张雪亭, 王延涛, 杨威, 李会成 申请人:哈药集团技术中心