一株有效降解己烯雌酚的枯草芽孢杆菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及利用微生物进行环境治理领域，具体设及一株可降解己締雌酪的枯草 芽抱杆菌。
【背景技术】
[0002] 己締雌酪（diet的Istnbestrol，DES)是一种人工合成的非酱体雌激素类药物， 曾被用作提高动物生产性能的药物。DES作为一种内分泌干扰物，能够引起肝脏损伤，发育 早熟，基因突变W及激素失调，女性乳腺癌、卵巢癌等疾病。由于其对激素系统有影响，对 机体具有慢性毒性，美国抑A和中华人民共和国农业部均规定禁止其使用于动物性食品生 产。
[0003] 目前己締雌酪的残留问题仍然很严重，加泰罗巧亚地区的污水处理厂排出的废水 中DES的含量为34ng/l，高舒樹等对南阳市市售鸡肉随机抽取检测的40份样品中均检出 了DES，残留量最高的达10mg/kg。动物养殖户违规使用，化学排放，污水处理厂和垃圾填 埋场等都可能导致DES残留于动物性食品、水体和±壤环境中。近年来，降解或消除DES的 方法已受到广泛关注。
[0004] 微生物降解法被认为是消除有害化合物污染的有效方法，筛选高效降解DES的功 能微生物是实现减少或消除环境中DES的有效方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一株可有效降解己締雌酪的菌株一枯草芽抱杆菌（ifeciWus subtilis)。
[0006] 本发明所提供的降解菌株为枯草芽抱杆菌（公JF，保藏于中国 普通微生物菌种保藏管理中屯、，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏号为CGMCC No. 7950,保藏日期为2013年7月22日。
[0007] 所述枯草芽抱杆菌降解DES的步骤为；1)菌株JF活化；挑取枯草芽抱杆菌JF于 LB培养基上划线，30 °C培养24h。
[000引 2)菌株JF降解DES;用无菌生理盐水将LB培养基上的菌苔洗脱并混匀制备菌悬 液。移取1血菌悬液接种于装有29血LB培养基冷0.2%吐温80)的250血S角瓶中， 加入DES至一定浓度，血生理盐水代替菌悬液为空白对照。30 °C、180r/min振荡培 养，定时取样，提取DES，采用HPLC测定DES降解率。
[0009] 所述微生物降解DES体系中DES的提取方法为：准确移取1mL均匀培养液于10 血刻度试管中，用甲醇定容至10血，于超声波清洗器（AS10200A)中超声提取20min;混 匀，取1. 5血样品12 000r/min离屯、15min,将上清液用0. 45ym有机相滤膜过滤，弃 去初滤液约0. 5血，收集续滤液为样品溶液，供HPLC分析用，分析仪器为LC-10A2010CHT 型高效液相色谱仪。
[0010] 所述微生物降解体系中DES检测方法为；LC-10A2010CHT型液相色谱系统，S巧ax GP-C18柱（150mmX4. 60mm，5. 0ym)为色谱柱，甲醇：水（7:3;v/v)为流动相，流速0. 7 血/min,进样量10uL，用紫外检测器在242皿处检测。
[0011] 本发明所用培养基为LB培养基；酵母膏5g、蛋白腺10g、氯化钢10g、水1000 血，调节抑至7.0,121 °C灭菌15min。
[0012] 与现有技术相比，本发明的积极效果是；枯草芽抱杆菌属于"公认安全"的菌种，该 枯草芽抱杆菌降解DES，具有降解速度快、费用低、操作步骤简单等优点，为彻底清除环境中 的DES残留提供了良好的菌源和思路。
【附图说明】
[001引图1为降解菌株JF处理前后DES的HPLC谱图，图中0h为含接种JF的25mg/L DES的LB培养基中立刻取样处理得到的HPLC检测的色谱图，5d为培养5d后取样处理得 到的HPLC检测的色谱图。
[0014] 图2为降解菌株JF作用于25 mg/L DES的降解曲线。
[0015] 图3为降解菌株JF对不同浓度DES的降解能力。
【具体实施方式】
[0016] 实例1;不同培养时间对菌株JF降解DES的情况。
[0017] 种子液制备；挑取JF菌种于LB平板上划线，于30 °C恒温培养箱中培养24h后 挑取单菌落在LB斜面培养基上划线，30 °C恒温培养箱中培养24h;用无菌生理盐水将斜 面培养基上的JF菌苔洗脱并混匀制成种子液(菌浓度约为108CFU/mL)。
[0018] 取1血种子液接种于250血S角瓶装有29血DES浓度为25mg/L的含0.2% 吐温80的LB培养基中，血生理盐水代替种子液为空白对照，30 °C、180r/min振荡 培养9d，每24h取样，用甲醇作提取溶剂，超声提取，HPLC检测DES浓度。降解菌株JF处 理前后DES的HPLC谱图如图1所示；降解菌株JF作用于25mg/LDES的降解曲线如图2 所示。菌株JF对DES具有明显的降解作用，9d内可完全降解25mg/LDES。
[0019] 所述DES提取方法为；准确移取1mL均匀培养液于10mL刻度试管中，用甲醇定 容至10血，于超声波清洗器（AS10200A)中超声提取20min;混匀，取1. 5血样品12 000 r/min离屯、15min,将上清液用0.45ym有机相滤膜过滤，弃去初滤液约0.5血，收集续 滤液为样品溶液，供HPLC分析用，检测仪器为LC-10A2010CHT型高效液相色谱仪。
[0020] 所述HPLC检测方法为；LC-10A2010CHT型液相色谱系统，S巧axGP-C18柱（150 mmX4. 60mm，5. 0ym)为色谱柱，甲醇：水（7:3v/v)为流动相，流速0. 7血/min,进样量 10UL，用紫外检测器在242皿处检测。
[0021] DES降解率的计算公式为：
【主权项】
1. 一株枯草芽孢杆菌（strain)JF，其特征在于保藏于中国普通 微生物菌种保藏管理中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏号为CGMCCNo. 7950,保藏日期为2013年7月22日。
2. 权利要求1所述枯草芽孢杆菌（strain)JF，其特征在于：可有 效降解己烯雌酚，为环境中己烯雌酚的残留降解或消除提供良好菌源。
【专利摘要】本发明涉及利用微生物进行环境治理领域，具体涉及一株可代谢己烯雌酚的枯草芽孢杆菌。可代谢己烯雌酚的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株号为JF，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）登记保藏；保藏日期：2013年7月22日，保藏编号：CGMCC No.7950。可代谢己烯雌酚的枯草芽孢杆菌能够有效降解己烯雌酚，用本菌株可开发相应的环保生物制剂，具有良好的应用前景。CGMCC No.795020130722
【IPC分类】A62D3-02, A62D101-28, C12N1-20, C12R1-125
【公开号】CN104774798
【申请号】CN201510220160
【发明人】刘书亮, 邓维琴, 文涛, 何利, 韩新锋, 周康, 刘韫滔
【申请人】四川农业大学
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年5月4日