专利名称：：己烯雌酚检测试剂盒及检测方法
技术领域：
：本发明涉及生物工程
技术领域：
，尤其涉及一种己烯雌酚检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
：己烯雌酚(Diethylstibestrol，DES)是人工合成的雌激素，由于其具有促进动物增重，增加蛋白质沉积和减少脂肪沉积的作用，曾被广泛作为鱼饲料添加剂使用，提高鱼饲料转化率，促进鱼类生长。20世纪70年代以来，人们通过实验发现，DES具有致畸和致癌的毒性。目前，世界上许多国家已规定在畜禽及水产养殖中禁用DES，2002年我国农业部规定取消DES及其盐、酯制剂在所有食品动物的所有用途。然而，受经济利益的驱使，养殖商违禁添加己烯雌酚的情况仍然存在，严重影响我国畜产品、水产品在国际上的声誉，造成了重大经济损失。为了确保动物食品安全和我国畜牧水产品出口贸易的畅通，建立快速、灵敏的检测技术成为当务之急。传统的药物残留分析方法包括气相色谱、液相色谱、质谱等，这些方法所需仪器价格昂贵，实验过程繁琐，很难达到快速、简便的现场检测要求。目前，在药物残留快速检测中得到广泛应用的有微生物法和酶联免疫法，但是，这两种方法对于检测禁用药物在灵敏度上常常达不到要求。以化学发光免疫分析(ChemiluminescenceImmunoassay,CLIA)为代表的快速筛选法为免疫学主流技术，但目前国内外尚无利用化学发光免疫分析(CLIA)方法检测己烯雌酚的报道。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种己烯雌酚的化学发光免疫分析(CLIA)试剂盒，该试剂盒不仅可以实现快速、大批量检测，而且检测特异性和灵敏度显著提高。此外，还需要提供一种上述试剂盒的检测方法。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一个方面，提供了一种己烯雌酚检测试剂盒，包括检测板、试剂，所述试剂包括抗体，所述抗体是用己烯雌酚与牛血清白蛋白的偶联物作为免疫原制备出的单克隆抗体。免疫原采用己烯雌酚与牛血清白蛋白的偶联物，是因为抗体制备时，只有抗原分子量较大的化合物(>5000D)注射到动物体内时才能诱导动物体内产生抗体。如果是小分子量的化合物(这类化合物叫半抗原)，不能直接诱导动物产生抗体，而为了制得抗体，需将该小分子化合物偶联于大分子载体(如牛血清白蛋白，BSA)上制得抗原，再将其用于免疫动物，制备抗体。所述检测板的各孔包被有包被抗原，该包被抗原为为己烯雌酚与卵清白蛋白的偶联物。本发明采用己烯雌酚与卵清白蛋白的偶联物作为抗原包被检测板各孔，然后加入经前处理过的待测样品和抗己烯雌酚单克隆抗体，让包被抗原和待测样品两者竞争抗体以检测样品中的己烯雌酚。优选的，所述检测板为化学发光板，适用于化学发光免疫分析检测。优选的，本发明试剂盒中的试剂还包括酶标二抗，该酶标二抗包括辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG浓缩液。优选的，本发明试剂盒中的试剂还包括底物反应液，该底物反应液包含Tris-HCl缓冲液、鲁米诺、对羟基苯丙烯酸和过氧化氢。优选的，本发明试剂盒中的试剂还包括己烯雌酚标准品溶液。优选的，本发明试剂盒中的试剂还包括浓缩洗涤液，该浓缩洗涤液包含吐温和磷酸盐缓冲液。在本发明的另一方面，还提供了一种己烯雌酚的检测方法，包括以下步骤前处理待测样品；用上述试剂盒检测样品；分析检测结果。所述前处理待测样品的步骤包括将待测样品打碎并用乙酸乙酯提取，乙酸乙酯提取物经氮气吹干后，剩下的残留物用正己烷溶解，再加入磷酸缓冲液和甲醇的混合溶液振荡离心，取下层溶液用于检测。本发明己烯雌酚检测试剂盒，具有下列优点(1)特异性强，敏感性高，安全性好。本发明检测动物源性食品中己烯雌酚的化学发光免疫分析(CLIA)试剂盒，以己烯雌酚的单克隆抗体为基础，该抗己烯雌酚单克隆抗体不含针对载体蛋白的抗体，只与己烯雌酚及己烯雌酚的修饰物结合，不与动物其它抗生素药物和消毒药发生交叉反应。因此，本发明试剂盒具有很高的特异性和敏感性，检测灵敏度达0.016ppb。(2)操作简便快速。使用己烯雌酚化学发光免疫分析试剂盒检测己烯雌酚时，无需另配其它试剂，样品无需无菌处理，按试剂盒说明在3-4小时内即可判定检测结果。(3)结果判定准确、可靠。本发明己烯雌酚化学发光免疫分析检测试剂盒以多功能酶标仪机读数定量显示检测结果，减少主观性，准确可靠。(4)成本低，投资少。本发明己烯雌酚化学发光免疫分析检测试剂盒可批量检测，一步到位，成本低廉，投资少，见效快。下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。图1是本发明实施例3的DES检测样品的标准曲线图。具体实施例方式本发明的己烯雌酚检测试剂盒，包括检测板、试剂，所述试剂包括抗体，该抗体是用己烯雌酚与牛血清白蛋白的偶联物作为免疫原制备出的单克隆抗体。运用本发明试剂盒检测动物源性食品中的己烯雌酚，能显著提高检测灵敏度，其检测分析原理是化学发光板上的每个孔均包被有相同量的己烯雌酚与卵清白蛋白偶联物(DES-0VA)抗原，加入待测己烯雌酚样品和己烯雌酚单克隆抗体后，包被抗原和待测己烯雌酚样品一起竞争己烯雌酚抗体，由于每个孔中的固相抗原和加入的抗体含量均一致，所以当待测的己烯雌酚浓度高时，则被结合在固相抗原上的抗体少，加入的酶标二抗与被固定抗体结合量少，用洗涤液洗涤后加入底物反应液，发光值低，表明抑制率高；反之，当待测的己烯雌酚浓度低时，则所测的发光值高，表明抑制率低。根据用已知的己烯雌酚浓度检测所作的标准曲线，可以推算出待测样品的己烯雌酚浓度。实施例1单克隆抗体的制备(1)免疫原的制备将己烯雌酚(DES)与牛血清白蛋白进行偶联，得DES-BSA偶联物即为免疫原。(2)单克隆抗体制备将上述合成的免疫原免疫小鼠，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，在小鼠腹部皮下多点注射，以后每隔两周，用免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合制成的乳化剂加强免疫一次，免疫部位为颈背部皮下，从第三次免疫开始，每次免疫后一周从小鼠眼眶采血检测血清效价。总共免疫5次，最后一次免疫后一周将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，再经过4次亚克隆，筛选到能稳定分泌己烯雌酚单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过体外培养法，收集细胞培养上清，经离心后去除细胞碎片，上清液-20°C保存备用。采用体内诱生腹水法，给小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7-14天后腹腔注射杂交瘤细胞5X105106个/只，7-14天后采集腹水。将腹水离心，弃脂肪层和细胞层，收集中间的澄清层，-20°C保存备用。用35%的饱和硫酸铵盐析法粗提细胞培养上清和腹水，最后用DE-52阴离子交换层析法进一步纯化，得较纯的己烯雌酚单克隆抗体。将单克隆抗体制成工作液100x己烯雌酚单抗(一抗)浓缩液为2ill和50ill牛血清加入148ill灭菌的50%甘油水中。抗体稀释缓冲液5%牛血清的0.05%吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液(pH7.4)。单抗(一抗)浓缩液用抗体稀释缓冲液稀释100倍成单克隆抗体工作液。实施例2己烯雌酚检测试剂盒中检测板和试剂的制备在该实施例2中，己烯雌酚检测试剂盒内设有检测板、己烯雌酚标准品溶液、己烯雌酚单克隆抗体、酶标二抗、底物反应液、样品稀释液、浓缩洗涤液，其具体制备如下(1)己烯雌酚微孔检测板的制备用pH9.6的0.2M碳酸盐缓冲液作包被液，将己烯雌酚与卵清白蛋白偶联物(DES-0VA)稀释至200ng/ml，按100111/孔加入化学发光孔板中，41包被过夜。甩干，按200yl/孔加入含明胶，pH7.4的磷酸盐缓冲液37°C封闭2小时，用叠氮钠，pH7.4的磷酸盐洗涤液洗3次，甩干，装入含干燥剂的包装袋中保存。(2)DES标准溶液的配制精确称取DESlmg，先用甲醇溶解并作5倍梯度稀释，然后按PBS甲醇=32(v/v)加入含0.05%吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液配制系列浓度为31.25、6.25、1.25,0.25,0.05ng/ml的标准DES溶液。(3)底物反应液的配制底物显色液配制成分及比例为0.1MpH8.5Tris-HCl缓冲液(Tris6.057g,pH8.5，定容500ml)lml，2mM鲁米诺(0.1758g鲁米诺溶于2mlDMSO中)4ii1，0.25mM增强剂对羟基苯丙烯酸(0.2g对羟基苯丙烯酸溶于3ml无水乙醇中)0.625ia，4mM过氧化氢1.6y1。(4)样品稀释液、浓缩洗涤液样品稀释液为IXPBS-甲醇(32，v/v)即取0.01MpH7.4磷酸盐缓冲液(KH2P040.2g,KCl0.2g，Na2HP0412H202.9g，NaC18.0g，定容lOOOmL)60mL与无水甲醇40mL混合；10X浓缩洗涤液为含0.05%吐温-20的0.1M磷酸盐缓冲液(KH2P042g，KC12g，Na2HP0412H2029g,NaCl80g，定容至1000ml,pH7.4，Tween_205mL)。(5)酶标二抗为100x辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG浓缩液。实施例3运用本发明试剂盒检测己烯雌酚(1)样品前处理动物组织(鸡、猪)、鱼、虾肉样品的前处理①取3g样品置于离心管中，加入9ml乙酸乙酯，在勻质机下充分打碎；②然后加入0.3gCaCl2，最大速度振荡3min；室温条件下，6000rpm离心5min；③移取6ml上清到另一新的试管，60-70°C水浴氮气吹干；④残留物用2.0ml的正己烷溶解，再加入1.0ml的IXPBS-甲醇(32，v/v)，漩润振荡2min；⑤室温条件下，6000rpm离心lOmin，吸除上层正己烷，取50yl下层溶液用于检测。(2)试剂盒检测步骤如下①将10X浓缩洗涤液稀释10倍即洗涤液，将一抗、二抗用抗体稀释缓冲液进行10倍稀释；②于已经封闭好的化学发光板的适当微孔中分别加入50yl/孔配好的系列DES标准溶液(31.25,6.25、1.25,0.25,0.050ppb)，在另外的微孔中加入50u1已完成前处理的样品溶液，还在一孔中加入100yl洗涤液作不加单抗的对照孔用于测定发光值时的对照孔。③除对照孔外，再于每一微孔中加入50u1适当稀释的DES单克隆抗体，37°C孵育90分钟，甩干，每孔加洗涤液300ia，洗涤3次，每次间隔2分钟，拍干；④每孔加入100ill的HRP酶标羊抗鼠(二抗)工作液，37°C孵育90分钟，甩干，每孔加洗涤液300ia，洗涤3次，每次间隔2分钟，拍干；⑤每孔加入150u1底物反应液2分钟内读取化学发光数值。(3)结果判定标准先计算DES标准样品抑制率(B/BJ，然后以抑制率为纵坐标，以DES标准样品浓度的对数值为横坐标，做标准曲线。根据每个检测样品的B/^值就可从标准曲线上读出其相对应的DES的浓度。再乘以相应稀释倍数。1)标准曲线与灵敏度以抑制率I为纵坐标，DES标准溶液浓度的对数值为横坐标，绘制出标准曲线(见图1)。抑制率I=B/B0(B为标准品化学发光值或样品化学发光值，B。为空白对照化学发光值)。从图1可以看出，DES在0.05ng/ml-31.25ng/ml范围内的B/B。(又称相对吸光值)与DES浓度的对数值呈线性关系，进行回归分析，回归方程为Y=-0.2632X+0.4505，R2=0.9904，IC50值为0.649ng/ml，用BfSSD外推法计算得本发明试剂盒的检测灵敏度为0.016ppb(ng/ml)。2)结果再现性以批内误差和批间误差来表示该方法的精确度。①批内误差每一标准样品浓度作5次重复，以其批内变异系数表示批内误差。②批间误差重复已建立的测定操作，连续作5次，以其批间变异系数表示批间误差。CV%=结合率(B/BJ的SD的平均值/(1.414X平均批内结合率)X100%。批间误差，求5次测定的结合率的平均值，并求SD，按上述公式求其总的批间变异系数(CV)。批内变异CV%=4.23%，批间变异CV%=6.60%，重复性好(见表1)表1标准曲线批内和批间的误差<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3)回收率计算取在3g空白黄鳝肉样中加入DES标样，添加量分别为25ng/g、10ng/g、2ng/g，各添加浓度样品作三个重复，进行样品前处理，提取液进行化学发光测定。测定发光值后计算相对吸光值，从标准曲线上求出浓度值，以回收率确定其准确度(见下表2)。表2黄鳝肉样DES添加回收试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>其它种类样品回收率见下表表3其它种类样品回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>4)结果特异性判断试剂盒特异性的指标是交叉率，因此针对药物进行特异性交叉反应测试。利用化学发光免疫分析(CLIA)测定出DES及DES类似化合物、畜禽产品、水产养殖中部分常见禁用激素和抗菌药物的交叉反应率，结果如下表4。结果表明，本发明试剂盒中的DES单抗除了与己烯雌酚单羧丙基醚有交叉反应外，与其他药品都无交叉反应。表4DES及DES类似化合物和其它水产养殖禁用药物的交叉反应<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。权利要求一种己烯雌酚检测试剂盒，包括检测板、试剂，所述试剂包括抗体，其特征在于，所述抗体是用己烯雌酚与牛血清白蛋白的偶联物作为免疫原制备出的单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测板的各孔包被有包被抗原，该包被抗原为己烯雌酚与卵清白蛋白的偶联物。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述检测板为化学发光板。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂还包括酶标二抗。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂还包括底物反应液，该底物反应液包含Tris-HCl缓冲液、鲁米诺、对羟基苯丙烯酸和过氧化氢。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂还包括己烯雌酚标准品溶液。7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂还包括浓缩洗涤液，该浓缩洗涤液包含吐温和磷酸盐缓冲液。8.一种己烯雌酚的检测方法，其特征在于，包括以下步骤前处理待测样品；用权利要求1所述的试剂盒检测样品；分析检测结果。9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述前处理待测样品的步骤包括将待测样品打碎并用乙酸乙酯提取，乙酸乙酯提取物经氮气吹干后，剩下的残留物用正己烷溶解，再加入磷酸缓冲液和甲醇的混合溶液振荡离心，取下层溶液用于检测。全文摘要本发明公开一种己烯雌酚化学发光检测试剂盒，包括检测板、试剂，所述试剂包括抗体，该抗体是用己烯雌酚与牛血清白蛋白的偶联物作为免疫原制备出的单克隆抗体。本发明己烯雌酚检测试剂盒，不仅可以实现快速、大批量检测，而且具有很高的特异性和敏感性，检测灵敏度达0.016ppb。文档编号G01N33/577GK101799472SQ201010132778公开日2010年8月11日申请日期2010年3月25日优先权日2010年3月25日发明者刘迎春,王权,蒋蔚,赵新宇,陈永军,顾惠明申请人:中国农业科学院上海兽医研究所