专利名称：：一种双烯雌酚的检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测双烯雌酚(dienoestrol，DEN)的检测试剂盒及其检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析(Timeresolvedfluoroisnmunoassay，TRFIA)
技术领域：
，用于食品和饲料中双烯雌酚药物残留量的检测。
背景技术：
：双烯雌酚是一种与己烯雌酚结构类似的人工合成的具有酚羟基结构的二苯乙烯类雌性激素，有与内源性激素相似的生物效应而被广泛地应用于临床中。近年来，许多国家将其加入到动物饲料中，以提高家禽家畜的饲养效率。动物通过食物获得的雌性激素一部分被排泄到环境中，一部分在动物体内残留，并通过食物链在人体内富集。激素类药物残留会使正常人的生理功能发生紊乱，更严重的是影响儿童正常的生长发育，引发动物和人的癌症和致畸毒性，而且妊娠期间使用还能引起后代生殖系统疾病。由于其致癌作用，我国和FDA、欧盟、美国、日本、加拿大已禁止己烯雌酚在饲料中的使用。目前国内使用较多的为己烯雌酚，国家规定动物组织中不得检出己烯雌酚，双烯雌酚已证实为己烯雌酚的代谢产物。因此，快速准确检测雌性激素对于估计食品安全的潜在因素是很必须的。双烯雌酚的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱/质谱法(GC/MS)和酶联免疫检测方法(ELISA)等。通常以ELISA作为在现场抽样快速筛选检验方法，HPLC或GC-MS作为确证性检验方法，目前，我国检测机构所用双烯雌酚ELISA检测试剂盒多为国外进口，其价格昂贵，很难在国内推广应用。国产双烯雌酚ELISA试剂盒普遍存在灵敏度不高、假阳性率高、不稳定等问题。时间分辨荧光免疫分析检测技术是近来发展迅速的高灵敏检测手段。TRFIA其原理是利用具有双功能基团结构的螯合剂，其一端和镧系元素结合，另一端和抗体(抗原)上的自由氨基连接，制成Eu"标记抗体(抗原)，它与待测样品中的抗原(抗体)结合成免疫复合物。理想情况下，测定复合物中镧系元素的荧光强度就能确定样品中抗原的含量，但实际上这种复合物的荧光强度相当弱，只有再加入一种增强溶液(Enhancementsolution)，使镧系元素从复合物中解离下来，并与增强液中所含的P-奈甲酰三氟丙酮(P-NTA)重新形成微胶囊，在紫外光的激发下发射很强的荧光，增强效果上百万倍。用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，即可确定样品中抗原的量。
发明内容本发明的目的在于提供一种双烯雌酚试剂盒及检测方法，用于定性或定量地检测食品和饲料中双烯雌酚的残留量；检测时间短、平均回收率高、批内、批间误差小，并具有简便、快速、准确的特点。本发明的技术方案该检测双烯雌酚的试剂盒是由1、多孔包被板，2、缓冲液，3、双烯雌酚标准溶液，4、双烯雌酚的抗体，5、铕标记的羊抗兔抗体，6、洗涤液，7、增强液所组3成。本发明主要采用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)来检测DEN。采用TRFIA的技术主要有两个方面第一，特异性多克隆抗体的制备，利用抗原免疫家兔，获得含有抗体的血清，经过生化提纯分离免疫球蛋白；第二，Eu"标记抗体的制备。测定方法为测定的基础是标记免疫反应。包被有DEN-载体蛋白的微孔板，加入DEN标准溶液或已处理好的样品处理液到各自的微孔中、再加入DEN抗体，振荡反应，游离的DEN与微孔板上的DEN-载体蛋白竞争DEN抗体，洗涤液洗涤，没有连接的DEN抗体在洗涤步骤中被除去。加入Eu3+-羊抗兔抗体，进行标记免疫反应，再用洗涤液洗涤，反应后没有连接的￡1!3+-羊抗兔抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后，在紫外光的激发下发射很强的荧光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的浓度成反比，对照标准曲线即可确定样品中DEN的量。本发明的有益效果该试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，可以达到0.Olng/mL以上。图1:检测双烯雌酚的试剂盒示意图。1、多孔包被板，2、缓冲液，3、双烯雌酚标准溶液，4、双烯雌酚的抗体，5、铕标记的羊抗兔抗体，6、洗涤液，7、增强液。图2:DEN-TRFIA标准曲线图。具体实施例方式实施例1:制备试剂盒和检测动物组织样品免疫抗原的制备本发明所述的人工免疫抗原为改造双烯雌酚(DEN)成为双烯雌酚半琥珀酸酯(DEN-HS)，再采用混合酸酐法与大分子载体蛋白结合，以合成的DEN-HS-BSA作为免疫抗原进行动物免疫。称取20mglOOmg双烯雌酚(DEN)，加入5mL吡啶后，加入10mg50mg琥珀酸，室温，搅拌过夜，反应完成，用酸水洗涤，抽滤沉淀，干燥，得双烯雌酚半琥珀酸酯(DEN-HS)。载体蛋白采用牛血清白蛋白(BSA)。称取30mg300mg牛血清白蛋白，溶解于50%二氧六环水溶液6mL10mL中，调pH值为910，为A液；称取10mg50mgDEN-HS，溶于2mL二氧六环中，置4°C10min，依次加入三正丁胺20yL和氯甲酸异丁酯10yL，于4°C搅拌30min，作为B液。将A液在fC滴入B液，搅拌过夜。将反应液对蒸馏水透析72小时，期间换蒸馏水5次。或萄聚糖凝胶G50(S印hadexG50)柱提纯，以0.05mol/LpH8.0碳酸盐缓冲溶液洗脱。收集透析纯化液或第1峰的柱洗脱液，分装保存于-2(TC作免疫原用。双烯雌酚多克隆抗体的制备将上述合成的双烯雌酚-牛血清白蛋白结合物(DEN-BSA)作免疫抗原，采用皮内或皮下多点注射方式，接种1kg1.5kg雄性新西兰兔；每隔4周免疫1次，第一次免疫时，在免疫原中加等量弗氏完全佐剂混匀制成乳剂，以后免疫均加等量弗氏不完全佐剂；自第二次免疫开始，每次免疫后810天采血测试抗血清效价。观察抗血清效价增长情况，达到满意效价时将取全血，分离血清。抗血清经过3次硫酸铵沉淀后，再用层析柱分离纯化，对磷酸盐缓冲溶液透析。吸取抗血清10mL，平衡至室温，加入等量的0.01mol/LpH7.8磷酸盐缓冲溶液，充分混匀，加入20mL饱和硫酸铵溶液(以浓氨水调至pH7.8)，摇匀，4"静止1小时后，以5000转/分钟离心5分钟，去上清液。沉淀物用20mLO.Olmol/LpH7.8磷酸盐缓冲溶液溶解，然后加入10mL饱和硫酸铵溶液(pH7.8)，摇匀，4"静止30分钟后，以5000转/分钟离心5分钟，去上清液。重复盐析两次。最终以2mL0.01mol/LpH7.8磷酸盐缓冲溶液溶解免疫球蛋白IgG沉淀物，装入透析袋，对2000mL0.01mol/LpH7.2磷酸盐缓冲溶液透析12小时。将上述透析液，加入到约25克湿重的纤维素DEAE-52(取纤维素DEAE-52干粉10克，用500mL0.01mol/LpH8.0的磷酸盐缓冲溶液浸泡过夜，4t:平衡1小时，每10分钟搅拌一次，倾入布氏漏斗中，用pH8.0的0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液洗滤。收集滤液，再对O.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲溶液透析12小时，最后加入适量甘油_201:保存。Eu3+_羊抗兔抗体的制备取溶解于50mmol/LPBSpH7.0的5g/L羊抗兔抗体lmL2mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.15mol/LNaCl的50mmol/LNa2C03-NaHC03pH8.5缓冲液。收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量(1.46A28。-0.74A26。)，用上述洗脱液稀释羊抗兔抗体至2g/L。取500iiL1000iiL稀释后的羊抗兔抗体加入含0.2mg0.4mg的Eu3+_N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)的小瓶中，30。C磁力搅拌反应20小时。反应液经用80,1/LTris-HClpH7.8缓冲液平衡的S印haroseCL-6B柱(1X40cm)层析，A28。监测收集蛋白峰，稀释分装备用。固相抗原包被板制备将双烯雌酚-卵清白蛋白结合物(DEN-OVA)用50mmol/LNa2C03-NaHC03pH9.6缓冲液稀释至10mg/L的包被液，96(或48)孔微孔板各孔加100yL，4。C放置过夜。弃去包被液，冲洗三次，加150iiL含3g/LBSA的上述缓冲液封闭，4t:放置过夜。弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-2(rc冷冻保存。试剂的配制(1)双烯雌酚(DEN)标准溶液:(Ong/mL，0.lng/mL，lng/mL，10ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL)，从DEN纯品中稀释得到，稀释液为0.lmol/LpH7.5磷酸盐缓冲液。(2)缓冲液8mmol/LNaCl、0.2%0VA、50iimol/L二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、0.lmL/LTween-80禾P0.1%NaN3的Tris—HClpH7.8。(3)洗涤液:14.5mmol/LNaC1、0.2mL/LTween-80和0.2%NaN3的50,1/LTris-HClpH7.8。(4)增强液的配制1LpH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15ymolP_萘甲酰三氟丙酮(P-NTA)，50iimol三正辛基氧化膦(T0P0)，lmL曲拉通X-100(TritonX-100)。试剂盒提供的试剂每一个盒中的试剂足够进行96个测量，盒中的材料如下(1)1X96孔板(8条X12孔，可以拆分为单孔)包被有DEN-OVA。(2)6XDEN标准液，1.OmL/瓶，标准液浓度为0ng/mL，0.lng/mL，lng/mL，10ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL。(3)1XDEN抗体，用时0.5mL蒸馏水溶解。5(4)1XEu3+_羊抗兔抗体冻干品，用时0.5mL蒸馏水溶解。(5)IX增强液15mL。(6)IX洗涤液30mL，用时以蒸馏水1:25稀释。(7)1X缓冲液30mL。实验室应自备的试剂(1)蒸馏水或去离子水；(2)无水乙醚；(3)三氯甲烷；(4)正己烷；(5)氢氧化钠溶液0.Olmol/L;(6)磷酸溶液磷酸(85%)+水(1+1);(7)甲醇;(8)磷酸盐缓冲液pH7.2，取1.45g磷酸氢二钠(含12个结晶水)、0.lg磷酸二氢钾(无水)、8.Og氯化钠，溶解于水中并定溶至1000mL;(9)甲醇_pH7.2磷酸盐缓冲液(1+4)。测定之前注意事项(1)使用之前将所有试剂回升至室温(18°C30°C)。(2)使用之后立即将所有试剂放回2°C8°C。(3)如果样品量大，建议使用多通道移液器。(4)在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔。(5)取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中，并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2°C8°C。具体检测步骤如下称取4g猪肉试样(精确至O.lg)，置于试管中，加入10mL无水乙醚振摇20min后，以3500r/min离心3min，将提取液转移至另一干净试管中，重复上述操作一次，合并乙醚提取液，于4(TC水浴蒸发至近干。用4mL三氯甲烷溶解残渣，然后加4mL氢氧化钠溶液振摇20min，静置分层后将氢氧化钠溶液层转移至另一干净试管内，重复上述操作一次，合并氢氧化钠溶液层。加入8mL正己烷，剧烈振摇，待分层后弃去正己烷层。用磷酸溶液调整溶液pH至7.0。每次用8mL无水乙醚提取2次，合并乙醚层并蒸发至近干。用4mL甲醇-pH7.2磷酸盐缓冲液溶解残留物供测定。取DEN-OVA板条，加入50yL的DEN标准溶液或处理好的样品处里液到各自的微孔中，每个标准溶液和样品必须使用新的吸头，加缓冲液l:20稀释的DEN抗体50iiL，25t:振荡1小时，洗涤液洗三次，加缓冲液1:20稀释的Eu3+-羊抗兔抗体100iiL，25t:振荡1小时，用洗涤液洗六次，加200iiL增强液振荡5分钟后测量。从标准曲线计算样品中的DEN含量，见表1和图2，该例的样品浓度为0.23ng/mL。表16<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施实例2制备试剂盒和检测饲料样品。DEN-BSA抗原制备称取20mglOOmg双烯雌酚(DEN)，加入5mL吡啶后，加入10mg50mg琥珀酸，室温，搅拌过夜，反应完成，用酸水洗涤，抽滤沉淀，干燥，得双烯雌酚半琥珀酸酯(DEN-HS)。称取12mgDEN-HS、40mgN_羟基琥珀酰胺(NHS)、35mg碳二亚胺(EDC)溶于N，N'_二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌24h，制成A液；称取50mgBSA溶于3mL0.Olmol/mLpH7.4PBS中，制成B液。将A液逐滴加入B液，边加边搅拌，室温反应3h，将反应液蒸馏水中透析72小时，期间换蒸馏水5次。或经萄聚糖凝胶G50(S印hadexG50)柱提纯，以0.05mol/LpH8.0碳酸盐缓冲溶液洗脱。收集透析纯化液或第1峰的柱洗脱液，分装保存于-2(TC作免疫原用。多克隆双烯雌酚抗体的制备与实施例1相同，略。Eu3+_羊抗兔抗体的制备与实施例1相同，略。固相抗原包被板的制备与实施例1相同。试剂的配制与实施例1相同。试剂盒提供的试剂与实施例1相同。实验室应自备的试剂与实施例1相同。测定之前注意事项同实施例1。具体检测步骤同实施例1。实验室应自备的试剂(1)蒸馏水或去离子水；(2)无水乙醚；(3)三氯甲烷；(4)甲醇;(5)磷酸盐缓冲液PH7.2，取1.45g磷酸氢二钠(含12个结晶水)、0.lg磷酸二氢钾(无水)、8.Og氯化钠，溶解于水中并定溶至lOOOmL;(6)0.2mol/L的乙酸铵缓冲液15.4g乙酸铵溶解于900mL水中，用冰乙酸调节pH，使其至pH5.2p±H0.2，定容至1L;(7)1.Omol/L氢氧化钠溶液；(8)0.lmol/L氢氧化钠甲醇溶液+水(7+3);(9)甲基叔丁醚+甲醇(9+1，含2%甲酸)溶液；(10)固相萃取柱OasisMAX柱(60mg，3mL)或相当者。(11)甲醇-pH7.2磷酸盐缓冲液(1+4)。测定之前注意事项同实施例1。具体检测步骤如下准确称取5.0g±0.lg动物饲料于50mL具盖的离心管中，加入lOmLO.2mol/L的乙酸铵缓冲液，均质lmin，加入10mL乙醚，漩涡震荡提取3min，于3500r/min离心5min，吸取乙醚层于另一试管中。重复乙醚提取一次，合并乙醚层，常温下用氮气吹干。加入2mL三氯甲烷溶解残余物，加入5mL1.Omol/L氢氧化钠溶液，漩涡震荡lmin，于1500r/min离心5min，上层水相移入另一试管中，重复氢氧化钠溶液提取一次，合并氢氧化钠提取液。合并的氢氧化钠提取液过MAX固相萃取柱，流速2mL/min，依次用5mL1.Omol/L氢氧化钠溶液和5mL0.lmol/L氢氧化钠甲醇溶液+水(7+3)淋洗小柱，待溶液流过固相萃取柱后，在65kPa的负压下，减压抽干。加入5mL甲基叔丁醚+甲醇(9+1，含2%甲酸)溶液洗脱，控制流速在2mL/min，收集洗脱液，蒸发至近干。用5mL甲醇-pH7.2磷酸盐缓冲液溶解残留物供测定。取DEN-OVA板条，加入50yL的DEN标准溶液或处理好的样品处里液到各自的微孔中，每个标准溶液和样品处里液必须使用新的吸头，加缓冲液l:20稀释的DEN抗体50iiL，25t:振荡1小时，洗涤液洗三次，加缓冲液1:20稀释的Eu3+-羊抗兔抗体100yL，25t:振荡1小时，用洗涤液洗六次，加200iiL增强液振荡5分钟后测量。从标准曲线计算样品中的DEN含量，见表2和图2，该例的样品浓度为0.17ng/mL。表2权利要求一种检测双烯雌酚的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒，其特征是由多孔包被板(1)，缓冲液(2)，双烯雌酚标准溶液(3)，双烯雌酚的抗体(4)，铕标记的羊抗兔抗体(5)，洗涤液(6)和增强液(7)所组成。2.根据权利要求l所述的试剂盒，其中的包被板(1)包被固相抗原，用50mmol/LpH9.6Na2C03-NaHC03的缓冲液将DEN-OVA稀释至10mg/L做为包被液，96或48孔微孔板各孔加100iiL，4t:放置过夜，弃去包被液，冲洗三次，加150iiL含3g/LOVA的上述缓冲液封闭，4t:放置过夜，弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-201:冷冻保存。3.根据权利要求l所述的试剂盒，其中的双烯雌酚标准溶液(3)，从DEN纯品中稀释得到，稀释液为0.lmol/LpH7.5磷酸盐缓冲液，共6瓶，DEN浓度分别为:0ng/mL，0.lng/mL，lng/mL，10ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL。4.根据权利要求l所述的试剂盒，其中的双烯雌酚的抗体冻干品(4)，用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂1.2mL混合2mgDEN-BSA，用匀浆器混合2小时，制得油包水抗原乳化剂，取600iiL制备好的油包水抗原乳化剂，在新西兰大白兔和BALB/c小白鼠身上多位点地进行皮下注射，在免疫34次后，可进行鉴定，血清和腹水合格后稀释、分装、冻干备用。5.根据权利要求l所述的试剂盒，其中的铕标记的羊抗兔抗体(5)，将购得的羊抗兔抗体，经PD-10柱转换缓冲条件至pH9.0，收集蛋白峰，取已转换的羊抗兔抗体加入Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]_二乙烯三胺四乙酸，反应过夜，反应液经柱层析，收集蛋白峰，稀释、分装备用。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中的铕标记的羊抗兔抗体(5)，取溶解于50mmo1/LPBSpH7.0的5g/L羊抗兔抗体lmL2mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/LNaCl的50mmol/LNa2C03-NaHC03pH8.5-9.0缓冲液，收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量，用上述洗脱液稀释羊抗兔抗体至2g/L，取500-1000iiL稀释后的羊抗兔抗体加入含0.2-0.4mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸的小瓶中，28-3(TC磁力搅拌反应16小时，反应液经用80mmol/LTris-HClpH7.8缓冲液平衡的S印hadex-G50柱(1X40cm)层析，收集蛋白峰，稀释、分装备用。7.—种用权利要求1所述的试剂盒检测双烯雌酚的方法，其特征是取包被有DEN-OVA的微孔包被板，加入DEN标准溶液或处理好的样品处里液到各自的微孔中，再加入DEN抗体，振荡反应，洗涤液洗涤，加铕标记的羊抗兔抗体，进行标记免疫反应，洗涤液洗涤，加增强液振荡后测量荧光强度cps，对照标准曲线计算样品中的DEN含量。8.根据权利要求8所述的检测双烯雌酚的方法，其操作为取包被有DEN-OVA的微孔包被板，加入50iiL的DEN标准或处理好的样品到各自的微孔中，力B50iiL以缓冲液(2)作稀释剂，1:20稀释DEN抗体，25t:37"振荡0.51小时，洗涤液洗三次，加以缓冲液(2)1:20稀释的100iiLEU"-羊抗兔抗体，25。C37。C振荡0.5l小时，用洗涤液洗六次，加200iiL增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的DEN含量。全文摘要一种检测双烯雌酚的试剂盒及其检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)
技术领域：
，用于食品和饲料中双烯雌酚(DEN)含量的检测。本发明配制的试剂盒，采用TRFIA检测DEN，测定的基础是标记免疫反应。微孔板包被有DEN-载体蛋白，加入DEN标准溶液或样品处里液，再加入DEN抗体。游离的DEN与微孔板上的DEN-载体蛋白竞争DEN抗体，没有连接的DEN抗体被洗涤除去，加入Eu3+-羊抗兔抗体，标记免疫反应后没有连接的Eu3+-羊抗兔抗体被洗涤除去。加增强液后，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的DEN浓度成反比，对照标准曲线即可确定被测样品中DEN的含量。本发明提供的检测DEN试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，可以达到0.01ng/mL以上。文档编号G01N33/74GK101713783SQ20091023265公开日2010年5月26日申请日期2009年12月4日优先权日2009年12月4日发明者宓晓黎,李利东,杜妹莲,肖华龙,陆茂林,黄丽俊申请人:江苏省微生物研究所有限责任公司