irT1。
[0033]实施例3
[0034](I)重楼种子的预处理:选取八月下旬采摘的尚未完全成熟的重楼果实，去掉果皮后将带外种皮的重楼种子用浓度为I/?ο4的高锰酸钾溶液浸泡72小时，期间每隔12小时换高锰酸钾溶液一次，取出浸泡后的重楼种子，搓去外种皮后，放入浓度为0.01%的升汞溶液中消毒7分钟，用无菌水冲洗4次后，迅速用已消毒的滤纸吸干内种皮表面的水分，再用小刀划伤重楼种子的内种皮，并将划伤内种皮的重楼种子在温度为30°C、光照强度为20001x的条件下放置5小时，有93.5%的重楼种子内种皮产生爆裂，露出大量重楼珠心细胞；
[0035](2)重楼珠心细胞的预培养:取内种皮产生爆裂的重楼种子，放在超净工作台上用0.1%的升汞溶液消毒4分钟，用无菌水冲洗6次后，用解剖刀切取重楼种子的珠心细胞接入液体培养基B5+赤霉素600mg/L+KT 3.0mg/L+IAA 1.5mg/L中进行35天的预培养；
[0036](3)重楼珠心细胞的悬浮培养:选取预培养后处于悬浮培养液中部和下部的重楼珠心细胞和细胞团块，以80g.L—1的接种量转接到B5+6-BA2.0mg/L+NAA 2.0mg/L+2, 4-D3.0mg/L液体培养基中进行细胞悬浮培养；
[0037](4)细胞的继代培养:在细胞悬浮培养了 60天进行第一次继代培养，以后每隔45天继代一次，每次的接种量为60g.L—1;
[0038](5)细胞增殖生长倍数的计算:取继代培养3代的重楼珠心细胞在3000r/min的离心机上离心5min后，倒掉上清液进行称重，按如下公式计算出重楼珠心细胞的增殖倍数为1.48倍；
[0039]细胞增殖倍数=(收获量鲜重一接种量鲜重)/接种量鲜重；
[0040]上述⑵、(3)、⑷步骤中重楼珠心细胞的液体培养条件均为温度25°C，pH值7.0，无光照，摇床转速为180r.mirT1。
[0041]实施例4
[0042]将实施例2步骤(I)中重楼种子在高锰酸钾溶液中的浸泡时间改为24小时，其它步骤同实施例2，重楼珠心细胞的增殖倍数为1.92倍。
[0043]实施例5
[0044]将实施例2步骤(I)中重楼种子在高锰酸钾溶液中的浸泡时间改为72小时，其它步骤同实施例2，重楼珠心细胞的增殖倍数为2.06倍。
[0045]实施例6
[0046]在实施例2步骤(I)中，将划伤内种皮的重楼种子改为放置在30°C的温度条件下5小时，其它步骤同实施例2，重楼珠心细胞的增殖倍数为1.67倍。
[0047]实施例7
[0048]将实施例2步骤(2)中重楼珠心细胞的预培养改为在B5+赤霉素200mg/L+KT1.0mg/L+IAA 0.5mg/L的液体培养基中培养25天，其它步骤同实施例2，重楼珠心细胞的增殖倍数为1.80倍。
[0049]实施例8
[0050]将实施例2步骤(2)中重楼珠心细胞的预培养基改为B5+赤霉素600mg/L+KT3.0mg/L+IAA 1.5mg/L，其它步骤同实施例2，重楼珠心细胞的增殖倍数为1.59倍。
[0051]比较实施例1
[0052]在实施例2步骤(I)中，改选完全成熟的重楼果实，其它步骤同实施例2，重楼种子内种皮产生爆裂情况为0%。
[0053]比较实施例2
[0054]在实施例2步骤(2)中，取消搓去重楼种子外种皮的环节，其它步骤同实施例2，重楼种子内种皮产生爆裂情况为0%。
[0055]比较实施例3
[0056]在实施例2步骤⑴中，将划伤内种皮的重楼种子的放置条件改为在40°C的温度、光照强度为30001x的条件下放置7小时，其它步骤同实施例2，重楼种子内种皮产生爆裂率为94 %，但露出的大量结构较松散的重楼珠心细胞很快出现了死亡。
[0057]比较实施例4
[0058]将实施例2步骤(2)(重楼珠心细胞的预培养)取消，其它步骤同实施例2，重楼珠心细胞的增殖倍数为1.03倍。
[0059]比较实施例5
[0060]将实施例2步骤(2)中的预培养基的基本培养基由B5改为MS，其它步骤同实施例2，重楼珠心细胞的增殖倍数为1.01倍。
[0061]比较实施例6
[0062]在实施例2步骤(3)中，改选预培养后处于悬浮培养液下部的重楼珠心细胞和细胞团块进行悬浮培养，其它步骤同实施例2，重楼珠心细胞的增殖倍数为1.38倍。
[0063]比较实施例7
[0064]在实施例2步骤(3)中，改选预培养后处于悬浮培养液上部的重楼珠心细胞和细胞团块进行悬浮培养，其它步骤同实施例2，重楼珠心细胞的增殖倍数为1.13倍。
[0065]比较实施例8
[0066]将实施例2步骤(3)中重楼珠心细胞和细胞小团块的接种量改为1g.L—1，其它步骤同实施例2，重楼珠心细胞的增殖倍数为1.04倍。
【主权项】
1.一种重楼珠心细胞的悬浮培养方法，其特征在于包括如下步骤: (1)重楼种子的预处理:选取尚未完全成熟的重楼果实，去掉果皮后先进行浸泡，然后将浸泡后的重楼种子搓去外种皮后，再用升汞溶液进行消毒，将消毒后的重楼种子用无菌水冲洗后，用滤纸吸干内种皮表面的水分，再用小刀划伤重楼种子的内种皮，并将划伤内种皮的重楼种子放置一段时间，使重楼种子内种皮产生爆裂，露出大量重楼珠心细胞； (2)重楼珠心细胞的预培养:取内种皮产生爆裂的重楼种子，放在超净工作台上用0.1%的升汞溶液消毒2?4分钟，用无菌水冲洗后，用解剖刀切取重楼种子的珠心细胞接入液体培养基 B5+ 赤霉素 200-600mg/L+KTL 0-3.0mg/L+IAA 0.5-1.5mg/L 中进行 25 ?35天的预培养； (3)重楼珠心细胞的悬浮培养:选取预培养后处于悬浮培养液中部或/和下部的重楼珠心细胞和细胞团块，以40?80g.Ι^的接种量转接到Β5+6-ΒΑ0.5?2.0mg/L+NAA 0.5?2.0mg/L+2, 4-D 1.0?3.0mg/L液体培养基中进行细胞悬浮培养； (4)细胞的继代培养:在细胞悬浮培养了40?60天进行第一次继代培养，以后每隔35?45天继代一次，每次的接种量为30?60g.Γ1； 上述(2)、(3)、(4)步骤中重楼珠心细胞的液体培养条件均为温度20?25°C，pH值5.0?7.0，无光照，摇床转速为120?180r.mirf1。
2.根据权利要求1所述的重楼珠心细胞的悬浮培养方法，其特征在于:步骤(I)中所述浸泡是指用浓度为1/104的高锰酸钾溶液浸泡24?72小时。
3.根据权利要求1或2所述的重楼珠心细胞的悬浮培养方法，其特征在于:步骤(I)中所述用升汞溶液进行消毒是指放入浓度为0.01%的升汞溶液中消毒4?7分钟。
4.根据权利要求1所述的重楼珠心细胞的悬浮培养方法，其特征在于:步骤(I)中所述将划伤内种皮的重楼种子放置一段时间是指将划伤内种皮的重楼种子在温度为25?30°C、光照强度为1500?20001x的条件下放置3?5小时。
【专利摘要】本发明公开了一种重楼珠心细胞的悬浮培养方法，该方法包括如下步骤：重楼种子的预处理→重楼珠心细胞的预培养→重楼珠心细胞的悬浮培养→细胞的继代培养，可实现大规模快速生产出有效成分含量高的重楼细胞培养物。
【IPC分类】C12N5-04
【公开号】CN104774800
【申请号】CN201510163234
【发明人】王跃华, 代勇, 彭世明, 刘银花, 陈燕, 何新友, 黄鹏, 王玉龙, 张洪文, 廖映凯, 刘洪明, 钟若男, 胥华, 李婷婷, 昝加志, 朱晓换, 刘林
【申请人】成都大学
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月8日