一种鸡白痢沙门氏菌sp9905及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体设及一种鸡白频沙口氏菌SP9905,及其在制 备活疫苗中的应用和制备方法。
【背景技术】
[0002] 鸡白频是由鸡白频沙口氏菌（Salmonellapullorum)引起的家禽常见多发性传染 病。鸡白频在我国的养鸡场普遍存在，表现在育维、育成阶段死亡率升高，给生产者造成严 重的经济损失。国内对于鸡白频的控制通常采用抗菌药物来减轻其危害，但在选择药物种 类、给药途径、方法、剂量与维持时间上比较混乱，存在相当程度的盲目性，滥用或浪费现象 非常普遍。同时长期反复用药，不仅使饲养成本上升，而且导致细菌耐药性增强W及禽产品 的药物残留等一系列问题。事实证明仅依赖药物控制不是防治鸡白频的良策。相比之下，采 用疫苗免疫，既没有抗生素造成的细菌耐药性与药物残留问题，又可W产生持久的免疫力， 因而更容易被养殖者和消费者接受。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种鸡白频沙口氏菌SP9905W及其制备活疫苗的应用， 具体为一种可通过饮水或采食途径口服免疫的鸡白频沙口氏菌活疫苗，同时还提供了该鸡 白频沙口氏菌活疫苗的制备方法。
[0004] 本发明具体通过W下技术方案实现： 一种鸡白频沙口氏菌SP9905,是从历年来收集、保存的500余株自然病例所分离的鸡 白频沙口氏菌菌种中，经多年反复筛选验证后获得的一株测试结果为天然弱毒的鸡白频沙 口氏菌菌种。
[0005] 鸡白频沙口氏菌SP9905(SalmonellapullorumSP9905)已于 2014 年 10 月 15 日 送中国典型培养物保藏中屯、（中国.武汉.武汉大学）保藏，名称及鉴别特征；鸡白频沙口 氏菌（Salmonellapullorum),株号；SP9905,保藏编号；CCTCCNO.M2014478。
[0006] 本发明的提供了所述的鸡白频沙口氏菌用于制备活疫苗的应用。
[0007] 本发明的另一目的，由鸡白频沙口氏菌天然弱毒菌株SP9905制成鸡白频沙口氏 菌活疫苗，用于预防或治疗鸡白频的用途。
[000引本发明所述的鸡白频沙口氏菌活疫苗的制备方法，包括如下具体步骤： 1) 种子菌液的制备：将鸡白频沙口氏菌天然弱毒株SP9905菌种经液体培养基复苏繁 殖后，接种平板固体培养基，37°C培养20h，挑选典型菌落接种扁瓶固体培养基，37°C培养 2化后用液体培养基洗下菌苔，检验合格后作为种子菌液； 2) 细菌培养：将种子菌液按培养基总体积的2. 5~5. 0%接种，经发酵罐37°C深层通 气培养18~2化后，收集菌液； 3) 疫苗制备：将菌液经4000r/min离屯、15min去上清，菌泥立即加入灭菌冻干保护 剂，充分混匀，分装后经真空冷冻干燥制成鸡白频沙口氏菌活疫苗，每羽份活菌数不低于 2. 5X107c即。
[0009] 所述的液体培养基组成为；牛肉汤500ml、猪胃消化液500ml、甘油10. 0ml、硫代硫 酸钢8.Og、山梨醇10. 0ml、k谷氨酸钢2. 5g、可溶性淀粉1. 2g、葡萄糖10.Og、水解乳蛋白 5.Og。液体培养基中加入1. 5%的纯化琼脂粉制成固体培养基。
[0010] 所述的冻干保护剂组成为；脱脂奶粉lOOg、甘露醇lOg、海藻糖50g、庶糖20g、 k谷氨酸钢1. 5g，蒸馈水1000ml。
[0011] 本发明的有益效果如下： 本发明方法所生产的鸡白频沙口氏菌活疫苗，培养活菌数为449~517亿/ml,冻干死 亡率为14. 9~22. 5%，具有菌数高、冻干死亡率低的优点。产品安全可靠，其安全剂量达 200个免疫剂量。疫苗口服免疫后在第10天即可产生较好的免疫保护力，在第14天可产生 坚强保护力，免疫保护率达100%，并且对其它血清型沙口氏菌（肠炎沙口氏菌、鸡伤寒沙 口氏菌）的攻击同样具有较好的保护能力（80%~100% )。
【具体实施方式】
[0012] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，W下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加W变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对W下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。 [001引实施例1 1)分离纯化与染色镜检 鸡白频沙口氏菌SP9905株于1999年5月从江苏省扬州市某鸡场的11月龄狼山鸡盲 肠内容物中分离所得。其具体分离方法为：无菌采集盲肠内容物加入亚砸酸盐脱氨酸增菌 液中37 °C过夜培养，再接种麦康凯琼脂37 °C培养24小时，挑取直径为0. 5mm-l. 0mm、灰白色 透明、表面光滑的菌落，接种于马了琼脂培养基，37°C培养24小时。将纯培养后的细菌进行 革兰氏染色镜检，然后用光学显微镜观察，呈两端稍圆的细长杆菌。
[0014] 2)生化鉴定 从马了琼脂平板上挑取菌落，进行生化鉴定试验。微量生化鉴定管购自杭州微生物试 剂有限公司，按照说明书进行操作。结果菌株的各项生化指标（见表1)均符合鸡白频沙口 氏菌生化特性。
[0015] 表1鸡白频沙口氏菌生化鉴定结果
【主权项】
1. 一种鸡白痢沙门氏菌SP9905,其特征在于：该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典 型培养物保藏中心；地址：武汉大学；保藏日期：2014年10月15日；藏编号：CCTCCNO.M 2014478。
2. 权利要求1所述的鸡白痢沙门氏菌用于制备活疫苗的应用。
3. -种鸡白痢沙门氏菌活疫苗，其特征在于：由权利要求1所述的鸡白痢沙门氏菌 SP9905 制成。
4. 根据权利要求3所述的一种鸡白痢沙门氏菌活疫苗，其特征在于：通过以下方法制 备： 1) 种子菌液的制备：将鸡白痢沙门氏菌SP9905菌种经液体培养基复苏繁殖后，接种平 板固体培养基，37°C培养20h，挑选典型菌落接种扁瓶固体培养基，37°C培养24h后用液体 培养基洗下菌苔，检验合格后作为种子菌液； 2) 细菌培养：将种子菌液按培养基总体积的2. 5~5. 0%接种，经发酵罐37°C深层通气培 养18~20h后，收集菌液； 3) 疫苗制备：将菌液经4000r/min离心15min去上清，菌泥立即加入灭菌冻干保护 剂，充分混匀，分装后经真空冷冻干燥制成鸡白痢沙门氏菌活疫苗，每羽份活菌数不低于 2. 5XIO7CFU0
5. 根据权利要求4所述的一种鸡白痢沙门氏菌活疫苗，其特征在于：所述的液体培 养基组成为：牛肉汤500ml、猪胃消化液500ml、甘油10.Oml、硫代硫酸钠8. 0g、山梨醇 10. 0ml、L-谷氨酸钠2. 5g、可溶性淀粉I. 2g、葡萄糖10. 0g、水解乳蛋白5.Og;所述的固体 培养基通过液体培养基中加入1. 5%的纯化琼脂粉制成。
6. 根据权利要求4所述的一种鸡白痢沙门氏菌活疫苗，其特征在于：所述的冻干保 护剂组成为：脱脂奶粉l〇〇g、甘露醇l〇g、海藻糖50g、蔗糖20g、L-谷氨酸钠I. 5g，蒸馏水 1000 ml0
7. 根据权利要求4所述的一种鸡白痢沙门氏菌活疫苗在制备预防或治疗鸡白痢药物 中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种鸡白痢沙门氏菌SP9905，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：武汉大学；保藏日期：2014年10月15日；藏编号：CCTCC NO.M 2014478。本发明还提供了所述的鸡白痢沙门氏菌用于制备活疫苗的应用。本发明制得的疫苗具有活菌数高、冻干死亡率低的优点，产品安全可靠，免疫保护作用在第14天可产生坚强保护力，免疫保护率达100%，并且对其它血清型沙门氏菌（肠炎沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌）的攻击同样具有较好的保护能力（80%~100%）。CCTCC NO:M201447820141015
【IPC分类】A61K39-112, A61P1-12, C12R1-42, A61P31-04, C12N1-20
【公开号】CN104774791
【申请号】CN201510159247
【发明人】龚建森, 苗晋锋, 许明, 窦新红, 张笛, 朱春红, 顾蓓蓓, 刘学贤, 徐步, 童海兵, 邹剑敏
【申请人】江苏省家禽科学研究所
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月3日