一种类天蚕素抗菌肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种类天蚕素抗菌肽及其应用，属于分子生物学【技术领域】。类天蚕素抗菌肽由31个氨基酸组成，其分子量为3833.7Da。该抗菌肽能够抑制金黄色葡萄球菌、禽多杀性巴氏杆菌、鸡沙门氏菌和鸡大肠杆菌等细菌的生长，与青霉素、链霉素、头孢唑啉钠、阿奇霉素等常用抗生素相比，抑菌效果相对较好，与Cecropin?B、Cecropin?A、Cecropin?P1等常规的天蚕素抗菌肽相比，具有更强的抑菌活性。该抗菌肽对鸡沙门氏菌的最小抑菌浓度为625μg/mL，同时具有良好的热稳定性，在抗菌性药物的研究开发中具有良好的应用前景。
【专利说明】一种类天蚕素抗菌肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种类天蚕素抗菌肽，以及该抗菌肽的应用，属于分子生物学技术领 域。
【背景技术】
[0002] 抗菌肽（Antibacterial peptide)是由多种生物细胞特定基因编码经外界条件诱 导产生的一类小分子多肽，分子量为2000?7000Da，由20?60个氨基酸残基组成。世界 上第一个抗菌肽是由瑞典科学家G.Boman等人于1980年从天蚕蛹中发现的。此后，人们在 细菌、真菌、植物、昆虫、两栖类动物、鸟类、鱼类、哺乳动物乃至人类等多种生物体中陆续发 现并分离了多种抗菌肽。迄今为止，国内外报道大约有2000多种抗菌肽被鉴定、分离出来， 以天然抗菌肽作模板进行人工合成的模拟肽已达数千种。这些抗菌肽大多具有广谱抗细 菌、真菌、病毒、原虫和抑杀肿瘤细胞等活性，而且在天然免疫中也扮演着重要角色，有些抗 菌肽具有调节免疫、促中性粒细胞、T细胞的化学趋化、促进伤口愈合、诱导细胞凋亡、抑制 蛋白激酶C、抑制促肾上腺皮质激素等多方面生物功能。
[0003] 长期、广泛、不加选择地使用抗生素药物引发了药物残留、细菌耐药性增强、机体 自身免疫力下降等一系列问题，给细菌性疾病的防治带来了极大的麻烦和困难，同时也给 人类的健康带来潜在的威胁。而具有广谱、高效抗病原微生物等特点的抗菌肽不同于传统 的抗生素药物，其独特的杀菌机制使细菌不易产生耐药性，这一发现为解决细菌对传统抗 生素日益增强的耐药性这一棘手的全球性难题提供了新的途径，提示抗菌肽可作为抗生素 良好的替代品在临床上得到广泛使用将是大势所趋。
[0004] 目前，抗菌肽已引起了人们的广泛关注，其研究及应用已成为生物制药领域中的 热点。随着研究的不断深入，许多抗菌肽正在被开发成药物，其中天蚕素抗菌肽是目前研究 最清楚、效果最明显的抗菌肽。然而，与传统抗生素相比，天然来源的抗菌肽产量低、抗菌活 性不够理想，有的甚至存在细胞毒性。因此，在揭示抗菌肽结构与功能关系及作用机制的基 础上，以性质优良的抗菌肽为模板，对已有抗菌肽进行人工改造和设计新抗菌肽分子已成 为抗菌肽开发的一个重要内容。与天然来源的抗菌肽相比，人工设计的抗菌肽往往具有更 好的靶细胞特异性和抗菌活性，而且具有低溶血活性和对蛋白酶降解作用的低敏感性等特 点。因此，开发具有结构简单、抗菌活性高、化学合成容易的抗菌肽成为当前抗菌药物开发 迫切的需求。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种类天蚕素抗菌肽。
[0006] 同时，本发明还提供一种类天蚕素抗菌肽的应用。
[0007] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0008] -种类天蚕素抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。抗菌肽的分子量为 3833. 7Da。所述抗菌肽包含天蚕素 S-W-L-S-K-T-A-K-K-L-F抗菌活性结构，富含精氨酸 (Arg)和赖氨酸（Lys)，精氨酸（Arg)和赖氨酸（Lys)残基带正电荷，可吸引细菌表面的负 电荷。同时，R-P-R-P-W-P-R-P基本结构单元构成双侧疏水性α-螺旋结构。
[0009] 上述类天蚕素抗菌肽可通过人工合成，即多肽固相合成的方法或基因工程方法获 得。
[0010] 一种类天蚕素抗菌肽的应用，包括类天蚕素抗菌肽在制备抗菌性药物方面的应 用。在抗菌性药物中，类天蚕素抗菌肽可按常规方法制成不同药物剂型，如片剂、散剂、注射 针剂等。类天蚕素抗菌肽为抗菌药物的抗菌活性成分，在药物中，类天蚕素抗菌肽的含量范 围为0· 2?50%。
[0011] 所述的菌为金黄色葡萄球菌、禽多杀性巴氏杆菌、鸡沙门氏菌、鸡大肠杆菌中的一 种或多种。
[0012] 具体的，类天蚕素抗菌肽在制备抗鸡沙门氏菌药物方面的应用。类天蚕素抗菌肽 对鸡沙门氏菌的抗菌性尤佳，最小抑菌浓度为625 μ g/mL，且经121°C高温高压处理后仍对 鸡沙门氏菌有抑菌作用，热稳定性良好。
[0013] 本发明的有益效果：
[0014] 本发明根据抗菌肽的作用机理和氨基酸组成的特点，同时参照Cecropin P1杀菌 特点，设计一种类天蚕素抗菌肽，由31个氨基酸组成，分子量为3833. 7Da。该抗菌肽能够抑 制金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、鸡沙门氏菌和鸡大肠杆菌等细菌的生长，与青霉素、链霉素、 头孢唑啉钠、阿奇霉素等常用抗生素相比，抑菌效果相对较好，与Cecropin B、Cecropin A、 Cecropin P1等常规的天蚕素抗菌肽相比，具有更强的抑菌活性。该抗菌肽对鸡沙门氏菌的 最小抑菌浓度为625 μ g/mL，热稳定性良好，在抗菌性药物的研究开发中具有良好的应用前 旦 -5^ 〇
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1为本发明试验例1中类天蚕素抗菌肽对四种细菌体外抑菌活性试验结果；
[0016] 图2为类天蚕素抗菌肽与常用抗生素体外抑菌活性试验结果；
[0017] 图3为类天蚕素抗菌肽对沙门氏菌最小抑菌浓度测定结果；
[0018] 图4为类天蚕素抗菌肽热稳定性测定结果。
【具体实施方式】
[0019] 下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0020] 实施例1
[0021] 本实施例中类天蚕素抗菌肽，其氨基酸序列为：SWLSKTAKKLFKKIPKKRFPR PRPWPRPNMI(同SEQ ID NO. 1所示），分子量为3833. 7Da。所述抗菌肽包含天蚕素 S-W-L-S-K-T-A-K-K-L-F抗菌活性结构，富含精氨酸（Arg)和赖氨酸（Lys)，精氨酸（Arg) 和赖氨酸（Lys)残基带正电荷可吸引细菌表面的负电荷。同时R-P-R-P-W-P-R-P基本结构 单元构成双侧疏水性α-螺旋结构。
[0022] 本实施例中类天蚕素抗菌肽由上海楚肽生物科技有限公司采用固相合成法合成， 纯度大于95%。
[0023] 实施例2
[0024] 本实施例中类天蚕素抗菌肽在制备抗菌性药物方面的应用，所述抗菌肽的氨基酸 序列为：SWLSKTAKKLFKKIPKKRFPRPRPWP RPNMI，分子量为3833. 7Da。采用常规方法将类天 蚕素抗菌肽制成类天蚕素多肽菌素片剂，主药类天蚕素抗菌肽每片含量为0. 2g，主药的质 量百分含量为50%，辅料由淀粉、蔗糖、滑石粉组成。
[0025] 实施例3
[0026] 本实施例中类天蚕素抗菌肽在制备抗菌性药物方面的应用，所述抗菌肽的氨基酸 序列为：SWLSKTAKKLFKKIPKKRFPRPRPWP RPNMI，分子量为3833. 7Da。采用常规方法将类天 蚕素抗菌肽制成类天蚕素多肽菌素氯化钠注射液，每100mL注射液由以下组分组成：主药 类天蚕素抗菌肽0. 2g，氯化钠0. 9g，余量为注射用水。
[0027] 实施例4
[0028] 本实施例中类天蚕素抗菌肽在制备抗菌性药物方面的应用，所述抗菌肽的氨基酸 序列为：SWLSKTAKKLFKKIPKKRFPRPRPWP RPNMI，分子量为3833. 7Da。采用常规方法将类天 蚕素抗菌肽制成类天蚕素多肽菌素葡萄糖注射液，每100mL注射液由以下组分组成：类天 蚕素抗菌肽0. 2g，葡萄糖5g，余量为注射用水。
[0029] 试验例
[0030] (1)类天蚕素抗菌肽体外抑菌活性试验
[0031] 采用纸片法测定类天蚕素抗菌肽的体外抑菌活性。纸片法中药敏纸片按照常规方 法制备。选用新华1号定性滤纸，用打孔器打成直径为6_的小圆纸片，纸片用纸包成包，放 在小瓶或平皿中，在120°C灭菌15min再置100°C干燥箱内烘干。将灭菌的滤纸片用无菌镊 子摊布于灭菌平皿中，以每张滤纸片饱和吸水量为0. OlmL计算，50张滤纸加入药量0. 5mL， 药液的配制方法见下表1。要不时翻动，使滤纸充分吸收药液，一般浸泡30min，取出含药纸 片放于纱布袋中，以真空抽气机使之干燥，或将纸片摊于37°C温箱中烘干，以防药物失效。 对青霉素纸片的干燥宜用低温真空干燥法，干燥后立即放入瓶中加塞，放干燥器内保存，也 可放在-20°C冰箱中。按上述方法制作青霉素、链霉素、阿奇霉素、头孢唑啉钠、类天蚕素抗 菌肽的药敏片，装小瓶中备用。
[0032] 表1药液的配制方法
[0033] 药物浓度 药物 制备方法 纸片含量 (iig/mL) 注射用青霉素钠 lOOmg加 pH为6.0的PBS 20mL 5000 50 注射用硫酸链霉素 lOOmg加 pH为7.8的PBS40mL 2500 25 注射用阿奇霉素 150mg溶于100mL蒸馈水 1500 15 注射用头孢唑啉钠 300 mg溶于100mL蒸馏水 3000 30 类天蚕素抗菌肽 lOOmg溶于100mL蒸馈水 1000 10
[0034] 将金黄色葡萄球菌、禽多杀性巴氏杆菌、鸡沙门氏菌和鸡大肠杆菌四种细菌培 养至对数期，分别取100 μ L四种细菌对数期菌液均匀涂布于4个LB固体培养基中，培 养基配方如下：胰蛋白胨（Tryptone)10g/L，酵母提取物（Yeast extract) 5g/L，氯化钠 (NaCl)10g/L，琼脂粉10g。每个LB固体培养基中放一个类天蚕素抗菌肽药敏片。将四个平 板置于37°C培养24h，观察并记录结果，见下表2和图1，图1中类天蚕素抗菌肽药敏片均贴 于各培养皿中央，未作特殊标示，"巴"代表巴氏杆菌，"金"代表金黄色葡萄球菌，"鸡"代表 鸡大肠杆菌，"沙门"代表鸡沙门氏菌。
[0035] 表2类天蚕素抗菌肽对四种细菌的抑菌圈直径
[0036]
【权利要求】
1. 一种类天蚕素抗菌肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 根据权利要求1所述的类天蚕素抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽的分子量为 3833. 7Da〇
3. -种如权利要求1所述的类天蚕素抗菌肽的应用，其特征在于：所述抗菌肽在制备 抗菌性药物方面的应用。
4. 根据权利要求3所述的类天蚕素抗菌肽的应用，其特征在于：所述抗菌肽为药物中 抗菌活性成分，其含量为0. 2?50%。
5. 根据权利要求3所述的类天蚕素抗菌肽的应用，其特征在于：所述的菌为金黄色葡 萄球菌、禽多杀性巴氏杆菌、鸡沙门氏菌、鸡大肠杆菌中的一种或多种。
6. 根据权利要求5所述的类天蚕素抗菌肽的应用，其特征在于：所述抗菌肽在制备抗 鸡沙门氏菌药物方面的应用。
【文档编号】A61K38/16GK104140458SQ201410320218
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月7日 优先权日:2014年7月7日
【发明者】王臣, 汪洋, 郭香玲, 牛明媚, 吴庭才 申请人:河南科技大学