专利名称：构建原核表达融合型天蚕抗菌肽b和肿瘤血管生长抑制因子k5基因工程菌的方法
技术领域：
本发明属于生物、医药研制技术，涉及构建高效表达融合蛋白天蚕 抗菌肽B-肿瘤血管生长抑制因子K5基因工程菌的方法，具体的说，是分 别对目的基因(天蚕抗菌肽B基因和肿瘤血管生长抑制因子K5基因) 进行克隆定向连接至大肠杆菌表达质粒转化后获得高效表达目的蛋白 基因工程菌的制备方法。
背景技术：
抗菌肽(Antibacterial p印tide)是生物体内经诱导产生的一类 具有生物活性的小分子多肽，分子质量在2000U到7000U左右，由20 到60个氨基酸残基组成。CecropinB (天蚕素B)就是其中的一种可溶 性抗菌肽，它不仅具有热稳定性和广谱的抗菌性能，而且还能选择性地 杀伤肿瘤细胞。天蚕素B对人髓样白血病细胞、艾氏腹水瘤、宫颈癌细 胞、直肠癌及肝癌细胞均具有较强的杀伤作用，但它对正常的哺乳动物 细胞和昆虫细胞却无不良的影响；新生血管生成抑制因子(Angiostatin) 由纤溶酶原的前4个饼环区组成，在体外能够特异性抑制血管内皮细胞 的增生、转移和多种肿瘤细胞的生长。1997年，Cao等发现纤溶酶原的 第5个饼环区(plasminogen kringle 5， K5)同样具有抑制血管内皮 细胞增殖和肿瘤生长的能力，且抑制能力比Angiostatin更强。K5对新 血管生长的抑制作用主要表现为对肿瘤血管生长的抑制，它通过抑制血 管生长而强烈的抑制肿瘤细胞的生长，使肿瘤组织萎縮和消失。
发明内容
本发明提供了一种操作简单、实用、快捷，而且可放大至规模生产 的构建原核表达融合型天蚕抗菌肽B和肿瘤血管生长抑制因子K5基因 工程菌的方法，构建原核表达融合型天蚕抗菌肽B和肿瘤血管生长抑制因子K5基 因工程菌的方法，其特殊之处是根据已知天蚕抗菌肽Cecropin B和 肿瘤血管生长抑制因子Kringle5基因序列设计相应的引物选择合适的 表达载体，构建高效表达的原核工程菌株。具体步骤如下
l]、天蚕抗菌肽Cecropin B的DNA序列，利用重叠区扩增法原理， 设计了天蚕抗菌根据肽Cecropin B的四个片段，其中加入了辰o/和 fco/ /酶切位点，通过两次PCR反应获得目的基因天蚕抗菌肽Cecropin B的DNA片段，扩增产物用1%-2%的琼脂糖电泳检测；
2]、肿瘤血管生长抑制因子K5基因的获得，根据肿瘤血管生长抑 制因子Kringle5基因序列设计了上下游引物并在其两端分别加入了 fco; /和W73f/7Z7^切位点及蛋白酶切位点FactorXa和羟胺切割位点， 从含有肿瘤血管生长抑制因子Kringle5基因的已有质粒ThioA/L15-7 中钓出目的基因，在一定条件下，通过PCR反应对肿瘤血管生长抑制因 子Kringle5基因片段进行扩增，扩增产物用1%-2%的琼脂糖电泳检测；
3]、在一定条件下对Cecropin B基因片段和Kringle5基因片段酶 切，再将酶切产物全部进行1%_2%的琼脂糖凝胶电泳，将载体双酶切片 段和Cecropin B基因片段和Kringle5基因片段的双酶切片段酶连，所 获得的重组质粒pET32a/C-K5按常规方法转入BL21 (DE3)后进行培养， 重组质粒和重组菌提质粒后均用iVco/和7yi/7G7Z7双酶切鉴定后进行序列 分析。进行序列分析；
4]、用基本培养基在摇瓶中培养，通过测定工程菌的生长曲线确定 合适的加诱导剂时机温度大约35°C， pH值6.5-7.0，摇床转速200 r/min- 260r/min，接种量8%-10%,诱导剂量0. 6 mmol/L-l.O mmol/L， 诱导时机为工程菌生长的中后期，诱导时间6h-8h。
在上述方法中将重组蛋白的氨基酸序列设计成 -Ile-Glu-Gly國Arg-國CB—Asn-Gly—Asn-Gly—K5 ，其中國Ile誦Glu-Gly-Arg-为 FactorXa的作用位点。
本发明与传统方法比较，这种方法操作简单、实用、快捷，而且可 放大至规模生产。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步的详细说明。
图1是本发明实施例中的表达质粒pET32a/CB-K5构建示意图。
图2是本发明实施例中的克隆的天蚕抗菌肽Cecropin B基因的琼 脂糖凝胶电泳分析。
图3是本发明实施例中的克隆的肿瘤血管生长抑制因子K5基因的 琼脂糖凝胶电泳分析。
图4是本发明实施例中的重组质粒pET32a/CB-K5的PCR鉴定琼脂 糖凝胶电泳分析。
图2 PCR扩增CB中1为片段1+片段2， 2为片段3+片段4， 3为 CB全长，4为DNA Marker DL2000。
图3 PCR扩增K5中1， 2为K5， 3为DNA Marker DL2000。
图4 转化子CB-K5的PCR鉴定中1为DNA Marker DL2000， 2为 以片断1+片断4为引物调出的CB， 3为以P11+P12为引物调出的K5， 4 为以引物1+P12为引物调出的CB-K5。
具体实施例方式
抗菌肽不仅具有广谱的抗菌活性，而且对某些病毒、真菌和原虫也 具有抑杀作用，特别是近年来对于抗肿瘤方面的系列报道更是引人注 目。同时，研究者们也发现，肿瘤血管生长抑制因子通过抑制血管生长 而强烈的抑制肿瘤细胞的生长，使肿瘤组织萎縮和消失，具有很强的抗 肿瘤活性。因此，本发明将它们以融合的形式表达，可以得到具有更高 抗肿瘤和抗菌活性的重组蛋白，在原核系统中进行表达，并结合发酵生 产工艺与纯化工艺的优化，不仅可以使每批次目标产品产量大幅度提 高，而且由于采用大肠杆菌进行发酵生产而使生产成本大大降低。
本发明的表达质粒pET32a/CB-K5构建方案如图1所示，具体实施方 法如下
1.蚕抗菌肽Cecropin B的DNA序列，利用重叠区扩增法原理，设 计了天蚕抗菌根据肽CecropinB的四个片段，其中加入了辰o/和^ct^ /酶切位点及蛋白酶切位点FactorXa和羟胺切割位点，通过两次PCR
5反应获得目的基因天蚕抗菌肽Cecr叩inB的DNA片段，扩增产物用1%-2% 的琼脂糖电泳检测，见图2;
2. 肿瘤血管生长抑制因子K5基因的获得，根据肿瘤血管生长抑制 因子Kringle5基因序列设计了上下游引物并在其两端分别加入了 fco7 /和^/^///酶切位点及蛋白酶切位点FactorXa和羟胺切割位点，从含 有肿瘤血管生长抑制因子Kringle5基因的已有质粒ThioA/L15-7中钓 出目的基因，在一定条件下，通过PCR反应对肿瘤血管生长抑制因子 Kringle5基因片段进行扩增，扩增产物用1%_2%的琼脂糖电泳检测，见 图3;
3. —定条件下对Cecropin B基因片段和肿瘤血管生长抑制因子 Kringle5基因片段酶切，再将酶切产物全部进行1%_2%的琼脂糖凝胶电 泳，将载体双酶切片段和Cecropin B基因片段和肿瘤血管生长抑制因 子Kringle5基因片段的双酶切片段酶连，所获得的重组质粒 pET32a/CB-K5按常规方法转入BL21 (DE3)后进行培养。重组质粒和重 组菌提质粒后均用PCR反应进行鉴定和序列分析，见图4。序列分析结 果正确；
4. 用基本培养基在摇瓶中培养，通过测定工程菌的生长曲线初步确 定了加诱导剂时机温度大约35°C ， pH值6. 5-7. 0，摇床转速200 r/min-260r/min，接种量8%-10%，诱导剂量0.6 mmol/L-1. 0 mmol/L，诱导时 机为工程菌生长的中后期，诱导时间6h-8h。
权利要求
1、构建原核表达融合型天蚕抗菌肽B和肿瘤血管生长抑制因子K5基因工程菌的方法，其特征在于根据已知天蚕抗菌肽Cecropin B和肿瘤血管生长抑制因子Kringle5基因序列设计相应的引物选择合适的表达载体，构建高效表达的原核工程菌株。具体步骤如下1]、天蚕抗菌肽Cecropin B的DNA序列，利用重叠区扩增法原理，设计了天蚕抗菌根据肽Cecropin B的四个片段，其中加入了NcoI和EcoRI酶切位点，通过两次PCR反应获得目的基因天蚕抗菌肽CecropinB的DNA片段，扩增产物用1％-2％的琼脂糖电泳检测；2]、肿瘤血管生长抑制因子K5基因的获得，根据肿瘤血管生长抑制因子Kringle5基因序列设计了上下游引物并在其两端分别加入了EcoRI和HindIII酶切位点及蛋白酶切位点FactorXa和羟胺切割位点，从含有肿瘤血管生长抑制因子Kringle5基因的已有质粒ThioA/L15-7中钓出目的基因，在一定条件下，通过PCR反应对肿瘤血管生长抑制因子Kringle5基因片段进行扩增，扩增产物用1％-2％的琼脂糖电泳检测；3]、在一定条件下对Cecropin B基因片段和Kringle5基因片段酶切，再将酶切产物全部进行1％-2％的琼脂糖凝胶电泳，将载体双酶切片段和Cecropin B基因片段和Kringle5基因片段的双酶切片段酶连，所获得的重组质粒pET32a/C-K5按常规方法转入BL21(DE3)后进行培养。重组质粒和重组菌提质粒后均用NcoI和HindIII双酶切鉴定后进行序列分析。进行序列分析；4]、用基本培养基在摇瓶中培养，通过测定工程菌的生长曲线确定合适的加诱导剂时机温度大约35℃，pH值6.5-7.0，摇床转速200r/min-260r/min，接种量8％-10％，诱导剂量0.6mmol/L-1.0mmol/L，诱导时机为工程菌生长的中后期，诱导时间6h-8h。
2、根据权利要求1所述的构建原核表达融合型天蚕抗菌肽B和肿瘤血管生长抑制因子K5基因工程菌的方法，其特征在于将重组蛋白的氨基酸序列设计成-lie-Glu-Gly-Arg—CB--Asn_Gly--Asn-Gly--K5，其中-Ile-Glu-Gly-Arg-为Factor X a的作用位点。
全文摘要
本发明涉及构建原核表达融合型天蚕抗菌肽B和肿瘤血管生长抑制因子K5基因工程菌的方法1.设计天蚕抗菌根据肽Cecropin B的四个片段；2.获得肿瘤血管生长抑制因子K5基因；3.进行序列分析；4.用基本培养基在摇瓶中培养。具有操作简单、实用、快捷，而且可放大至规模生产的优点。
文档编号C12N1/21GK101671687SQ20081015087
公开日2010年3月17日 申请日期2008年9月9日 优先权日2008年9月9日
发明者杨晓燕, 樊钰虎, 边六交, 超 陈 申请人:陕西北美基因股份有限公司