专利名称：一种枯草芽孢杆菌发酵生产天蚕素抗菌肽的方法
技术领域：
本发明属于生物发酵领域，更具体地说是关于一种枯草芽孢杆菌发酵生产天蚕素抗菌肽的方法。
背景技术：
抗菌肽是一类不易导致微生物产生耐药性的新型抗感染多肽。世界上发现的第一种抗菌肽是天蚕素，1980年由瑞典科学家Boman等用阴沟通杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕蛹分离得到具有抗菌活性的多肽物质，定名为天蚕素(cecropin)。随后又在其它生物体内陆续发现了多种抗菌肽，如娃皮素(magainins)、蜂毒素(melittins)、防御素(defensins)等。目前世界上已知的抗菌肽共有1500多种。由于最初人们发现这类活性多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性，因而命名为抗菌肽。随着研究工作的深入开展，发现某些 抗菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有很强的杀伤作用。天蚕素抗菌肽是由Cecropin A和Cecropin D设计合成的37个氨基酸残基组成的杂合肽，不含半胱氨酸，其中N端区域具有强碱性，两者之间有甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区，多数多肽的C端具酰胺化，酰胺化对其抗菌肽活性具有重要作用，天蚕素抗菌肽具有独特的广谱抗菌活性，体外试验已经证明它能够有效的的抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等有害菌，因此，它成为抗生素替代物的绝佳选择之一，随着研究工作的进一步深入开展，发现某些抗菌肽会对真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有很强的杀伤作用，并在其它领域也具有很好的应用前景，天蚕素抗菌肽是生物体自身合成的一种具有杀菌活性的小分子多肽、是生物体内经诱导产生的一种重要免疫因子，多数具有强碱性，热稳定性，对生物的天然免疫起关键作用，其作用于细菌细胞膜，导致膜通透性增大，以此穿透，杀灭细菌，细菌必须改变膜的结构，即改变相当部分的基因才能防御天蚕素抗菌肽的进攻，而这几乎是不可能的，因此，天蚕素抗菌肽极大的减少了产生耐药性的可能。
发明内容
本发明提供了一种天蚕素抗菌肽基因转化枯草芽孢杆菌发酵生产方法。将含天蚕素抗菌肽基因质粒转化到基因工程枯草芽孢杆菌中，在适宜的条件下成功表达天蚕素抗菌肽基因并分泌天蚕素抗菌肽到菌体外，方法的工艺主要包括摇瓶培养、种子罐培养、发酵罐发酵，具体工艺过程如下
(I)摇瓶培养
按照配方配制I. 5L培养基，平均分装于20个IOOOml三角烧瓶中，高温灭菌冷却后，用试管菌种接种，接种量I :500，摇床培养，搅拌速度为225rpm/min，温度37°C，培养时间12小时，检验合格后得菌种，待用。培养基配方为
蛋白胨 15g 酵母提取物7. 5g食盐7. 5g
用蒸懼水定容至I. 5L ；
(2)发酵罐发酵
按照配方配制20m3培养基，高温灭菌冷却至37°C，移种量1:70，pH 5. 5 6.0，温度37°C，补料前通气量0.6 :1、补料后通气量0.8 :1、补料8小时后至放罐通气量1.2 :1，搅拌速度为80 90 rpm/min,每2小时取样检测，OD_在O. 6 I时补料，整体发酵时间为24 26小时，检测合格后放罐。培养基配方为
玉米3%
豆柏1. 8%
蛋白胨1%
硫酸铵1%
葡萄糖0. 3%
磷酸二氢钾O. 3%
麦芽糖5. 5%
消泡剂O. 02%
其中培养基组分中的固形物与液体的比例为10% ；
当发酵生产菌种用量超过10升时，方法的工艺主要包括摇瓶培养、种子罐培养、发酵罐发酵，具体工艺过程如下
(1)摇瓶培养
按照配方配制I. 5L培养基，平均分装于20个IOOOml三角烧瓶中，高温灭菌冷却后，用试管菌种接种，接种量I :500，摇床培养，搅拌速度为225rpm/min，温度37°C，培养时间12小时，检验合格后得菌种，待用。培养基配方为
蛋白胨 15g 酵母提取物7. 5g 食盐7. 5g
用蒸懼水定容至I. 5L ；
(2)种子罐培养
按照配方配制300L培养基，高温灭菌冷却至37°C，接种方式为火焰接种，接种量I 200，pH6. O 7. 0，温度37°C，搅拌速度为35 40rpm/min，每2小时取样检测一次，OD600在O. 6 I时补料，发酵时间为20 24小时，显微镜检测菌体数量多，大小均一，没有其它杂囷生长，合格后，放iiS用。培养基配方为
玉米面3%
豆柏1. 8%
蛋白胨1%
硫酸铵1%
葡萄糖0. 3%磷酸二氢钾0. 3%
消泡剂0. 02%
(3)发酵罐发酵
按照配方配制20m3培养基，高温灭菌冷却至37°C，移种量1:70，pH 5. 5 6.0，温度37°C，补料前通气量0.6 :1、补料后通气量0.8 :1、补料8小时后至放罐通气量1.2 :1，搅拌速度为80 90 rpm/min,每2小时取样检测，OD_在O. 6 I时补料，整体发酵时间为24 26小时，检测合格后放罐。培养基配方为
玉米3%
豆柏1. 8%
蛋白胨1%
硫酸铵1%
葡萄糖0. 3%
磷酸二氢钾O. 3%
麦芽糖5. 5%
消泡剂O. 02%
其中培养基组分中的固形物与液体的比例为10% ；
本发明中所用的含天蚕素抗菌肽基因质粒转化的工程枯草芽孢杆菌可用现有的基因工程手段得到。具体可参考ZL200810132258. I公开的方法得到。本发明中所用的培养基组分中的固形物与液体比例优先方案为10%;
利用该发酵培养方法生产的天蚕素抗菌肽杀菌效价高，质量稳定，可大规模工业化生产，生产周期短并且成本低。
具体实施例方式下面结合实施案例对本发明的方法作进一步的说明。实施例I 一次IOL发酵罐的天蚕素抗菌肽的生产 I、摇瓶培养
按照配方配制200ml培养基，平均分装于3个500ml三角烧瓶中，高温灭菌冷却后，用试管菌种接种，接种量I :500，摇床培养，搅拌速度为225rpm/min，37°C培养12小时，检验合格后得菌种，待用。培养基配方为
蛋白胨2g
酵母提取物Ig 食盐Ig
用蒸馏水定容至200 mL，高压灭菌备用。2、发酵罐发酵
按配方配制7L培养基，高温灭菌冷却至37°C，接种方式为火焰接种，接种量1:35，pH6. O 7. 0，温度37°C，搅拌速度为225rpm/min，每2小时取样检测一次，发酵时间为20 24小时，OD6c 在O. 6 I时补料，显微镜检测菌体数量多，大小均一，没有其它杂菌生长，合格后，放 用；
培养基配方为
玉米3%
豆柏1. 8%
蛋白胨1%
硫酸铵1%
葡萄糖0. 3%· 磷酸二氢钾O. 3%
麦芽糖5. 5%
消泡剂O. 02%
实施例2 —次Im3发酵罐天蚕素抗菌肽的生产 I、摇瓶培养
按照配方配制3L培养基，平均分装于20个IOOOml三角烧瓶中，高温灭菌冷却后，用试管菌种接种，接种量I :500，摇床培养，搅拌速度为225rpm/min，37°C培养12小时，检验合格后得菌种，待用。培养基配方为
蛋白胨30g
酵母提取物15g mL 食盐 15g
用蒸馏水定容至3L，高压灭菌备用。2、发酵罐发酵
按照配方配制600L培养基，高温灭菌冷却至37°C，接种方式为火焰接种，接种量I 200，pH6. O 7. 0，温度37°C，搅拌速度为35 40rpm/min，每2小时取样检测一次，OD600在O. 6 I时补料，发酵时间为20 24小时，显微镜检测菌体数量多，大小均一，没有其它杂囷生长，合格后，放iiS用。培养基配方为
玉米3%
豆柏1. 8%
蛋白胨1%
硫酸铵1%
葡萄糖0. 3%
磷酸二氢钾O. 3%
麦芽糖5. 5%
消泡剂O. 02%
实施例3 —次30 m3发酵罐天蚕素抗菌肽的生产 I、摇瓶培养
按照配方配制I. 5L培养基，平均分装于20个IOOOml三角烧瓶中，高温灭菌冷却后，用试管菌种接种，接种量I :500，摇床培养，搅拌速度为225rpm/min，37°C培养12小时，检验合格后得菌种，待用。
培养基配方为
蛋白胨 15g 酵母提取物7. 5g 食盐7. 5g
用蒸馏水定容至I. 5L,高压灭菌备用。2、种子罐培养
按照配方配制300L培养基，高温灭菌冷却至37°C，接种方式为火焰接种，接种量I 200，pH6. O 7. 0，温度37°C，搅拌速度为35 40rpm/min，每2小时取样检测一次，OD600在O. 6 I时补料，发酵时间为20 24小时，显微镜检测菌体数量多，大小均一，没有其它杂囷生长，合格后，放iiS用。培养基配方为
玉米面3%
豆柏1. 8%
蛋白胨1%
硫酸铵1%
葡萄糖0. 3%
磷酸二氢钾0. 3%
消泡剂0. 02%
3、发酵罐发酵
按照配方配制20m3培养基，高温灭菌冷却至37°C，移种量1:70，pH 5. 5 6.0，温度37°C，补料前通气量0.6 :I、补料后通气量0.8 :I、补料8小时后至放罐通气量1.2 :1，搅拌速度为80 90 rpm/min,每2小时取样检测，0D_在O. 6 I时补料，整体发酵时间为24 26小时，检测合格后放罐。培养基配方为
玉米3%
豆柏1. 8%
蛋白胨1%
硫酸铵1%
葡萄糖0. 3%
磷酸二氢钾O. 3%
麦芽糖5. 5%
消泡剂O. 02%。
权利要求
1.一种枯草芽孢杆菌发酵生产天蚕素抗菌肽的方法，包括 (O摇瓶培养按照配方配制I. 5L培养基，平均分装于20个IOOOml三角烧瓶中，高温灭菌冷却后，用试管菌种接种，接种量I :500，摇床培养，搅拌速度为225rpm/min，温度37°C,培养时间12小时；培养基配方为 蛋白胨 15g 酵母提取物7. 5g 食盐7. 5g 用蒸懼水定容至I. 5L ； (2)发酵罐发酵按照配方配制20m3培养基，高温灭菌冷却至37°C，移种量1:70，pH 5.5 6. 0，温度37°C，补料前通气量O. 6 :I、补料后通气量O. 8 :1、补料8小时后至放罐通气量I. 2 :1，搅拌速度为80 90 rpm/min，每2小时取样检测，OD6tltl在O. 6 I时补料，整体发酵时间为24 26小时,培养基配方为 玉米3% 豆柏1. 8% 蛋白胨1% 硫酸铵1% 葡萄糖0. 3% 磷酸二氢钾O. 3% 麦芽糖5. 5% 消泡剂O. 02%。
2.根据权利要求I所述的天蚕素抗菌肽基因转化枯草芽孢杆菌生产方法，其特征在于发酵生产时菌种用量超过IOL时，在摇瓶培养后和发酵罐发酵前进行种子罐培养，按照配方配制300L培养基，高温灭菌冷却至37°C，接种方式为火焰接种，接种量I 200，pH6. O 7.0，温度37°C，搅拌速度为35 40rpm/min，每2小时取样检测一次，OD600在O. 6 I时补料，发酵时间为20 24小时；培养基配方为 玉米面3% 豆柏1. 8% 蛋白胨1% 硫酸铵1% 葡萄糖0. 3% 磷酸二氢钾0. 3% 消泡剂0. 02%。
3.根据权利要求I或2所述的天蚕素抗菌肽基因转化枯草芽孢杆菌发酵生产方法，其特征在于培养基组分中的固形物与液体的比例为10%。
全文摘要
本发明属于生物发酵领域，涉及一种枯草芽孢杆菌发酵生产天蚕素抗菌肽的方法，将天蚕素抗菌肽基因质粒转化的枯草芽孢杆菌在合适的培养基和培养条件下，表达天蚕素抗菌肽基因并分泌天蚕素抗菌肽到菌体外，发酵液天蚕素抗菌肽的有效成分含量为≥1.5mg/ml，该方法生产的天蚕素抗菌肽杀菌效价高，生产工艺简便，质量稳定，可规模生产，优化养殖生态环境，生产周期短且成本低。
文档编号C12P21/02GK102952835SQ201110250209
公开日2013年3月6日 申请日期2011年8月29日 优先权日2011年8月29日
发明者谯仕彦, 何涛, 郭文江 申请人:中农颖泰林州生物科园有限公司