芽孢杆菌新菌株及其发酵产物的制备方法和发酵产物在防治梨黑斑病中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及芽抱杆菌的新菌株，同时还设及该新菌株的发酵产物的制备方法，W 及该发酵产物在防治梨黑斑病中的应用，属于微生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 梨黑斑病是一种危害严重的世界性气传真菌病害，由链格抱（Alternaria alternata)引起，在梨果义自U和义后均有发生。
[0003] 我国是梨种植和出口大国，采后病原微生物的侵染造成采后腐烂损失严重，直接 影响梨果胆运生产，梨黑斑病的有效防治成为梨产业中急待解决的问题。
[0004] 使用化学杀菌剂控制水果的采后病害一直被认为是最有效的控制方法。然而，随 着病原菌抗药性的逐渐增加，及人们对水果质量要求的提高和环保意识的加强，果蔬采后 生物防治方法作为一种控制采后病害的新途径，逐渐为人们所认可，并成为研究热点。
[0005] 近年，有不少关于梨黑斑病生物防治的研究报道，例如：
[0006] 齐东梅等筛选了一株枯草芽抱杆菌(Bacillus SUbtiliS化110,其发酵液对梨采 后黑斑病的防治率达到86.6% ;
[0007] 谢莉从±壤中分离到金色链霉菌(Streptomyces aureus)B-105,其发酵液对梨黑 斑病的抑制率67.4%;
[000引 Benbow等研究了隐球酵母属的Cryptococcus informominiatus和红酵母属的 Rhodotorula glutinis对梨病害的抑菌效果，CiTptococcus informominiatus和 化odotorula glutinis在采收前Id对梨进行处理，能有效地控制梨的采后黑斑病；
[0009] 宋聪等分离到一株枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)J18,梨果在菌悬液中浸果 30s，惊干后喷施接种链格抱菌，梨黑斑病的发病率仅为16.57%，且菌株能在梨果上很好地 定殖。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于提供一种芽抱杆菌的新菌株，该新菌株的发酵产物能有效防治 梨黑斑病。
[ocm]为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
[0012] 一株解淀粉芽抱杆菌(BaciIlus am^olique化ciens)新菌株ZG2，其特征在于，前 述解淀粉芽抱杆菌(BaciIlus amyIoliquefaciens)新菌株ZG2为W保藏号CGMCC No. 11868 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、的菌株。
[0013] 一种芽抱杆菌（BaciIlus amyIoliquefaciens)新菌株ZG2的发酵产物的制备方 法，其特征在于，包括W下步骤：
[0014] StepU制备种子液：
[0015] 将新鲜芽抱杆菌(8日(3；[11118日1]171〇119116'日(316]13)新菌株262单菌落接种于溶菌肉 汤培养液中，28°C下震荡恒溫培养，制得芽抱杆菌(Bacillus amyIoliquefaciens)新菌株 ZG2的种子液；
[0016] Step2、制备发酵液：
[0017] 将芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)新菌株ZG2的种子液接入溶菌肉汤 培养液中，28°C下震荡恒溫培养，制得芽抱杆菌(BaciIlus amyIolique化Ciens)新菌株ZG2 的发酵液。
[0018] 前述的制备方法，其特征在于，在Stepl和Step2中，前述溶菌肉汤培养液的配方如 下:酵母粉5g、蛋白腺10g、NaCl 5g、琼脂粉18g、蒸馈水1000ml，抑7.4-7.6。
[0019]前述的制备方法，其特征在于，在Step2中，芽抱杆菌（Bacillus amyIoliquefaciens)新菌株ZG2的种子液的接种比例为1 %。
[0020]前述的制备方法，其特征在于，在Step2中，震荡恒溫培养的时间为72h。
[0021 ] 本发明的有益之处在于：芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)新菌株ZG2的 发酵产物可W有效防治梨黑斑病，防治机会多，生防效果好，其中：在梨果采收前防治，防治 效果可W达到90% W上;在梨果采收后立即防治，防治效果可W达到82% W上;在梨果预冷 后防治，防治效果可W达到65% W上;如果将不同时期结合防治，效果更好。
【附图说明】
[0022] 图1是芽抱杆菌(BaciIlus amyIoIiquefaciens)新菌株ZG2在透射电镜下的形态 特征；
[0023] 图2是28°C时芽抱杆菌（BaciIlus amyIoliquefaciens)新菌株ZG2在梨果伤口上 的生长动态；
[0024] 图3是20°C时芽抱杆菌（BaciIlus amyIoliquefaciens)新菌株ZG2在梨果伤口上 的生长动态；
[00巧]图4是4°C和0°C时芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)新菌株ZG2在梨果伤 口上的生长动态。
【具体实施方式】
[0026] W下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
[0027] 第一部分:解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)新菌株ZG2 [00巧]新菌株已做保藏。
[0029] 保藏日期:2015年12月11日。
[0030] 保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、。
[0031] 保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0032] 保藏编号：CGMCC No. 11868。
[0033] 新菌株是从山西省原平市石封村要果实表面分离并纯化得到的。分离纯化的具体 过程如下：
[0034] (1)将采摘的要果用0.05M的憐酸缓冲液浸泡，在摇床上10化pm/min震荡IOmin，收 集洗液；
[0035] (2)再次用0.05M的憐酸缓冲液浸泡上述要果，超声清洗30min，收集洗液；
[0036] (3)用稀释平板法，将收集的洗液连续稀释，分别取0.1 mL涂布于溶菌肉汤培养基 平板上，每个稀释度重复3次；
[0037] (4)在30°C下培养2地-4她，观察菌株生长情况；
[0038] (5)待长出菌落后，挑取菌落形态差异明显的单菌落，在溶菌肉汤培养基上进行纯 化培养，并编号。
[0039] 新菌株具有W下特征：
[0040] (一)形态学特征
[0041 ] (1)在溶菌肉汤培养基上培养4她-72h，新菌株ZG2呈革兰氏阳性菌，杆状，大小为 (0.8皿-1.2皿）X (1.6皿-2.5皿），有鞭毛(见图1);
[0042] (2)在溶菌肉汤培养基平板上好氧培养2地-4她后，产生初期为凸起、表面粘稠、边 缘不规则的乳白色菌落，后期为皱缩变干的浅黄色菌落。
[0043] 溶菌肉汤培养基(pH 7.4-7.6)的配方如下：酵母粉5g，蛋白腺lOg，化Cl 5g，琼脂 粉ISg，蒸馈水1000ml。
[0044] (二)生理生化特征
[0045] (1)新菌株为兼性厌氧菌，生长抑范围为5.5-7.5，生长溫度范围为5°C-40°C，NaCl 浓度范围2 %-6 %;
[0046] (2)其他生理生化指标如下表所示：
[0047] 新荫株半理半化据佈
[004引
[0049]
[(K)加 ](S)基因特征
[0051 ] 经16S rDNA序列测定，PCR扩增得到新菌株的16S rDNA片段，测序长度为145化P， 将新菌株的16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对，结果表明，新菌株与 Bacillus amyloliquefaciens(GU125620)相似度达到100%。
[0052]结合形态特征、生理生化指标和基因特征，我们最终确定分离纯化得到的菌株为 芽抱杆菌(8日。;[11118日111710119116化(316]13)新菌株262。
[0化3] 第二部分:制备芽抱杆菌(8曰(3；[11118曰1]171〇119116化(316]13)新菌株262的发酵产物
[0054]第1步:制备种子液
[005日]从试管斜面上用接种针挑取一环新鲜芽抱杆菌（BaciIlus amyIoliquefaciens) 新菌株ZG2单菌落，接种于溶菌肉汤培养液中，28°C、160rpm/min震荡恒溫培养24h，制得芽 抱杆菌(Bacillus amyIoliquefaciens)新菌株ZG2的种子液。
[0056] 溶菌肉汤培养液(pH 7.4-7.6)的配方如下：酵母粉5g、蛋白腺lOg、化Cl 5g、琼脂 粉18g、蒸馈水1000ml。
[0057] 第2步:制备发酵液
[0化引将芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefa