一种克鲁弗毕赤酵母及其制备无醇杨梅发酵果汁的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种克鲁弗毕赤酵母及其制备无醇杨梅发酵果汁的方法，属于微生物 发酵技术领域。
【背景技术】
[0002] 杨梅(Red bayberry)是我国南方特色水果，其果实球形，色泽艳丽，酸甜多汁，风 味浓郁，可食率达到90% W上，富含糖、有机酸和多种维生素，还含有花青素、多酪W及巧、 憐、铁、钟等矿物质，具有很高的营养和医疗保健价值。杨梅的消费方式W鲜食为主，由于盛 产于梅雨季节且胆藏期短，导致大量积压、腐烂。因此杨梅相关产品的开发非常有必要。市 场上的杨梅产品主要有杨梅汁、杨梅浸泡酒、杨梅果酒、杨梅罐头和杨梅果脯等，然而运些 产品已不能满足人们对新鲜口感的追求。
[0003] 目前，人们越来越倾向于富含发酵香味和原果清香的发酵饮料，无醇发酵果汁应 运而生。其具有较低的酒精度《0.5%)，并能较大程度的保持原汁的营养成分、风味和色 泽，适合女±、老人、儿童和司机等各类人群。国内对无醇发酵果汁的研究处于起步阶段，目 前尚没有关于无醇杨梅发酵果汁的研究。
[0004] 市售酵母主要是葡萄酒活性干酵母或商业酵母，应用运些酵母酿造时采用的抑普 遍较高，一般为3.5左右，其最适发酵抑为4.0 W上。而杨梅汁抑一般为3.0左右，当调整发酵 pH为3.5时，杨梅花色巧的稳定性会变差，导致杨梅花色巧在酿制过程中大量损失，产品稱 色严重，与杨梅汁鲜艳的红色相去甚远，因此在发酵杨梅汁时不宜调整抑值。此外，大部分 市售葡萄酒活性干酵母或产香酵母在抑为3.0时不仅发酵性能受抑制，而且产香能力较弱； 关于无醇发酵果汁的研究多采用低溫发酵（10-20°C ) W控制发酵速度和积累发酵香味，导 致发酵周期较长，且耗电量较多。为去除果酒中的乙醇W控制乙醇含量小于0.5%，目前大 多采用物理方法(蒸馈法、反渗透等），但是其设备投入和耗电量巨大。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一株克鲁弗毕赤酵母(PicMa kluyveri) XTl 10,于2015年10月20日保藏于中国典型微生物保藏中屯、，保藏编号为CCTCC NO: M 2015626,保藏地址为中国武汉武汉大学。
[0006] 所述克鲁弗毕赤酵母在显微镜下呈楠圆形，大小为(3.0-4.5)皿X (6.0-8.5)皿， 生殖方式为多端出芽生殖。菌落为白色，中间凸起，表面干燥有權皱，边缘不整齐，大小为 3.2-4.2mm，有浓郁的果香产生。
[0007] 所述克鲁弗毕赤酵母在培养溫度20-35°C或糖含量30%或抑为2.5的灭菌杨梅汁 培养基中，均能在24h内产气充满杜氏管。
[000引所述克鲁弗毕赤酵母在抑5.0,溫度28°C条件下，活化化即达到对数期末期，酵母 数为2 X IO8C化/血左右，可用于接种。
[0009]本发明要解决的第二个技术问题是提供一种应用所述克鲁弗毕赤酵母制备无醇 杨梅发酵果汁的方法，弥补市场上关于无醇杨梅发酵果汁的空白及克服现有无醇果汁、果 酒加工技术的不足，W获得一种色泽鲜艳、酒精度低(<0.5%)、花色巧含量高、果香浓郁、口 感协调的无醇杨梅发酵果汁。
[0010] 所述方法包括W下步骤：
[0011] (1)原料处理：W杨梅果作为原料，清洗去核后棒汁并过滤，所得清汁与干杨梅渣 灭菌并迅速冷却至室溫；
[0012] (2)菌种活化:将克鲁弗毕赤酵母CCTCC N0:M 2015626进行活化，制得种子液；
[0013] (3)主发酵:从种子液中收集获得克鲁弗毕赤酵母CCTCC N0:M 2015626的菌泥，冲 洗入灭菌清汁中，15-35°C培养箱中好氧发酵I-IOh后，相同溫度下厌氧发酵至失重1.0-2.8g/L时停止发酵，倒罐、过滤除去滤渣；
[0014] (4)后发酵:将过滤后的发酵液在4-8°C下静止培养20-30d，得到原酒，调整糖酸比 后，灭菌即得产品。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，步骤（1)选用成熟度高、无腐烂、色泽较深的杨梅果 作为原料。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，步骤(1)清汁与干杨梅渣于100°C灭菌5min并迅速冷 却至室溫。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，步骤(2)将克鲁弗毕赤酵母CCTCC N0:M 2015626W Yro培养基进行=级活化。
[0018] 在本发明的一种实施方式中，步骤(2)将克鲁弗毕赤酵母CCTCC N0:M 2015626从 YPD斜面上挑取到新鲜的YPD平板上，28°C生化培养箱中培养24h后，用接种环挑取3环至 50mL抑为5.0的YPD液体培养基中，28°C、ISOrmp培养12h，再按照10%接种量接种到IOOmL pH为5.0的YPD液体培养基中，相同条件下活化化，再用无菌水调整种子液浓度为2 X 1〇8。化/血。
[0019] 在本发明的一种实施方式中，步骤(3)清汁装液量为50%，干杨梅渣添加量为20-140g/L〇
[0020] 在本发明的一种实施方式中，步骤(3)干杨梅渣添加量为80g/L。
[0021] 在本发明的一种实施方式中，步骤(3)按照5% (v/v)的接种量将克鲁弗毕赤酵母 CCTCC N0:M 2015626的种子液离屯、获得酵母泥，用灭菌杨梅汁将菌泥冲洗入灭菌培养基 中，15-35°C好氧培养I-IOh后，相同溫度下厌氧发酵至失重为1.0-2.8g/L时停止，倒罐、过 滤除渣。
[0022] 在本发明的一种实施方式中，步骤(3)发酵溫度为28°C，好氧发酵4h，厌氧发酵失 重为 2.3±0.2g/L。
[0023] 在本发明的一种实施方式中，步骤(4)后发酵:将过滤后的发酵液转入灭菌容器 中，装液量95%，4-8°C下静止培养20-30d，得到原酒，调整糖酸比后，己氏灭菌即得产品。
[0024] 与现有技术相比，本发明有W下有益效果：
[0025] (1)本发明所提供的克鲁弗毕赤酵母CCTCC N0:M 2015626对发酵无醇杨梅果汁有 较强针对性，可W发酵自然pH(2.8-3.0)下的杨梅汁，发酵过程不需额外加糖，仅利用杨梅 汁中的还原糖即可，简化了发酵工艺。而购买的安琪酵母BV818则几乎没有起酵。发酵工艺 未优化前，用克鲁弗毕赤酵母CCTCC N0:M 2015626发酵的无醇杨梅果汁花色巧含量高达 106111肖/1，比市售的安琪葡萄酒活性干酵母1?￥171高103.2%;产香能力强，用其发酵的果汁 醇香和果香比较浓郁，且杨梅风味突出，而RV171发酵的果汁果香醇香较淡，酒精味相对明 显；就口感而言，用其发酵的杨梅果汁杨梅滋味显著，口感纯正，余香明显，而RV171则相对 单薄;经过感官评价得出克鲁弗毕赤酵母CCTCC NO:M 2015626发酵的无醇杨梅发酵果汁比 RV171感官分数高25.9分。本发明提供的克鲁弗毕赤酵母CCTCC NO:M 2015626更适合用于 酿制无醇杨梅发酵果汁。
[0026] (2)无醇发酵果汁一般通过低溫发酵来降低酵母产酒精的能力并通过时间的累积 增加发酵果汁中的香气，但是其发酵周期相对较长，可能超过20d或W上。本发明的发酵溫 度为28°C，发酵时长在24h内，不仅缩短了发酵周期，还节省了大量资金。
[0027] (3) -般来讲，果酒在发酵过程均采用厌氧发酵，运样发酵后的果汁酒精度必然会 较高，不容易控制，产品香气相对于乙醇会比较弱。本发明在厌氧发酵之前增加好氧发酵阶 段，并将好氧时间控制在4h，既利于酵母生长，又利于酵母产香，还可W防止好氧时间过长 引起的醋氧化;此外本发明还控制了厌氧发酵的时间，在失重为2.3±0.2g/L时停止发酵， 运样就可W使发酵果汁的酒精度控制在0.5% W内。
[0028] (4)杨梅酒在发酵过程一般采用清汁发酵，是由于全果发酵时果渣会吸附大量果 汁，酵母与果汁接触的面积较小，发酵过程受阻;但是清汁发酵往往由于花色巧结构破坏而 使其色泽相对较淡。本发明通过控制杨梅渣添加量既保证发酵果汁有较好的色泽，又能减 少杨梅渣对发酵进度的阻碍，还能为发酵汁增加更多的杨梅风味。
[0029] 综上所述，本发明开发出的适合酿造无醇杨梅发酵果汁的菌种及其酿造方法具有 非常大的市场前景。
[0030] 生物材料保臧
[0031] 一株克鲁弗毕赤酵母(Pichia kluyveri)XT110,于2015年10月20日保藏于中国典 型微生物保藏中屯、，保藏编号为CCTCC N0:M 2015626,保藏地址为中国武汉武汉大学。
【具体实施方式】
[0032] 实施例1克鲁弗毕赤酵母CCTCC N0:M 2015626的选育
[0033] (1)酵母菌的分离:将从无锡雪浪山杨梅果园采集的上壤投入IOOmL无菌生理盐水 中，用旋满混合器振荡IOmin后，取1血上清液加入50mL抑为3.0的YTO液体培养基中，28°C、 15化/min振荡培养24h。取ImL浑浊样品的菌液进行10倍梯度稀释并涂布，28°C倒置培养 2地。得出有25株具有酵母典型形态特征的菌株，将其划线保存在Yro斜面上。
[0034] (2)酵母菌的活化：取斜面上的酵母3环接种至50mL YPD液体培养基中，28°C、 15化pm下摇床培养12h，用无菌生理盐水调整至菌液浓度为2 X IO8C化/血。
[0035] (3)杨梅汁发酵培养基的配制:选用成熟度高、无腐烂、色泽较深的杨梅果作为原 料，清洗后去核棒汁并用纱布过滤，装液量为1/2，100°C灭菌5min并迅速冷却至室溫；
[0036] (4)酵母菌的筛选：
[0037] -级筛选(杜氏管法）：将酵母活化后按照10%接种量接种到IOmL杨梅汁发酵培养 基中（内含杜氏管），24°C静置发酵4她，每隔1化观察一次产气情况。试验结束后观察发酵液 色泽、闻气味。最终筛选出4株酵母发酵液色泽相对较好，气味相对浓郁且能在4她内产气充 满杜氏管。
[0038] 二级筛选(=角瓶发酵法）：将酵母活化后，按照5%接种到灭菌杨梅汁发酵培养基 中，24°C加发酵栓静止培养，每隔化摇动1次，至失重为2.3±0.2g/L时结束(经预实验确定 失重为2.8g/L时酒精度为0.5% )。测定酒精度、花色巧含量、残糖和总酸，并结合感官分析 对发酵液色泽、香气、滋味和口感进行打分。W安琪葡萄酒活性干酵母RV171和BV818为对 照。表1为无醇杨梅发酵果汁的感官评分标准，表2为不同菌株发酵无醇杨梅发酵果汁的理 化指标。
[0039] 表1无醇杨梅发酵果汁感官评分标准 [Ofunl
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[0043]由表2可知，前5株菌所发酵的无醇果汁酒精度均为0.4%，小于0.5%，符合无醇果 汁的相关规定;花色巧含量具有显著性差异(P<