棒束孢微菌核的培养方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制剂领域，具体设及棒束抱微菌核的培养方法及其在防治害虫方 面的应用。
【背景技术】
[0002] 粉風类刺吸式口器的害虫常群集于叶片、嫩茎、花蕾、顶芽等部位，刺吸汁液，使叶 片皱缩、卷曲、崎形，严重时引起枝叶枯萎甚至整株死亡，危害于多种农作物、果木、蔬菜等。 目前刺吸式口器害虫防控主要依靠化学防治，化学农药的大量施用导致害虫抗药性产生， 并且污染生态环境、影响蔬菜农产品安全、威胁人民身体健康;还大量杀伤害虫天敌，破坏 生态平衡。
[0003] 棒束抱(Isaria)是一类能够寄生于多种害虫的虫生真菌，能穿透害虫体表进入体 内，在害虫体内繁殖消耗寄主营养使害虫致死，能造成害虫局域内的流行性病发生；同时具 有不污染环境、无残留、对人畜无害、害虫不会产生抗药性等优点，已经越来越广泛地应用 到害虫的生物防治。由于液体发酵产生的芽生抱子有不耐储存，致病力低等缺陷，不适宜作 为杀虫制剂的有效成分。目前利用棒束抱进行生物防治的有效成分为分生抱子，是通过液 固两相发酵工艺进行生产的，但棒束抱产抱需要光照刺激，生产周期长、并且分生抱子抗逆 能力差、货架期短，导致生产成本偏高，田间防效不稳，影响了棒束抱的产业化与实际应用。
[0004] 寄生真菌主要类群为丝状真菌，通常产生菌丝体和分生抱子，少数种类也可产生 厚垣抱子。真菌微菌核是丝状真菌度过高溫、低溫或干旱等不良环境的休眠繁殖体，是菌丝 体互相纠结，菌丝变异分化产生的外层致密坚硬、有色素沉淀，内层髓质化的组织体，能够 在一定的湿度和溫度条件下，重新萌发进行产抱。目前已证实虫生真菌液体诱导产生的微 菌核能够作为一种分生抱子的替代有效成分，应用于生物防治。目前寄生真菌的菌核或微 菌核的诱导形成仅在白僵菌、绿僵菌和野村菌有报导，而棒束抱微菌核诱导形成未见报导。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对上述问题，提供一种可规模化生产棒束抱微菌核的培养方法 及其应用，开发生产成本低、侵染活力高、抗逆性强的棒束抱新侵染结构体，提供一种防治 害虫的生防制剂，为杀虫真菌制剂的创制提供高质量的母药或原粉，解决目前没有有效的 棒束抱微菌核的培养方法，和传统抱子菌剂抗逆能力差、货架期短，胆运不便的共性技术难 题。
[0006] 本发明的目的是运样实现的：
[0007] -种棒束抱微菌核的培养方法，其特征在于:包括W下步骤：
[000引1)制备棒束抱抱子接种体；
[0009] 2)微菌核诱导培养:将步骤1中制备的棒束抱抱子接种体加入诱导培养液中振荡 培养6~8天；
[0010] 所述诱导培养液中含有的原料及其含量如下：
[0011] KH2P04:3.0~5.0g/L、CaCl2.2H20:0.6~1.0g/L、MgS04?7H20:0.4~0.8g/L、 C0CI2 ? 6出0:：M~40mg/L、MnS〇4 ?出0:14~20mg/L、ZnS〇4 ? 7出0:12~16mg/LJeS〇4 ? 7出0: 0.1 ~0.4g/L、维生素K3:0.0096-0.0 l72g/L、二甲亚讽溶液：0.05-0 . ImL/L、葡萄糖：12~ 40g/L、酵母膏:4~6g/L、蛋白腺:2.0~3. Og/L;
[0012] 3)将步骤2)振荡培养得到的发酵液过滤，弃去上清液，得到沉淀微菌核，干燥，保 存。
[0013] 步骤1)中所述制备棒束抱抱子接种体的方法为:将活化的棒束抱的抱子或菌丝体 接种于PDA平板培养基上，在22~25°C下培养10~14天，用0.1~0.5%Tween-80将平板上的 分生抱子洗下，制备成抱子悬浮液，接种到1/4SDA液体培养基中培养24-3化，即得到用于微 菌核诱导培养的接种体。
[0014] 步骤2)中所述棒束抱抱子接种体加入诱导培养液中后的培养条件为25~28°C， 200~25化pm振荡培养。
[001引作为优选地，步骤2)中所述诱导培养液中含有的原料及其含量如下:K出P04:3.5~ 4.5邑/1、化(：12*2出0:0.7~0.9邑/1、]\%504.7出0:0.5~0.7邑/1、(：〇(：12.細20:36~38111邑/1、 MnS〇4 ?此0:15~17mg/L、ZnS〇4 ? 7此0:13~15mg/L、FeS〇4 ? 7出0:0.15~0.35邑/1、维生素 K3:0.0096-0.0172g/L、二甲亚讽溶液：0.05-0.1 mL/L、葡萄糖：17~35g/L、酵母膏：4.5~ 5.5邑/1、蛋白腺:2.0~3.0邑/1。
[0016] 本发明的另一目的在于提供一种上述培养方法获得的棒束抱微菌核在防治粉風 类害虫中的应用。应用方式为:将上述培养方法获得的棒束抱微菌核干燥后与娃藻±或高 岭± W及助剂按重量比为微菌核;娃藻±或高岭±:助剂= 8-10: 85-88: 2-5混合后成为微 菌核细粒剂，用于防治粉風类害虫。
[0017] 作为优选地，所述助剂为薦糖醋或黄原胶。
[0018] 本发明的另一目的在于提供一种防治粉風类害虫的生防制剂，包含通过上述培养 方法获得的棒束抱微菌核和辅料。
[0019] 本发明的有益效果是:本发明首次用液体发酵法能稳定大量产生棒束抱微菌核， 产生的微菌核能够适应高溫、干旱、强紫外等外界不良环境，具有良好的杀虫活性、抗逆耐 储、发酵周期短，生产成本低、货架期长的特点;微菌核作为生物制剂的有效成分，可用于规 模化生产新型真菌农药，可W替代分生抱子作为丝状真菌制剂加工的有效成分。该生产过 程周期短，成本低廉，生产过程中无污染性废料产生，十分环保。本发明所用的培养液的配 制和液体发酵工序可操作性强，重复性好，所用原料易于获取。
【附图说明】
[0020] 图1为振荡培养7天后得到的棒束抱微菌核显微镜下100倍图。
[0021] 图2为干燥后的棒束抱微菌核在水琼脂上2地时萌发显微100倍图。
[0022] 图3为棒束抱微菌核在水琼脂上Hd的产抱情况图。
【具体实施方式】
[0023] 本发明所用的真菌菌株和虫源，如棒束抱和粉風，均属于公知公用的实验材料，可 通过常规的途径获得，如±壤分离或商业途径购买等。
[0024] 实施例一棒束抱微菌核诱导培养液配方优化和诱导过程
[0025] 1、棒束抱接种体制备：
[00%]将玫烟色棒束抱CQIF101菌株(来源于重庆市杀虫真菌农药工程技术研究中屯、）的 分生抱子接种到PDA平板上，在25°C条件下光照培养（16小时光:8小时黑暗）12天，用0.1~ 0.5 % Tween-80灭菌液体将平板上的成熟分生抱子洗下，调节分生抱子的浓度，制备成1.0 X IO8抱子/毫升的抱子悬浮液，接种到1/4SDA液体培养基中，在溫度为25°C，摇床转速为 25化pm条件下培养24-3化，即得到用于微菌核诱导培养的接种体。
[0027] 2、诱导培养液配方筛选
[002引1)无机营养成分浓度：
[0029] W添加 KH2P04:3.0~5.0g/L、CaCl2 ? 2此0:0.6~1.0g/L、MgS〇4 ? 7出0:0.4~0.8g/ L、CoCb ? 6出0::34~40mg/L、MnS〇4 ?出0:14~20mg/L、ZnS〇4 ? 7出0:12~16mg/L作为培养微 菌核的无机营养成分。
[0030] 2)碳、氮源的选择
[0031] 选择浓度为12~40g/L的葡萄糖作为碳源，4~6g/L酵母膏和2.0~3 . Og/L蛋白腺 作为培养基中的氮源。
[0032] 3)铁离子浓度的选择
[0033] WFeSCk ? 7此0作为诱导剂之一，Wo. Ig/L，0.2g/L，0.3g/L，0.4g/L四个浓度梯度 进行铁离子浓度的确定。
[0034] 对诱导培养液中无机营养成分、葡萄糖、酵母膏、蛋白腺、FeS化? 7出0按不同浓度 梯度进行组合，筛选最佳培养液组分。在实验中进行了大量排列组合，制作了多份培养液进 行实验，将各种液体培养基分别W IOOmL的量分装到250mLS角瓶中，pH值为5.5-6.5，进行 12rC高溫高压灭菌30分钟。将前述制备好的接种体按照5%的接种量接种到不同的培养液 中，在溫度为25~28°C，摇床转速为200~25化pm条件下进行摇床培养，每种培养液设3个重 复，在6天时进行显微观察液体培养基中产微菌核状况，计算每种培养液的平均产量。其中 有代表性的培养液的微菌核产量结果如表1所示：
[0035] 表1培养液不同浓度组分微菌核产量表
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[0038] 可见培养液中无机营养成分、葡萄糖、酵母膏、蛋白腺不同浓度对微菌核产量影响 差异不大，铁离子浓度影响差异大，可见FeS〇4 ? 7此0浓度为0.2和0.3g/L时，微菌核产量显 著高于化S〇4 ? 7出的农度为0.1和0.4g/L的培养液。
[0039] W样品8的培养液成分来筛选另一个主要诱导因子维生素K3的最佳浓度，将维生 素K3溶解在二甲亚讽溶液中加入培养液中。维生素K3不同的浓度梯度为0.0096g/L、 0.0100g/L、0.0140g/L、0.0172g/L、0.0200g/L、0.0256g/L，按照维生素 K30.0096 ~0.0256g 溶解在0.08mL(0.05~0.1 mL均可）的二甲亚讽溶液中溶解维生素K3，然后将溶液进行过滤 除菌后，加入培养液中混匀即可。然后按照前述方法对培养液灭菌、接种棒束抱接种体，进 行摇床培养，每种培养液设3个重复，在6天时进行显微观察液体培养基中产微菌核状况，