一种基因重组玫烟色棒孢霉菌If01 GM及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基因重组的玫烟色棒孢霉菌If01?GM（Isaria?fumosorosea?If01?GM）。所述菌株以B型烟粉虱TOLL样受体基因7（TLR7）为目的基因，利用pSilent-1质粒构建含TLR7基因片断的正反向载体，通过聚乙二醇（PEG4000）介导转化玫烟色棒孢霉野生菌株原生质体，最后通过阳性筛选而获得所述重组菌株。所述基因重组菌株能够沉默B型烟粉虱有TLR7基因的转录，对2龄烟粉虱若虫的致病力比原始菌株提高50%左右，杀虫速度快1~2天。所述重组菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2014年5月13日，保藏号CCTCC?NO：M?2014199。
【专利说明】-种基因重组玫烟色棒孢霉菌|f〇1 GM及其应用 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明属于生物农药【技术领域】。更具体地，涉及一种基因重组玫烟色棒孢霉菌 IfOl GM及其应用。 【背景技术】
[0002] 烟粉風iaAaci Gennadius)是一种世界性的重要农林业害虫，寄主范围 广泛，估计其寄主植物达200种以上，如葫芦科、茄科、十字花科蔬菜及棉花、烟草等重要经 济作物，都是烟粉虱的主要为害对象。另外，烟粉虱能够传播100种以上的病毒，如番茄黄 化曲叶病毒等双生病毒科的病毒，该类病毒对作物生产造成毁灭性影响。目前，烟粉虱对常 用的大部分农药已经产生了高水平的抗性，且农药污染严重问题已广受诟病。生物防治成 为防治、控制该害虫危害的一种重要手段。
[0003] 玫烟色棒抱霉（/ saria/amsiomsea )原称玫烟色拟青霉 )，是一种常见的虫生真菌，利用该菌防治烟粉風的技术已有多项国家发明 专利申请和研究报告，比如：申请号为200710031511. X的专利公开了一种玫烟色拟青霉 菌菌株（CCTCC Μ2007088)，该菌株对粉虱、蚜虫等害虫具有很强的侵染杀虫效果。申请号 为201210449949. 0的专利公开了一种玫烟色棒束孢霉菌株（CCTCC Μ 2014199)用于防治 烟粉虱。申请号为201210102631. 5的专利公开了一种利用植物源提取物提高玫烟色拟青 霉对烟粉虱侵染力的方法。申请号为201110131193.0的专利公开了一种玫烟色棒束孢 油悬浮剂及其制备方法和应用，申请号为200810220004. 5的专利公开了绿僵菌素与玫烟 色拟青霉真菌混配的杀虫剂及其制备方法，200810029253. 6公开了玫烟色拟青霉与阿维 菌素的复配杀虫剂，200810029252. 1公开了玫烟色拟青霉与高效氯氰菊酯的复配杀虫剂， 200810027586. 5公开了玫烟色拟青霉与印楝素的复配杀虫剂，200810027585. 0公开了玫 烟色拟青霉与啶虫脒的复配杀虫剂，200710031515. 8公开了玫烟色拟青霉与抗蚜威的复配 杀虫剂，200710031513. 9公开了玫烟色拟青霉与吡虫啉的复配杀虫剂，201310635250. 8公 开了玫烟色拟青霉与噻嗪酮的复配杀虫剂。但是，目前对玫烟棒束孢霉的研究主要集中在 菌株的分离鉴定、分生孢子剂型加工技术及其在烟粉虱等害虫防治应用方面。并且，由于玫 烟色棒束孢作为生物农药的有效成分是菌丝和孢子，而多种生态因子都会对真菌的萌发、 营养生长、产孢量及毒力产生不同程度的影响，因此常规的玫烟色棒束孢防治害虫的效果 易受环境的影响。
[0004] 基于RNA干扰（RNAi)的基因沉默技术是当前世界科技前沿，RNAi是指外源或内 源的双链RNA (dsRNA)特异性地引起基因表达沉默的现象，以RNAi特异性剔除或关闭昆 虫特定基因是害虫防治的新策略，为新一代生物农药的创制带来了契机。RNAi技术可通过 以下几种方式调控害虫：（1)通过转基因植物，（2)将作用于昆虫靶基因的dsRNA或siRNA 直接给药，（3)通过构建工程菌株实现。相关技术已有多项国家发明专利申请和研究报告， 例如：申请号为201310702146. 6的专利公开了一种甜菜夜蛾microRNASex-miR4924基因 及其在害虫生物防治中的应用技术，201310134472. 1公开了一种表达小菜蛾精氨酸激酶基 因 dsRNA的质粒及应用的技术，201210356675. 0公开了昆虫β-Ν-乙酰氨基葡萄糖苷酶 基因及其RNAi应用技术，201210167972. 0公开了一种基于RNAi技术防治害虫的新方法， 200780002294. X公开了一种作为昆虫防治剂的dsRNA，200710029102. 6公开了一种饲喂 dsRNA抑制昆虫基因表达的方法，200510062131. 3公开了一种鳞翅目害虫的高毒力核型多 角体病毒构建技术。但是，目前利用RNAi技术调控害虫主要集中在转基因植物和dsRNA制 剂技术等方面，尚未见有利用RNAi基因沉默技术的基因改良虫生真菌菌株研究的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服现有局限玫烟色棒孢霉在防治烟粉虱等害虫 中的缺陷和不足，提供一种基因重组改良的、防治效果更好、速度更快的玫烟色棒孢霉菌 株。
[0006] 本发明的目的是提供一种基因重组玫烟色棒孢霉菌If〇l GM。
[0007] 本发明的另一目的是提供上述基因重组玫烟色棒孢霉菌IfOl GM的构建方法。
[0008] 本发明再一目的是提供上述基因重组玫烟色棒孢霉菌IfOl GM防治在烟粉虱等害 虫中的应用。
[0009] 本发明上述目的通过以下技术方案予以实现： 本发明公开了一种基因重组玫烟色棒抱霉菌IfOl GM (/ saria/'ttmsiamsealfOlGM)， 该菌株于2014年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :M 2014199,保藏地址为中国武汉武汉大学。
[0010] 所述玫烟色棒孢霉菌IfOl GM携带有B型烟粉虱TOLL受体基因 TLR7的正反向核 苷酸片段；该菌株能够沉默烟粉虱免疫相关基因，即TOLL受体蛋白基因 TLR7。所述TLR7的 正反向核苷酸片段序列如SEQ ID N0 :1所示。
[〇〇11] 该菌株的形态学特征为： 在察氏培养基上：起初菌落规则圆形，隆起，菌丝白色，背面淡黄色或黄褐色；延长培 养，菌落呈不规则圆形，形成肉红色孢子层； 显微镜下观察：菌丝体细长，无色透明，宽度2. 7(Γ3. 8 μ m，产大量分生孢子，孢子无色 透明，柱状至椭圆形，长4. 9?6.4 μ m，宽1. 9?2.4 μ m。
[0012] 本发明还提供了一种上述基因重组玫烟色棒孢霉菌IfOl GM的构建方法，步骤如 下： 51. 构建重组质粒 511. 提取B型烟粉虱的总RNA，合成第一链CDNA ; 512. 以S11的cDNA为模板，利用引物TLR7F和TLR7R，进行PCR扩增，得目的片段； 513. 以S12目的片段为模板，分别利用引物TLR7F-1和TLR7R-1，引物TLR7F-2和 TLR7R-2，进行PCR扩增，得到正向片段和反向片段； 514. 将正向片段XhoI、HindII双酶切，经回收、纯化后，连接到XhoI、HindII双酶切过 的pSilent-Ι质粒，得P-Z质粒； 515. 将反向片段Kpnl、SphI双酶切，经回收、纯化后，连接到Kpnl、SphI双酶切过的 P_Z质粒，得重组P_Z_F质粒(正反向沉默载体）； 52. 构建重组菌株 521. 获得玫烟色棒孢霉IfBOl菌株的原生质体； 522. 重组P-Z-F质粒转化原生质体，得转化子；优选地，转化所用的方法为聚乙二醇 (PEG4000)介导转化法； 523. 转化子经过多次阳性筛选和毒力测试，得到一株能够稳定遗传且对能够高效杀灭 烟粉虱的基因重组玫烟色棒孢霉菌If〇l GM; 其中，S12所述目的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示； S12所述引物TLR7F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，TLR7R的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示； S13所述引物TLR7F-1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，TLR7R-1的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 5 所示； S13所述引物TLR7F-2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示，TLR7R-2的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 7 所示。
[0013] 优选地，S12或S13所述PCR扩增的扩增程序为：94 °C预变性4 min ; 94 °C变性 1 min，56 °C退火 30 s，72 °C延伸 45 s，30 个循环；72 °C补平 10 min。
[0014] 本发明还提供上述基因重组玫烟色棒孢霉菌IfOl GM在防治烟粉虱害虫中的应 用。
[0015] 上述基因重组玫烟色棒孢霉菌IfOl GM在制备防治烟粉虱害虫的药剂中的应用， 也在本发明的保护范围之内。
[0016] 优选地，上述烟粉虱为B型烟粉虱。
[〇〇17] 本发明所述的玫烟色棒孢霉是一种虫生真菌，能够从体壁侵入昆虫血腔，与昆虫 的免疫系统直接发生作用。因此，利用虫生真菌介导RNAi沉默昆虫免疫相关基因，将可提 高虫生真菌对害虫的防治效果。
[0018] 基于上述思考，本专利发明人利用pSilent-Ι质粒，构建B型烟粉虱免疫相关基 因-TOLL受体蛋白基因 TLR7的RNAi载体，通过聚乙二醇（PEG4000)介导转化玫烟色棒孢霉 IfBOl菌株(该菌株已在申请号为201210449949. 0的专利中公开，并于2012年10月12日 保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC Μ 2012400)，获得了本发明的基因改 良的重组玫烟色棒孢霉菌IfOl GM，于2014年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为CCTCC NO :M 2014199,保藏地址为中国武汉武汉大学。所述重组菌株生物学性 状稳定，对2龄烟粉虱若虫的致病力比原始菌株的毒力增加50%以上。
[0019] 该重组菌株的形态学特征如附图1所示，具体描述为： 在察氏培养基上：起初菌落规则圆形，隆起，菌丝白色，背面淡黄色或黄褐色；延长培 养，菌落呈不规则圆形，形成肉红色孢子层； 显微镜下观察：菌丝体细长，无色透明，宽度2. 7(Γ3. 8 μ m，产大量分生孢子，孢子无色 透明，柱状至椭圆形，长4. 9?6.4 μ m，宽1. 9?2.4 μ m。
[0020] 本发明具有以下有益效果： 本发明公开了一种基因重组玫烟色棒孢霉菌IfOl GM，并于2014年5月13日保藏于中 国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :M 2014199,保藏地址为中国武汉武汉大学。 该菌株是以B型烟粉虱TOLL受体基因 TLR7为目的基因，利用pSilent-Ι质粒构建含目的 基因正反向片断的载体，通过聚乙二醇（PEG4000)介导转化玫烟色棒孢霉野生菌株原生质 体，最后通过筛选而获得。该菌株能够沉默B型烟粉虱免疫相关基因，即TOLL受体蛋白基 因 TLR7,从而引起烟粉虱的死亡。且烟粉虱很难对这种方式产生任何的抗性作用。
[0021] 本发明的重组玫烟色棒孢霉菌If〇l GM具有更高、更快的杀虫效果，实验结果显 示，当重组菌株孢子浓度为5. OX 106个/mL时，第12天对2龄烟粉虱若虫的累计校正死 亡率为80. 00±5. 29%，野生菌株IfBOl第12天对2龄烟粉虱若虫的累计校正死亡率为 54. 67± 1. 53%，重组菌株的杀虫效率比野生菌株高50%左右。并且重组菌株的杀虫效果更 快，其半致死时间LT5(I比野生菌株少3天以上。
[0022] 本发明为烟粉虱生物防治提供了新材料，对发展绿色生态控制技术，为农林业的 可持续发展有促进作用，具有非常好的推广应用价值。 【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1为重组玫烟色棒孢霉菌IfOl GM的形态；幼嫩菌落平板的正面（A)、反面（B)， 产孢后平板的正面（C)、反面（D)及菌丝体（E)和分生孢子（F)。
[0024] 图2为P-Z-F质粒的双酶切验证电泳图；Μ泳道为Wide Range DNA Marker ;第1 泳道为P-Z-F质粒经XhoI、HindIII双酶切；第2泳道为P-Z-F质粒经SphI、KpnI双酶切。 【具体实施方式】
[0025] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明 做任何形式的限定。本发明构建重组菌株If〇l GM时，用到了分子生物学和遗传工程学等 领域使用的常规技术和方法，例如：目的基因片段克隆、原生质体制备和转化等，但是本发 明并不限定于一般性参考文献中的任何具体方法、实验方案和试剂，只要能够达到本发明 所记载的效果，任何不违背本发明的中心思想的改变、组合、替换，均应在本发明的保护范 围之内。
[0026] 除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本【技术领域】常规试剂、方法和设 备，所用试剂和材料均为市购。除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术 语具有本发明所属领域所通常理解的含义相同。
[0027] 实施例1重组质粒的构建 本发明所用的目的基因-烟粉虱的TLR7基因从B型烟粉虱转录组的序列获得 (Unigene 数据库：Unigene20701_B4592195)，其核苷酸序列如 SEQ ID N0 :10 所示。
[0028] 本发明将烟粉虱的TLR7基因的部分片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示）转 化到玫烟色棒孢霉菌株中，获得基因重组玫烟色棒孢霉菌株。具体操作步骤如下： 1、获得目的片段 (1)本发明设计所用目的基因即烟粉虱的TLR7基因的引物TLR7F和TLR7R。
[0029] 所述引物TLR7F的核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示，TLR7R的核苷酸序列如SEQ ID N0. 3 所示。
[0030] (2)用Trizol法提取B型烟粉虱的总RNA，合成第一链cDNA ;以cDNA为模板，利 用引物TLR7F和TLR7R，进行PCR扩增，得目的片段；扩增程序为：94 °C预变性4 min ; 94 °C变性 1 min，56 °C退火 30 s，72 °C延伸 45 s，30 个循环；72 °C补平 10 min。
[0031] 所得到的目的片段的大小为549 bp，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0032] 2、构建重组质粒 (1)分析目的片段和pSilent-1载体上酶切位点，选择XhoI、HindIII、KpnI、SphI四种 内切酶，在TLR7F/TLR7R上分别加上4种内切酶的酶切位点和保护碱基，得到引物TLR7F-1 和 TLR7R-1，引物 TLR7F-2 和 TLR7R-2。
[0033] 所述引物TLR7F-1的核苷酸序列如SEQ ID N0. 4所示，TLR7R-1的核苷酸序列如 SEQ ID N0. 5 所示； 所述引物TLR7F-2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示，TLR7R-2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7 所示。
[0034] (2)以SEQ ID N0.1所示目的片段为模板，分别利用引物TLR7F-1和TLR7R-1，引 物TLR7F-2和TLR7R-2,进行PCR扩增(扩增条件同上)，得到正向片段和反向片段。
[0035] (3)将正向片段Xhol、Hindll双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回 收后，用T4连接酶4°C条件下连接过夜，连接到Xh 〇I、HindII双酶切过的pSilent-Ι质粒。
[0036] 然后将连接产物转入DH-5a大肠杆菌中，挑斑，摇菌，提取P-Z质粒，基因测序， PCR验证连接是否正确。验证正确的菌进行摇菌提质粒，得到P-Z质粒。
[0037] (4)将反向片段Kpnl、SphI双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收 后，用T4连接酶4°C条件下连接过夜，连接到KpnI、SphI双酶切过的P-Z质粒。
[0038] 然后将连接产物转入DH-5 a大肠杆菌中，挑斑，摇菌，提取P-Z-F质粒，基因测序， PCR验证连接是否正确。验证正确的菌进行摇菌提质粒，得到重组P-Z-F质粒（即正反向沉 默载体)。
[0039] 另外，再用XhoI、HindII和KpnI、SphI分别双酶切P-Z-F质粒，凝胶电泳验证重组 质粒是否构建成功，电泳结果如附图2所示。
[0040] 实施例2重组菌株的构建和筛选 1、获得玫烟色棒孢霉IfBOl菌株的原生质体 所用玫烟色棒孢霉IfBOl菌株已在申请号为201210449949. 0的专利中公开。
[0041] 获取原生质体的步骤如下： (1)将玫烟色棒孢霉IfBOl菌株的分生孢子用0. 05%(v/v)吐温-80溶液配制成浓度为 108个/mL左右的孢子悬浮液。
[0042] (2)取1 mL悬浮液接种于100 mL马铃薯葡萄糖液体培养基（PD)中，于25 °C，150 rpm振荡培养30 h。
[0043] (3)取菌液于离心管中，5, 000 rpm离心10 min,弃上清，用0· 7 mol/L的NaCl溶 液清洗两遍，再离心得到菌丝体。
[0044] (4)加入1% (w/v)蜗牛酶和2% (w/v)纤维素酶的混合酶解液，酶解菌丝体，再用 4层灭菌的擦镜纸过滤酶解液，将滤液4000 rpm离心5 min，弃上清，0.7 mol/L的NaCl溶 液冲洗2次，离心得到IfBOl菌株的原生质体。
[0045] (5)再用 10 mL STC 溶液（1. 2 mol/L 山梨醇，10 mmol/L Tris-HCl pH7. 5,50 mmol/L CaCl2，高压灭菌）洗涤1次，在离心管中加入1 mL STC溶液，悬浮原生质体。
[0046] 所述马铃薯葡萄糖液体培养基（PD)的配方为：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，水 1，000 mL〇
[0047] 2、重组P-Z-F质粒转化原生质体 转化步骤如下： (1)在上述原生质体悬浮液中加入10 μ g重组P-Z-F质粒，轻轻混合均匀；4°C冰箱内 放置1 h。
[0048] (2)然后逐滴加入 200 μLPTC溶液（含40%(w/v)PEG4000，10mmol/LTris-HCl pH 7. 5,50 mmol/L CaCl2,0. 45 μπι细菌过滤器过滤灭菌)，室温放置20 min;再逐滴加入 800 μ L PTC溶液，放入摇床中轻摇20 min;在离心管内加入5 mL液体再生培养基，置于 25°C，150 rpm条件下振荡培养过夜。
[0049] (3)将过夜的培养液离心，弃部分上清，并将培养液中原生质体浓度稀释至104个 /mL ;取200 μ L培养液(含原生质体浓度1 X 104个/mL)涂于含有200 μ g/mL潮霉素 B的 原生质体再生培养基平板上，25°C条件下培养30 h。
[0050] (4)记录平板上菌斑数，并计算原生质体转化率。培养基上生长的菌落即为转化 子。
[0051] 所述原生质体再生培养基的配方为：蛋白胨5 g，NaN03 3 g, K2HP04 1 g, MgS04.7H20 0.5 g，KC1 0.5 g，FeS04.7H20 0.01 g，蔗糖 30 g，琼脂 15?20 g，水 1,000 mL;0.7 mol/L NaCl〇
[0052] 3、转化子筛选 (1)在长势良好的重组菌株平板上用打孔器取菌碟若干，加入到含有青霉素的ro培养 基中，25 °C，150 rpm条件下培养2天左右。
[0053] (2)提取菌株DNA，用引物TLR7F和TLR7R，以及引物ch-BF和ch-BR进行PCR扩增， 经基因测序、凝胶电泳，选择含有目的片段和潮霉素 B磷酸转移酶基因片段的菌株，即为初 选菌株。
[0054] 所述引物ch-BF的核苷酸序列如SEQ ID N0. 8所示，和ch-BR的核苷酸序列如SEQ ID N0. 9 所示。
[0055] (3)将初步筛选的重组菌株在含200 μ g/mL潮霉素 B的马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA培养基）上转接3次，再在不含潮霉素 B的PDA上转接3次，再转接到含潮霉素 B的 PDA上，按照初步筛选的方法和条件提取DNA、PCR扩增和测序，琼脂糖凝胶电泳后依旧含有 目的条带且测序结果正确的菌株，即为我们所要的最终重组菌株。
[0056] (4)经过多次阳性筛选和毒力测试，得到一株能够稳定遗传且对能够高效杀灭烟 粉虱的基因重组玫烟色棒孢霉菌If〇l GM;该菌株已于2014年5月13日保藏于中国典型 培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :M 2014199,保藏地址为中国武汉武汉大学。该菌 株携带有B型烟粉虱TOLL受体基因 TLR7的正反向核苷酸片断；该菌株能够沉默烟粉虱免 疫相关基因，即TOLL受体蛋白基因 TLR7。
[0057] 该菌株的形态学特征为： 在察氏培养基上：起初菌落规则圆形，隆起，菌丝白色，背面淡黄色或黄褐色；延长培 养，菌落呈不规则圆形，形成肉红色孢子层； 显微镜下观察：菌丝体细长，无色透明，宽度2. 7(Γ3. 8 μ m，产大量分生孢子，孢子无色 透明，柱状至椭圆形，长4. 9?6.4 μ m，宽1. 9?2.4 μ m。
[0058] 实施例3重组玫烟色棒孢霉菌IfOl GM的毒力测验 在室内条件下，采用浸渍法将离体的带有2龄B型烟粉虱若虫的扶桑叶片(每叶不少于 30头若虫)分别在2. OX 107个分生孢子/mL、l. OX 107个分生孢子/mL、5. OX 106个分生孢 子/mL、2. 5Χ 106个分生孢子/mL、l. 25Χ 106个分生孢子/mL浓度梯度的重组玫烟色棒孢 霉菌IfOl GM分生孢子悬浮液中浸渍叶片10 s，晾干后放入培养皿(底部垫湿滤纸，叶柄基 部缠绕湿棉球）中，然后将培养皿放入光照14 :10 (L :D)，温度25±1°C下培养，实验重复3 次。
[0059] 每隔2天观察记录若虫死亡情况，计算死亡率与半致死浓度（LC5(I)及半致死时间 (LT 50)。
[0060] 结果如表1、表2、表3所示。结果显示，孢子浓度为5. ΟΧΙΟ6个/mL时，重组菌株 第12天对2龄烟粉虱若虫的累计校正死亡率为80. 00%，野生菌株IfBOl第12天对2龄烟 粉虱若虫的累计校正死亡率为54. 67%，重组菌株的杀虫效率比野生菌株高50%左右，并且， 重组菌株的LC5(I值比野生菌株低约50%，LT 5(I值短1~2天，说明重组菌株的杀虫效果更高更 快。
[0061] 表1不同菌株对2龄B型烟粉虱若虫的累积校正病死率（％)
【权利要求】
1. 一种基因重组玫烟色棒抱霉菌IfOl GM (/ saria/amsiomsea IfOl GM)，其特征在 于，该菌株于2014年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :M 2014199,保藏地址为中国武汉武汉大学。
2. 根据权利要求1所述基因重组玫烟色棒孢霉菌IfOl GM，其特征在于，该菌株携带 有B型烟粉虱TOLL受体基因 TLR7的正反向核苷酸片段，所述TLR7的正反向核苷酸片段序 列如SEQ ID NO :1所示；该菌株能够沉默烟粉虱免疫相关基因，即TOLL受体蛋白基因 TLR7。
3. 根据权利要求1所述基因重组玫烟色棒孢霉菌IfOl GM，其特征在于，该菌株的形 态学特征为： 在察氏培养基上：起初菌落规则圆形，隆起，菌丝白色，背面淡黄色或黄褐色；延长培 养，菌落呈不规则圆形，形成肉红色孢子层； 显微镜下观察：菌丝体细长，无色透明，宽度2. 7(Γ3. 8 μ m，产大量分生孢子，孢子无色 透明，柱状至椭圆形，长4. 9?6.4 μ m，宽1. 9?2.4 μ m。
4. 一种权利要求1所述基因重组玫烟色棒孢霉菌IfOl GM的构建方法，其特征在于， 步骤如下：
51. 构建重组质粒
511. 提取B型烟粉虱的总RNA，合成第一链cDNA ;
512. 以S11的cDNA为模板，利用引物TLR7F和TLR7R，进行PCR扩增，得目的片段；
513. 以S12目的片段为模板，分别利用引物TLR7F-1和TLR7R-1，引物TLR7F-2和 TLR7R-2,进行PCR扩增，得到正向片段和反向片段；
514. 将正向片段XhoI、HindII双酶切，经回收、纯化后，连接到XhoI、HindII双酶切过 的pSilent-Ι质粒，得P-Z质粒；
515. 将反向片段Kpnl、SphI双酶切，经回收、纯化后，连接到Kpnl、SphI双酶切过的 P_Z质粒，得重组P-Z-F质粒；
52. 构建重组菌株
521. 获得玫烟色棒孢霉IfBOl菌株的原生质体；
522. 重组P-Z-F质粒转化原生质体，得转化子；
523. 转化子经过阳性筛选和毒力测试，得到基因重组玫烟色棒孢霉菌IfOl GM; 其中，S12所述目的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示； S12所述引物TLR7F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，TLR7R的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示； S13所述引物TLR7F-1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，TLR7R-1的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 5 所示； S13所述引物TLR7F-2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示，TLR7R-2的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 7 所示。
5. 根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，S12或S13所述PCR扩增的扩增程序 为：94 °C 预变性 4 min; 94 °C 变性 1 min，56 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 45 s，30 个循环；72 °C补平 10 min。
6. 权利要求1所述基因重组玫烟色棒孢霉菌IfOl GM应用于防治烟粉虱。
7. 权利要求1所述基因重组玫烟色棒孢霉菌IfOl GM应用于制备防治烟粉虱的药剂。
8.根据权利要求6或7所述应用，其特征在于，所述烟粉虱为B型烟粉虱。
【文档编号】C12R1/645GK104109637SQ201410317110
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年7月4日 优先权日:2014年7月4日
【发明者】胡琼波, 李霖, 金丰良, 翁群芳 申请人:华南农业大学