专利名称：从发酵液中提取达托霉素的方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵液，尤其是涉及一种从发酵液中提取达托霉素的方法。
技术背景
细菌耐药性是当今全球面临的严峻挑战之一。战胜细菌耐药性的途径，一是要防止滥用抗生素而造成耐药菌的快速增加和泛滥；二是要根据细菌产生耐药性的作用机制， 不断研究开发能够抑制细菌的新抗菌药物；三是研究开发不会使细菌产生耐药性的新型药物。只有这样才能有效地控制日益严重的耐药菌感染问题。
达托霉素(Daptomycin)是由玫瑰孢链霉菌经发酵提取得到的一种新型脂肽类抗生素，其化学结构和作用机制不同于所有已有的抗生素，被公认为万古霉素之后最佳抑制革兰氏阳性菌的新型抗生素。达托霉素是由一个十碳烷侧链与一个环状β氨基酸肽链 N-末端的色氨酸连接而成，结构式如下
体外实验表明，达托霉素能够快速杀死大部分革兰氏阳性菌，并且对耐万古霉素的肠球菌(VRE)、耐甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)、对糖肽抗生素中等敏感的金黄色葡萄球菌(GISA)、凝固酶阳性金黄色葡萄球菌(CNQ及耐青霉素的肺炎链球菌(PRSP) 等，均呈现良好活性。达托霉素的抗菌机制与大多数抗菌药物不同，它通过扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，改变细胞质膜的性质；它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内溶物外泄而达到杀菌的目的，因此达托霉素在临床实验中极少产生耐药性分离株。
1997年11月，Lilly制药公司将达托霉素全球独家开发，生产及销售由Cubist制药公司完成。Cubist公司将该药作为重点开发品种，该公司也是目前全球唯一将达托霉素商业化的制药公司。2003年9月年达托霉素成为第一个被美国FDA批准上市的首个脂肽类抗生素。2006年1月，达托霉素再次获得了欧洲药品评价署(EMEA)在整个欧洲的认证。 目前，达托霉素主要用于治疗革兰氏阳性菌引起的皮肤感染。
达托霉素的结构复杂，化学全合成较困难，微生物发酵生产达托霉素是目前唯一的方法。达托霉素特别的化学结构决定其稳定性较差，在发酵提取过程中可衍变成脱水达托霉素和异构达托霉素等多种杂质，故提取过程中不易采用强酸、强碱性离子交换树脂。玫瑰孢链霉菌发酵生产达托霉素的发酵单位低、副产物多、提取步骤繁多、产品收率低， 制约了该产品的工业化生产和广泛推广。目前，关于高纯度达托霉素提纯方法的报道主要有=Cubist公司申请的美国专利6699412，运用阴离子交换层析，疏水作用层析，阴离子交换层析的组合工艺分离纯化发酵液中的达托霉素，得到纯度为98%以上的达托霉素。美国专利228006采用阴离子交换层析，两级反相柱层析得到纯度高于95%的达托霉素。国内方面，华北制药公司采用大孔吸附树脂分离纯化达托霉素，洗脱液中达托霉素的含量为83%， 提取率为90%。中国专利101899094提出了两级膜分离，阳离子交换层析，阴离子交换层析的组合工艺分离达托霉素。此外，中国专利101830970提出了反相硅胶柱层析制备高纯度达托霉素。这些专利提到的提纯技术，有些采用乙腈作为洗脱剂，对环境的污染较大，有些采用阳离子交换树脂，在强酸性条件下洗脱，易造成达托霉素酸解，有些采用较为昂贵的离子交换填料和反相柱层析填料，大大增加了分离纯化的成本。发明内容
本发明的目的在于提供一种工艺简单的从发酵液中提取达托霉素的方法。
本发明包括以下步骤
1)发酵液离心后得到上清液，经有机溶剂萃取后，达托霉素进入有机相，再用醋酸钠-醋酸缓冲液反萃取至水相，得反萃取液；
2)将反萃取液经疏水作用层析纯化，用异丙醇-醋酸钠-醋酸缓冲液恒定浓度洗脱，得疏水作用层析洗脱液；
3)将疏水作用层析洗脱液经离子交换层析分离纯化，介质是离子交换纤维素或琼脂糖凝胶离子交换树脂等离子交换填料，得离子交换洗脱液；
4)离子交换洗脱液以醋酸钠-醋酸缓冲液为基础液，加入中性盐洗脱，完成从发酵液中提取达托霉素。
在步骤1)中，所述上清液可用酸调至ρΗ为4 5 ；所述有机溶剂可选自碳原子数大于等于4的醇，或碳原子数大于等于4的酯，所述碳原子数大于等于4的醇可选自正丁醇或正戊醇等，最好为正丁醇；所述碳原子数大于等于4的酯可选自乙酸乙酯或乙酸丁酯等。
在步骤2~)中，所述疏水作用层析的介质可选自ΗΡ20或ΗΖ818或ΗΖ816或Χ-5或 ΑΒ-8等大孔吸附树脂，最好为ΗΖ816大孔吸附树脂；所述疏水作用层析洗脱液可选自乙腈、 乙醇、异丙醇等中的一种，所述疏水作用层析洗脱液的体积百分比浓度可为10% 60%。
在步骤3)中，所述疏水作用层析洗脱液的ρΗ调至6 8 ；所述离子交换填料可选自阴离子交换树脂，所述阴离子交换树脂可选自DEAE 52离子交换纤维素、DEAE Sepharose FF, QAE Sepharose FF 等中的一种。
在步骤4)中，所述离子交换洗脱液最好以ρΗ为7. 0的醋酸钠-醋酸缓冲液为基础液；所述中性盐可选自一价盐或二价盐，所述一价盐可选自NaCl或KCl等，所述二价盐可选自CaCl2或MgCl2等；所述中性盐的摩尔浓度可为0 1. OM ；所述洗脱可采用线性洗脱方式。
达托霉素含量的测定方法可采用高效液相色谱法，其检测方法为=Agilent HC C18柱；以0.1%三氟乙酸水溶液/0.1%三氟乙酸乙腈溶液(55 45)为流动相，流速ImL/ min，检测波长218nm。
本发明综合运用有机溶剂萃取和树脂层析技术，提供了一种制备高纯度达托霉素的方法。运用该方法可从发酵液中分离纯化出纯度高于85%的达托霉素。相对于其他的分离纯化工艺，本发明操作条件温和，成本低，可有效减少达托霉素酸解。达托霉素作为一种新型的脂肽类抗生素，具有良好的医用市场前景，因此本发明的分离纯化方法具有显著的经济和社会价值。
图1为本发明实施例达托霉素发酵液HPLC图(保留时间7. 137min为达托霉素)。 在图1中，横坐标为时间(min)，纵坐标为峰强度(mAU)。
图2为本发明实施例的离子交换洗脱液HPLC图(保留时间7. 446min为达托霉素)。在图2中，横坐标为时间(min)，纵坐标为峰强度(mAU)。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作详细说明。
实施例1
1)达托霉素发酵液以4800rpm离心15min除去菌丝体得到发酵上清液(参见图 1)。将上清液PH调至5. 0，加入1/4倍体积的正丁醇，萃取3次，上清液中95%的达托霉素进入有机相，3倍体积pH 7. 0醋酸钠-醋酸缓冲液将达托霉素反萃取到水相中。
2)反萃取液pH调至5. 0，上样于填有HP20大孔吸附树脂的层析柱流速1. OmL/ min，上样结束后，用pH 7. 0，10^^30^^50%异丙醇-醋酸钠-醋酸缓冲液梯度洗脱，收集大孔吸附洗脱液。
3)大孔吸附洗脱液上样于预先用醋酸钠-醋酸缓冲液平衡好的DEAE Sepharose FF离子交换层析柱，流速2mL/min，上样结束后，先用50mM pH 7. 0醋酸钠-醋酸缓冲液充分洗涤，以50mM pH 7. 0醋酸钠-醋酸缓冲液为基础液，加入NaCl进行线性洗脱，NaCl浓度为0 0. 1M，收集洗脱峰。经HPLC检测，洗脱液中达托霉素含量在75%以上。
实施例2
1)达托霉素发酵液以4800rpm离心15min除去菌丝体得到发酵上清液。将上清液 PH调至4. 5，加入1/4倍体积的正戊醇，萃取4次，3倍体积pH 7. 5醋酸钠-醋酸缓冲液将达托霉素反萃取到水相中。
2)反萃取液pH调至4. 5，上样于填有HZ816大孔吸附树脂的层析柱，高径比为20， 流速1. OmL/min,上样结束后，用pH 7. 0，10%、20(%、40(%异丙醇-醋酸钠-醋酸缓冲液梯度洗脱，收集大孔吸附洗脱液。
3)大孔吸附洗脱液上样于预先用醋酸钠-醋酸缓冲液平衡好的DEAE52离子交换层析柱，流速2mL/min，上样结束后，先用50mM pH 7. O醋酸钠-醋酸缓冲液充分洗涤，以 50mM pH7. O醋酸钠-醋酸缓冲液为基础液，加入NaCl进行线性洗脱，NaCl浓度为0. 05 0. 15M，收集洗脱峰。经HPLC检测，洗脱液中达托霉素含量在85%以上(参见图2)。
权利要求
1.从发酵液中提取达托霉素的方法，其特征在于包括以下步骤1)发酵液离心后得到上清液，经有机溶剂萃取后，达托霉素进入有机相，再用醋酸钠-醋酸缓冲液反萃取至水相，得反萃取液；2)将反萃取液经疏水作用层析纯化，用异丙醇-醋酸钠-醋酸缓冲液恒定浓度洗脱，得疏水作用层析洗脱液；3)将疏水作用层析洗脱液经离子交换层析分离纯化，介质是离子交换纤维素或琼脂糖凝胶离子交换树脂等离子交换填料，得离子交换洗脱液；4)离子交换洗脱液以醋酸钠-醋酸缓冲液为基础液，加入中性盐洗脱，完成从发酵液中提取达托霉素。
2.如权利要求1所述的从发酵液中提取达托霉素的方法，其特征在于在步骤1)中，所述上清液用酸调至pH为4 5。
3.如权利要求1所述的从发酵液中提取达托霉素的方法，其特征在于在步骤1)中，所述有机溶剂选自碳原子数大于等于4的醇，或碳原子数大于等于4的酯。
4.如权利要求3所述的从发酵液中提取达托霉素的方法，其特征在于所述碳原子数大于等于4的醇选自正丁醇或正戊醇，最好为正丁醇；所述碳原子数大于等于4的酯选自乙酸乙酯或乙酸丁酯。
5.如权利要求1所述的从发酵液中提取达托霉素的方法，其特征在于在步骤幻中，所述疏水作用层析的介质选自HP20或HZ818或HZ816或X-5或AB-8大孔吸附树脂，最好为 HZ816大孔吸附树脂。
6.如权利要求1所述的从发酵液中提取达托霉素的方法，其特征在于在步骤幻中，所述疏水作用层析洗脱液选自乙腈、乙醇、异丙醇中的一种，所述疏水作用层析洗脱液的体积百分比浓度可为10% 60%。
7.如权利要求1所述的从发酵液中提取达托霉素的方法，其特征在于在步骤幻中，所述疏水作用层析洗脱液的PH调至6 8 ；所述离子交换填料选自阴离子交换树脂，所述阴离子交换树脂选自DEAE 52离子交换纤维素、DEAE Sepharose FF,QAE Sepharose FF中的一种。
8.如权利要求1所述的从发酵液中提取达托霉素的方法，其特征在于在步骤4)中，所述离子交换洗脱液以pH为7. O的醋酸钠-醋酸缓冲液为基础液。
9.如权利要求1所述的从发酵液中提取达托霉素的方法，其特征在于在步骤4)中， 所述中性盐选自一价盐或二价盐，所述一价盐选自NaCl或KCl ；所述二价盐选自CaCl2或 MgCl2。
10.如权利要求1所述的从发酵液中提取达托霉素的方法，其特征在于在步骤4)中，所述中性盐的摩尔浓度为O 1. OM ；所述洗脱可采用线性洗脱方式。
全文摘要
从发酵液中提取达托霉素的方法，涉及一种发酵液。发酵液离心后得上清液，经有机溶剂萃取后，达托霉素进入有机相，再用醋酸钠-醋酸缓冲液反萃取至水相得反萃取液；将反萃取液经疏水作用层析纯化，用异丙醇-醋酸钠-醋酸缓冲液恒定浓度洗脱得疏水作用层析洗脱液，再经离子交换层析分离纯化，得离子交换洗脱液，再以醋酸钠-醋酸缓冲液为基础液，加入中性盐洗脱，完成从发酵液中提取达托霉素。综合运用有机溶剂萃取和树脂层析技术，运用该方法可从发酵液中分离纯化出纯度高于85％的达托霉素。相对于其他的分离纯化工艺，操作条件温和，成本低，可有效减少达托霉素酸解。达托霉素作为一种新型的脂肽类抗生素，具有良好的医用市场前景。
文档编号C07K7/08GK102492024SQ201110409339
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月9日 优先权日2011年12月9日
发明者凌雪萍, 卢英华, 吴意珣, 张萍, 敬科举 申请人:厦门大学