专利名称：一种达托霉素发酵过程中癸酸添加的新方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物发酵方法，尤其涉及一种以酶解方式缓慢添加前体癸酸生产达托霉素的方法。
背景技术：
近10年来，革兰氏阳性耐药菌感染的趋势在不断上升。目前临床上治疗细菌感染的难点主要集中于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，耐万古霉素的肠球菌(VRE)，糖肽类敏感的金葡菌(GISA)等，它们也是目前医院中传播率利致死率很高的病原体，虽然万古霉素等糖肽类抗生素治疗这类感染取得了一定疗效，但近几年来，临床上已发现万古霉素的耐药菌，而且这种趋势在逐渐增大。因此抗耐药菌新抗生素的研究又成为热门课题。达托霉素对以上耐药菌均有很好的杀菌效果，且制剂用药方便，毒副作用小，成为“病原菌最后一道防线——万古霉素”的最佳替代品；更具意义的是，达托霉素作为环脂肽类抗生素家族的第一个产品，其化学结构和作用机制不同于已有所有类别的抗生素，是近四十年来继口恶唑烷酮类抗生素后，应用到临床的唯一新结构类别抗生素，而且达托霉素在临床试验中极少致使发生耐药性分离株。美国礼莱公司于80年代末，得到抗MRSA的新型脂肽类抗生素达托霉素。1997年11月，礼莱公司将达托霉素的全球独家开发、生产及销售权转让给Cubist制药公司。Cubist公司将该药作为重点开发品种。2003年9月12日，FDA首次批准Cubicin(达托霉素注射剂)用于治疗复杂皮肤和皮肤结构感染。2006年美国FDA又批准了达托霉素的新适应症，用于治疗由金葡菌引起的心脏感染和菌血症。达托霉素对耐药菌的良好作用使其作为治疗复杂皮肤感染和金黄色葡萄球菌感染的菌血症和心内膜炎的药物而在临床上得到青睐。达托霉素由玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)特别是NRRL11379 (ATCC 31568)及 NRRL 15998 以及 NRRL 11379 及 NRRL 15998 的突变株或基因重组菌发酵生产。玫瑰孢链霉菌可以产生一系列的有共同母核的环脂肽类化合物，命名为A21978C复合物，其中达托霉素是A21978C复合物中的N-癸酰基衍生物，其发酵过程具有“前体导向”的特点，即在发酵液中添加不同的前体物质，A21978C混合物中其相应组分的含量也会显著提高。在发酵液中加入外源性前体癸酸，直接参与达托霉素的合成，可改变菌体次级代谢方向，提高达托霉素在A21978C复合物中的比重。癸酸既是发酵产生达托霉素的必需物质，但过量的癸酸会对玫瑰孢链霉菌产生毒性，而前体癸酸浓度低时则癸酸供应不足会导致发酵液中终产品浓度也会相应较低。由于癸酸在培养温度(30°C)下为固体，因此需要选择合适的溶剂，国内外多采用乙醇或油酸甲酯，但是溶解在乙醇或油酸甲酯中的癸酸在温度低时容易结晶析出，影响流加效果
发明内容
本发明的目的是探索一种达托霉素发酵过程中癸酸添加的新方法，解决癸酸在培养温度(30°C )下为固体且即便溶解于溶剂中亦容易结晶析出从而影响流加效果的问题。为实现上述目的，本发明提供的技术方案为研制一种达托霉素发酵过程中癸酸添加的新方法，其特征是在玫瑰孢链霉菌发酵过程中添加脂肪酶及癸酸乙酯从而生产达托霉素。在发酵培养24-60小时后，于每升发酵液中添加5-30mL癸酸乙酯。在发酵培养24-60小时后，于每升发酵液中添加0. 1-1. 2mg脂肪酶。本发明一种达托霉素发酵过程中癸酸添加的新方法的有益效果是探索出一种新的癸酸添加途径，通过癸酸乙酯酶解方式缓慢添加癸酸，降低癸酸对细胞的毒性从而提高
达托霉素的产量。
具体实施例方式实施例I本发明通过玫瑰孢链霉菌NRRL11379发酵生产达托霉素。工艺步骤I、配制斜面培养基，培养基组成为可溶性淀粉2g/L，KNO3 0. lg/L，NaCl 0. 05g/L, K2HPO4 0. 05g/L,MgSO4 0.05, FeSO4 0. 01g/L，琼脂粉 2g/L 0 ；pH 7.5。分装后 121°C灭菌20min备用。将保藏菌株转接于斜面培养基上，30°C培养120h。2、配制种子培养基,培养基组成为葡萄糖5g/L,糊精15g/L,蛋白胨10g/L,酵母粉10g/L;pH7. O。121°C灭菌20min。每250mL锥形瓶中装入30mL种子培养基。将新鲜的斜面孢子接种于种子培养基内，然后置于转速220r/min，30°C的摇床中培养36h。3、配制发酵培养基，培养基组成为糊精10.62g/L，酵母提取物1.59g/L，酪蛋白水解物 I. 28g/L，L-天冬氨酸 I. 50g/L，硫酸钾 8. 00g/L ；pH6. 5。121°C灭菌 20min。每 250mL锥形瓶中装入50mL发酵培养基。按3-5%的接种量将种子液转入发酵培养基中，然后置于转速220r/min，28-30°C的摇床中，发酵144h。在发酵培养24h后，于每升发酵液中添加5mL癸酸乙酯。在发酵培养24h后，于每升发酵液中添加0. Img脂肪酶。发酵完毕经产物分离纯化，发酵液中达托霉素含量为53. 74mg/L。实施例2本发明通过玫瑰孢链霉菌NRRL11379发酵生产达托霉素。工艺步骤I、配制斜面培养基，培养基组成为可溶性淀粉2g/L，KNO3 0. lg/L, NaCl 0. 05g/L, K2HPO4 0. 05g/L,MgSO4 0.05, FeSO4 0. 01g/L，琼脂粉 2g/L 0 ；pH 7.5。分装后 121°C灭菌20min备用。将保藏菌株转接于斜面培养基上，30°C培养120h。2、配制种子培养基,培养基组成为葡萄糖5g/L,糊精15g/L,蛋白胨10g/L,酵母粉10g/L ;pH7. O。121°C灭菌20min。每250mL锥形瓶中装入30mL种子培养基。将新鲜的斜面孢子接种于种子培养基内，然后置于转速220r/min，30°C的摇床中培养36h。3、配制发酵培养基，培养基组成为糊精10. 62g/L，酵母提取物I. 59g/L，酪蛋白水解物 I. 28g/L，L-天冬氨酸 I. 50g/L，硫酸钾 8. 00g/L ；pH6. 5。121°C灭菌 20min。每 250mL锥形瓶中装入50mL发酵培养基。按3-5%的接种量将种子液转入发酵培养基中，然后置于转速220r/min，28-30°C的摇床中，发酵144h。在发酵培养60h后，于每升发酵液中添加30mL癸酸乙酯。在发酵培养60h后，于每升发酵液中添加I. 2mg脂肪酶。、
发酵完毕经产物分离纯化，发酵液中达托霉素含量为80. 64mg/L。实施例3本发明通过玫瑰孢链霉菌NRRL11379发酵生产达托霉素。工艺步骤I、配制斜面培养基，培养基组成为可溶性淀粉2g/L，KNO3 0. lg/L, NaCl 0. 05g/L, K2HPO4 0. 05g/L,MgSO4 0.05, FeSO4 0. 01g/L，琼脂粉 2g/L 0 ；pH 7.5。分装后 121°C灭菌20min备用。将保藏菌株转接于斜面培养基上，30°C培养120h。2、配制种子培养基,培养基组成为葡萄糖5g/L,糊精15g/L,蛋白胨10g/L,酵母粉10g/L;pH7. O。121°C灭菌20min。每250mL锥形瓶中装入30mL种子培养基。将新鲜的斜面孢子接种于种子培养基内，然后置于转速220r/min，30°C的摇床中培养36h。3、配制发酵培养基，培养基组成为糊精10. 62g/L，酵母提取物I. 59g/L，酪蛋白水解物 I. 28g/L，L-天冬氨酸 I. 50g/L，硫酸钾 8. 00g/L ；pH6. 5。121°C灭菌 20min。每 250mL锥形瓶中装入50mL发酵培养基。按3-5%的接种量将种子液转入发酵培养基中，然后置于转速220r/min，28-30°C的摇床中，发酵144h。在发酵培养48h后，于每升发酵液中添加20mL癸酸乙酯。在发酵培养48h后，于每升发酵液中添加0. 6mg脂肪酶。
发酵完毕经产物分离纯化，发酵液中达托霉素含量为130. 78mg/L。
权利要求
1.一种达托霉素发酵过程中癸酸添加的新方法，其包括如下步骤采用玫瑰孢链霉菌经斜面培养、种子培养、摇瓶发酵培养获得达托霉素，其特征是在发酵过程中添加脂肪酶及癸酸乙酯。
2.如权利要求I所述的新方法，其特征是在发酵培养24-60小时后，于发酵液中添加脂肪酶及癸酸乙酯。
3.如权利要求I所述的新方法，其特征是在发酵培养24-60小时后，于每升发酵液中添加0. 1-1. 2mg脂肪酶及于每升发酵液中添加5-30mL癸酸乙酯。
全文摘要
本发明涉及一种达托霉素发酵过程中癸酸添加的新方法，即在玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)发酵培养过程中，同时添加脂肪酶及癸酸乙酯，以脂肪酶水解癸酸乙酯从而添加前体癸酸生产达托霉素，是一种提高达托霉素产量的方法。本发明的优点在于本发明探索出一种新的癸酸添加途径，通过癸酸乙酯酶解方式缓慢添加癸酸，降低癸酸对细胞的毒性从而提高达托霉素的产量。该方法包括癸酸乙酯和脂肪酶的添加量的优化及癸酸乙酯和脂肪酶的添加时间的优化。用本发明所提供的新方法生产达托霉素可以提高达托霉素的产量。
文档编号C12P21/02GK102703551SQ20121021306
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月27日 优先权日2012年6月27日
发明者吴旻, 王旻, 王泽根, 王航 申请人:中国药科大学