专利名称：一种分离纯化达托霉素的方法
技术领域：
本发明涉及达托霉素的制备方法，具体的说涉及一种采用陶瓷膜过滤、树脂层析以及结晶技术制备高纯度达托霉素的方法。
背景技术：
随着抗生素的发展及抗生素的滥用，病原菌对抗生素的耐药性是当今社会面临的最严峻挑战。除了控制抗生素滥用外，目前寻找一种有效的对抗耐药菌的抗生素成了解决这一问题的最佳途径，万古霉素曾被认为是对抗革兰氏阳性菌的最后一道防线，但现在全世界临床已发现越来越多的耐此药菌。
达托霉素(Daptomycin)是由LillyGL^)公司最初研究,Cubist制药公司开发的一环脂肽类抗生素。应病人对新型耐药抗生素的迫切需求，2003年底，美国食品与药物管理局(FDA)经过快速审理程序批准注射用达托霉素(Daptomycin)(商品名cubicin)用于治疗由一些革兰氏阳性敏感菌株引起的并发性皮肤及皮肤结构感染，如脓肿、手术切口感染和皮肤溃疡。达托霉素的作用机制与其他抗生素不同，它通过扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，改变细胞质膜的性质；另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容物外泄而达到杀菌的目的，因此细菌对达托霉素产生耐药性可能会比较困难。达托霉素虽然已经在美国实现工业化生产，但在中国并未实现规模生产，其主要原因在于没有能够实现工业化的提取技术。现有的达托霉素提取方法，例如中国专利申请200910058577. 7所描述的达托霉素提取方法，仅采用大孔树脂分离纯化达托霉素，所得的达托霉素色谱纯度仅为80% -90%，不但不能满足制药需求，而且因为其成本高昂而无法实现工业化生产。中国专利申请200910085837. X虽然采用离子交换树脂方法获得高纯度的达托霉素，但是因存在达托霉素被严重破坏的问题而无法实现分离纯化达托霉素的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简便、成本低廉同时又能制得高纯度达托霉素的制备方法。其包括如下步骤I)将达托霉素发酵液调节pH2. 0-4. 5后，用膜孔径为O. 01 μ m_0. I μ m的陶瓷膜进行过滤，然后用pH2. 0-4. O的酸性水溶液循环洗涤陶瓷膜,弃滤液，再用pH8-10的碱性水溶液循环洗涤陶瓷膜，收集达托霉素滤液；2)将步骤I)所得达托霉素滤液调节pH4. 5-7. O,经弱碱性阴离子交换树脂吸附、洗脱后得到达托霉素解吸液；3)将步骤2)所得达托霉素解吸液经大孔吸附树脂吸附、解吸脱色后得达托霉素脱色液；4)将步骤3)所得达托霉素脱色液经截留分子量为50-500的纳滤膜系统浓缩，得到达托霉素浓缩液；5)将步骤4)所得达托霉素浓缩液调节pH5. 0-7. 0，然后加入无机钙盐和醇类溶剂进行结晶，晶体过滤干燥后得到固体达托霉素。上述步骤I)中，首先将发酵液pH调至2. 0-4. 5，由于达托霉素等电点为PI3. 5，在pH2. 0-4. 5的条件下，达托霉素形成分子量很大的胶束，不会透过陶瓷膜。洗涤所用的PH2. 0-4. O酸性水溶液可以采用磷酸溶液，其用量通常是发酵液体积的1-2倍；所述碱性水溶液可以是PH8-10的氢氧化钠或氢氧化钾溶液，其用量以发酵液体积的4-5倍为宜。洗涤完后，达托霉素的收率在92%以上。上述步骤2)采用弱碱性阴离子交换树脂分离系统分离纯化达托霉素，优选D301树脂，D301树脂价格便宜，成本低，而且它对达托霉素的选择性较强。D301树脂的装填内径和高度比一般为I : 5 I : 7，优选为I : 6。洗脱液可采用pH5. 5-6. O的NaCl溶液。 上述步骤3)采用大孔树脂分离系统进一步分离纯化达托霉素，优选为HZ20树月旨，这种树脂价格便宜，颗粒较粗，不易造成堵塞。HZ20树脂的装填内径和高度比一般为
I: 5 I : 7，优选为I : 6。用大孔树脂吸附达托霉素后，可先用15%-20%乙醇溶液清洗大孔树脂,再用30% -35%的乙醇溶液将达托霉素洗脱下来。上述步骤4)纳滤膜的截留分子量优选为100-200。上述步骤5)无机钙盐的加入量以浓缩液中所含达托霉素质量的30% 50%为宜，所述无机钙盐例如氯化钙、乙酸钙。所述醇类溶剂常用的有乙醇和异丙醇，其加入量通常是浓缩液体积的3-6倍。上述各步骤，一般的，采用磷酸、乙酸和氢氧化钠来调节溶液的pH。在本发明方法中，达托霉素发酵液经过陶瓷膜系统、弱碱性阴离子交换树脂分离系统和大孔树脂分离系统分离纯化和脱色处理后，收集纯度85%以上组分再经过纳滤膜系统浓缩至浓度20%左右，加醇类溶剂结晶，晶体过滤干燥后得到的达托霉素固体其色谱纯度在98%以上。该方法简单易行，成本低廉，适合进行工业化生产。
具体实施例方式以下通过实施例进一步描述本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。下述实施例所用实验材料均为达托霉素发酵液，其为pH7. O左右的较粘稠料液。实施例I将达托霉素发酵液用磷酸调节至pH3. O后，经过孔径O. 05 μ m的陶瓷膜过滤除去达托霉素发酵液中的水溶性蛋白、色素等大分子物质，然后用原料液1-2倍体积的pH3. O的磷酸水溶液循环洗涤陶瓷膜(滤液弃去)，再用原料液4-5倍体积的pH9. O的氢氧化钠溶液循环洗涤陶瓷膜得到陶瓷膜滤液，所得滤液澄清透明，且颜色为红黄色。将滤液用稀乙酸调节ρΗ5· 5过D301树脂，水洗D301树脂，然后在ρΗ5· 5-6. O用300mM的NaCl溶液洗脱。所得洗脱物用稀乙酸调节pH4. 0-4. 5并加入料液体积10%的乙醇后过HZ20树脂(上海华震公司生产的大孔吸附树脂)，用15% -20%乙醇溶液(注乙醇溶液的百分浓度指体积百分浓度，下同)清洗HZ20树脂，再用30% -35%的乙醇溶液洗脱。洗脱物经过截留分子量为100-200的纳滤膜纳滤浓缩，浓缩后达托霉素浓度在20% (w/w)。将所得浓缩液用稀乙酸或氢氧化钠调节pH6. 0，加入该浓缩液中达托霉素质量含量40 %左右的乙酸钙，加入浓缩液4倍体积的95 %乙醇，冰箱放置15h，过滤干燥，得到的固体达托霉素。采用高效液相色谱法(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION0FDAPT0MYCIN”(EP I 586 580 A2)公开的方法相同)检测达托霉素纯度，其纯度在99%以上。实施例2将达托霉素发酵液用磷酸调节至pH3. 5后，经过孔径O. 05 μ m的陶瓷膜过滤除去达托霉素发酵液中的水溶性蛋白、色素等大分子物质，然后用原料液1-2倍体积的pH3. O的磷酸水溶液循环洗涤陶瓷膜(滤液弃去)，再用原料液4-5倍体积的pHIO的氢氧化钠溶液 循环洗涤陶瓷膜得到陶瓷膜滤液，所得滤液澄清透明，且颜色为红黄色。 将滤液用稀乙酸调节ρΗ5· 5过D301树脂，水洗D301树脂，然后在ρΗ5· 5-6. O用300mM的NaCl溶液洗脱。所得洗脱物用稀乙酸调节pH4. 0-4. 5并加入料液O. I倍体积的乙醇后过HZ20树月旨，用15% -20%乙醇溶液清洗HZ20树脂，再用30% -35%的乙醇溶液洗脱。洗脱物经过截留分子量为100-200的纳滤膜纳滤浓缩，浓缩后达托霉素浓度在20% (w/w)。将所得浓缩液用稀乙酸或氢氧化钠调节pH6. 0，加入该浓缩液中达托霉素质量含量40 %左右的乙酸钙，加入浓缩液4倍体积的95 %乙醇，冰箱放置15h，过滤干燥，得到的固体达托霉素，经高效液相色谱法检测，其纯度在99%以上。实施例3将达托霉素发酵液用磷酸调节至pH3. O后，经过孔径O. 05 μ m的陶瓷膜过滤除去达托霉素发酵液中的水溶性蛋白、色素等大分子物质，然后用原料液O. 5-1倍体积的pH3. O的磷酸水溶液循环洗涤陶瓷膜(滤液弃去)，再用原料液2-3倍体积的pHIO. O的氢氧化钠溶液循环洗涤陶瓷膜得到陶瓷膜滤液，所得滤液澄清透明，且颜色为红黄色。将滤液用稀乙酸调节pH6. 0-7. O过D301树脂，水洗D301树脂，然后在pH6. 0-7. O用300mM的NaCl溶液洗脱。所得洗脱物用稀乙酸调节pH4. 0-4. 5并加入料液0. I倍体积的乙醇后过HZ20树月旨，用15% -20%乙醇溶液清洗HZ20树脂，再用30% -35%的乙醇溶液洗脱。洗脱物经过截留分子量为100-200的纳滤膜纳滤浓缩，浓缩后达托霉素浓度在20% (w/w)左右。将所得浓缩液用稀乙酸或氢氧化钠调节pH6. 5-7. O,加入该浓缩液中达托霉素质量含量40%左右的乙酸钙，加入浓缩液5倍体积的95%乙醇，冰箱放置15h，过滤干燥，得到的固体达托霉素，经高效液相色谱法检测，其纯度在98 %以上。本发明所用膜在使用后均要用膜清洗剂清洗，必要时用0. 5%亚硫酸氢钠溶液浸泡保存，以达到膜的重复利用。本发明综合采用膜、层析技术及结晶手段提供一种生产可行、成本低廉的制备高纯度达托霉素的工艺技术。虽然本文已经对该发明进行了详尽的描述，但可以理解，在不违背本发明精神和实质的基础上，本领域技术人员可以做一些修改或变动，这些修改或变动均在本发明要求保护的范围之内 。
权利要求
1.一种分离纯化达托霉素的方法，包括下述步骤 1)将达托霉素发酵液调节PH2.0-4. 5后，用膜孔径为O. 01 μ m-0. I μ m的陶瓷膜进行过滤，然后用PH2. 0-4. O的酸性水溶液循环洗涤陶瓷膜，弃滤液，再用PH8-10的碱性水溶液循环洗涤陶瓷膜，收集达托霉素滤液； 2)将步骤I)所得达托霉素滤液调节pH4.5-7.0，经弱碱性阴离子交换树脂吸附、洗脱后得到达托霉素解吸液； 3)将步骤2)所得达托霉素解吸液经大孔树脂吸附、解吸脱色后得达托霉素脱色液； 4)将步骤3)所得达托霉素脱色液经截留分子量为50-500的纳滤膜系统浓缩，得到达托霉素浓缩液； 5)将步骤4)所得达托霉素浓缩液调节pH5.0-7. 0，然后加入无机钙盐和醇类溶剂进行结晶，晶体过滤干燥后得到固体达托霉素。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤I)中洗涤所用的pH2.0-4. O酸性水溶液米用磷酸溶液，其用量是发酵液体积的1_2倍。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤I)中所述碱性水溶液为氢氧化钠或氢氧化钾溶液，其用量为发酵液体积的4-5倍。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤2)所述弱碱性阴离子交换树脂为D301树脂，其装填内径和高度比为I : 5 I : 7。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤2)采用pH5.5-6. O的NaCl溶液将达托霉素从弱碱性阴离子交换树脂上洗脱下来。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤3)所述大孔树脂为HZ20树脂，其装填内径和高度比为I : 5 I : 7。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤3)用大孔树脂吸附达托霉素后，先用15% -20%乙醇溶液清洗大孔树脂，再用30% -35%的乙醇溶液将达托霉素洗脱下来。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤4)所用纳滤膜的截留分子量为100-200。
9.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤5)中无机钙盐的加入量是浓缩液中所含达托霉素质量的30% 50% ;醇类溶剂的加入量为浓缩液体积的3-6倍。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤5)中所述无机钙盐是下列钙盐中的一种或多种乙酸钙和氯化钙；所述醇类溶剂为乙醇或异丙醇。
全文摘要
本发明公开了一种分离纯化达托霉素的方法，该方法使达托霉素形成胶束，经陶瓷膜系统过滤后，再采用弱碱性阴离子交换树脂分离系统和大孔树脂分离系统进行分离纯化和脱色处理，最后结晶，获得色谱纯度大于98％的达托霉素固体。本发明方法简单易行，成本低廉，适合进行工业化生产。
文档编号C07K1/36GK102875652SQ20111019474
公开日2013年1月16日 申请日期2011年7月13日 优先权日2011年7月13日
发明者赵燕, 赵德, 肖祖梅 申请人:北大方正集团有限公司, 北大国际医院集团重庆大新药业股份有限公司, 北大国际医院集团有限公司