一种小链霉菌及其在达托霉素制备中的应用的制作方法

专利名称：一种小链霉菌及其在达托霉素制备中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型微生物及其用途和应用，尤其涉及一种小链霉菌及其在制备 达托霉素中的应用。
背景技术：
达托霉素是一类称为环酯肽类新抗生素家族的第一个产品。它是从小链霉菌 (Streptomyces parvus)发酵液当中提取得到。它不仅具有新颖的化学结构，且其作用模式 也与任一已获准抗生素不同。达托霉素能在多个方面破坏细菌细胞膜功能，由此迅速杀死 革兰阳性菌。达托霉素除能作用于大多数临床相关革兰阳性菌外，更重要的是在体外对已 呈甲氧西林(methicillin)、万古霉素和利奈唑胺等耐药性分离菌株仍具强力活性。达托霉素为发酵产物，通过发酵培养得到的发酵滤液，再通过一系列纯化工艺如 色谱层析、脱色、结晶和重结晶等可最终获得达托霉素。一般达托霉素产生菌，生产能力不 稳定，产量较低，发酵副产物较多，杂质较多，导致后提取工作较为复杂，大大地增加了后序 的提纯难度，难以获得高纯度的最终产物，从而无法产业化生产。

发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种发酵单位高、能稳定生产、产量多且副产 物少的达托霉素产生菌。一种小链霉菌SW0702，分类命名为小链霉菌(Sti^ptomyces parvus SW0702)，由 中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO :M2010136，保藏日期为2010年6月4曰。小链霉菌CCTCC NO :M2010136的菌株的菌落特征基内菌丝发育良好，菌丝细长 分枝，直径为0. 8 0. 9 μ m ；气生菌丝生长良好，孢子丝着生在气生菌丝体上，孢子丝直、柔 曲，孢子呈椭圆形或卵圆形，表面光滑，直径为0. 65 0. 95 X 0. 95 2. 6 μ m,成熟孢子链孢 子个数在20个以上。蔗糖硝酸盐琼脂气丝浅黄色至粉红色。根据微生物形态学及国外相关资料的描述，结合小链霉菌CCTCC NO :M2010136的 菌株的各种培养特征和形态特征，该小链霉菌CCTCC NO :M2010136的菌株应属于小链霉菌 属，定名为 Streptomyces parvus SW0702。本发明的另一个目的是提供该菌种在制备达托霉素中的应用。小链霉菌CCTCC NO :M2010136的菌株可应用于发酵制备达托霉素。该制备方法包 括下列步骤a.发酵菌株采用小链霉菌CCTCC NO :M2010136的菌株；b.菌株培养按常规方法制备的斜面茄子瓶，挖取斜面菌苔接入摇瓶种子培养得 摇瓶种子液；将摇瓶种子液接种于摇瓶发酵培养基中或种子罐中培养；将种子罐培养液接 种于发酵罐培养基培养，收集发酵液；优选在发酵培养过程中进行补料。c.发酵产物提取色谱层析、脱色、结晶和重结晶。
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其中所述的步骤b为按常规方法制备的斜面，挖取0. 5 X 1. Ocm2的斜面菌苔接入 摇瓶种子培养基，150 250rpm，培养16 32小时，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液按种子罐 培养基体积0. 1 5%的接种量接种于种子罐，80 120rpm，培养16 32h ；将种子罐培养 液按发酵培养基体积5 15%的量接种于发酵罐培养基，120 200rpm，发酵培养130 240小时，收集发酵液；其中培养温度均为28 32°C。其中步骤b中的补料在发酵的整个过程中是很重要。具体补料工艺根据发酵液实 际情况从PH、菌浓、碳氮源消耗、溶氧及菌丝镜检情况等几方面来考虑，补料可采用连续流 加或间歇补料的方式。其中发酵培养过程中的补料，也即发酵罐补料视不同的具体发酵情况有多种，主 要有以下几种不同的方法，1、待菌丝生长良好后，开始补癸酸与油酸甲酯以体积比1 1的混合物料，根据菌 丝镜检情况和发酵单位情况调整补料量，所补的量为0. lml/L 0. 6ml/L发酵液.h ；或者2、待菌丝生长良好后，开始流加补8%癸酸氨，流速1. 0 3. 0ml/L/h，控制发酵时 溶氧不低于10%。具体地说就是在培养一定时间(此时发酵液较粘稠，菌丝生长旺盛，菌浓 20%以上)开始补料流加癸酸氨，当癸酸氨加入一定量后菌丝开始自溶，菌浓下降，培养液 变稀，溶氧上升，这时可以适当降低转速、通气量。或者3、在发酵过程中pH第一次升到7. 0 8. 5时开始补，所补的为癸酸与油酸甲酯以 体积比1 1的混合物料(为了简便后序的描述，将癸酸与油酸甲酯以体积比1 1的混 合物料简称为前体)，所补的量为0. 03 0. 2ml/L发酵液.h ；在发酵进行到35 45小时 左右一直到结束，所补的量为0. 10 0. 55ml/L发酵液· h ；为了进一步地提高发酵单位，还可以在补料操作中增加菜油的补料，具体为当发 酵至70 78小时，暂时停止前体的补入，一次性补入第一次菜油，补量以体积计为发酵罐 体积的0. 5 1. 7%，空气流量适当减少，约减少10 20%，在第一次菜油补料结束后4 8小时再重新开始补前体，补料量为0. 10 0. 55ml/L发酵液.h ；在第一次补菜油后24 40小时，暂停补前体，改补菜油(第二次)，一次性补入，补料量以体积计为发酵罐体积的 0. 5 1. 5%左右，空气流量继续适当减少，约减少10 20%。第二次菜油补料结束后4 8小时，恢复前体的补入。在发酵罐第二次补菜油后24小时，还可以再次暂停前体的补入，而再补一次菜油 (第三次)，补量以体积计为发酵罐体积的0. 5 1. 2%，之后再恢复前体的补入。在整个发 酵罐补料过程中，菜油的总补量以体积计为发酵罐体积的1. 5 4. 4%。或者4、待菌丝生长良好后开始补前体，根据菌丝镜检情况和发酵单位情况调整补料 量，菌丝生长粗壮，量多，发酵单位逐步产生并开始上升，所补的量为0. lml/L 0. 4ml/L发 酵液.h，当培养基中的还原糖降低至以下，开始补葡萄糖，以保持还原糖的浓度，浓度 维持在左右。在补料过程中，油酸甲脂和癸酸两者按1 1体积混合，通过膜过滤除菌后用于补 料。由于癸酸有很强的腐蚀性，补料用的管道质量一定要好。防止癸酸补料不正常，导致发酵异常。另外，气温低于20°C以下，癸酸很容易凝固，造成补料管道堵塞，因此对管道要进行 保温，保持管道通畅。本发明还公开了培养基按重量体积比计，摇瓶培养过程中的碳源为1.0 9. 5%，优选1. 5 9. 2%，最优选为8. 0 9. 0%;氮源为0. 4 3. 8%，优选1. 0 3. 5%， 最优选为2. 0 2. 8%;无机盐为0. 2 2. 5%，优选0. 4 2. 0%，最优选0. 5 1. 3%;其 余为水；种子罐培养过程中的碳源为1. 0 9. 5 %，优选1. 3 9. 2 %，最优选为7. 0 9.0% ；氮源为0. 8 3. 8 %，优选1. 5 3. 3 %，最优选为2. 0 3. 0 % ；无机盐为0. 2 2.5%，优选0.4 2.0%，最优选0.5 1.3% ；其余为水；其中碳源选自麦芽糊精、淀粉、淀粉水解糖、糖蜜、糊精、甘油、葡萄糖、麦芽糖、麦 芽汁、土豆浸出粉、土豆糊精、燕麦片中的一种或几种；优选麦芽糊精、淀粉水解糖、糖蜜、甘 油、葡萄糖、麦芽汁、土豆糊精、燕麦片中的一种或几种；最优选麦芽糊精、淀粉水解糖、糖 蜜、甘油、葡萄糖、土豆糊精中的一种或几种。其中氮源选自黄豆饼粉、玉米浆、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、胰酶大豆蛋 白、肉胨、尿素、硫酸铵铁、酵母粉、酵母浸出物、生豆粉、硝酸盐、味精中一种或几种；优选黄 豆饼粉、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、胰酶大豆蛋白、尿素、硫酸铵铁、酵母粉、生豆粉、 硝酸盐、味精中一种或几种；最优选生豆粉、胰酶大豆蛋白、酵母粉三者的混合，或者植物性 蛋白胨、胰酶大豆蛋白两者的混合。其中无机盐选自K2HP04、NaCl、Fe (NH4) 2 (SO4) 2. 6H20、NaNO3> KNO3> MgSO4. 7H20、 FeSO4. 7H20、KH2PO4 中的一种或几种；优选 K2HP04、NaCl、Fe (NH4) 2 (SO4) 2. 6H20、NaNO3> KNO3 中 的一种或几种；最优选Fe (NH4) 2 (SO4) 2. 6H20、KNO3中的一种或两种。其中，发酵培养过程中，按重量体积比计，碳源为1. 5 15%，优选2. 5 13%，最 优选5 11% ；氮源为0. 5 7.0%，优选0.7 5%，最优选0.7 3% ；无机盐为0. 1 2. 0%，优选0.3 1.6%，最优选0.5 1.3%;氨基酸0 1.5%，优选0.2 1.2%，最优 选0.3 0.9% ；其余为水；发酵培养过程中的培养基物料选择如下碳源选自麦芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、淀粉水解糖、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、糊精、甘 油、菜油、葡萄糖、麦芽糖、麦芽汁、土豆浸出粉、土豆糊精、燕麦片中的一种或几种；优选麦 芽糊精、可溶性淀粉、淀粉水解糖、甘蔗糖蜜、甘油、菜油、葡萄糖、麦芽汁、土豆糊精、燕麦片 中的一种或几种，最优选麦芽糊精、可溶性淀粉、甘蔗糖蜜、葡萄糖、菜油、土豆糊精中的一 种或几种。氮源选自黄豆饼粉、黄豆粉、玉米浆、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、胰酶大豆 蛋白、肉胨、尿素、硫酸亚铁铵、酵母粉、酵母浸出物、生豆粉、硝酸盐、味精中的一种或几种； 优选黄豆饼粉、黄豆粉、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、胰酶大豆蛋白、尿素、硫酸亚铁 铵、酵母粉、生豆粉、硝酸盐、味精中一种或几种；最优选为同时选择黄豆粉、KNO3、谷氨酸钠 三种物料同时选用蛋白胨、尿素、硫酸亚铁铵、酵母粉四种物料。无机盐选自K2HP04、NaCl、Fe(NH4)2(SO4)2. 6H20、NaN03、KN03、MgSO4. 7H20、 FeSO4. 7H20、CH3COONa, CaCO3 中的一种或几种；优选 Fe (NH4) 2 (SO4) 2· 6H20、NaNO3> KNO3> MgSO4. 7H20、FeSO4. 7Η20、CH3COONa, CaCO3 中的一种或几种；最优选 Fe(NH4)2(SO4)2. 6Η20、NaNO3> KNO3> CH3COONa, CaCO3 中的一种或多种。经发酵完成放罐后，对发酵产物进行提取，通过树脂吸附并解吸，再进行色谱层析 和纯化后可以获得纯度达98%以上的达托霉素。本发明所公开的小链霉菌CCTCC N0.M2010136是目前用于生产的一种高单位的达 托霉素产生菌，发酵性能优良，可用于大规模生产。发酵过程是达托霉素生产的重要环节， 其发酵水平与工艺优劣直接相关，本发明提供的发酵工艺经过摇瓶和10吨发酵罐中进行 试验，其生产能力稳定。经检测，用本发明提供的菌种及发酵培养方法制备的达托霉素单位 可高达3100 μ g/ml或以上，从而为后续的工业化生产提供了良好的基础。同时本发明的发 酵副产物相对较少，并降低了后提取的难度，提取和纯化的工艺相对简单，大大提高了收率 和纯度，在工业化生产上更具优势。菌株保藏情况保藏于武汉中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为 CCTCCNO :M2010136，分类命名为小链霉菌SW0702 (Sti^ptomyces parvusSW0702)，保藏日期 为2010年6月4日。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但不能将方案中所涉及的方法及 技术参数理解为对本发明的限制。实施例1 小链霉菌CCTCC NO :M2010136的培养特征将小链霉菌CCTCC NO :M2010136的菌株接种于高氏一号、葡萄糖天门冬素等用于 观察形态特征的培养基。28°C培养一定的时间5、8、10天，观察并进行描述。表1、小链霉菌CCTCC NO :M2010136的菌株在各种培养基上的菌落特征(见表1) 实施例2 生理生化特征及碳源利用生理生化性质采用小链霉菌分类中的标准方法。小链霉菌CCTCC NO :M2010136的生理生化反应为该菌明胶液化缓慢，鲜黄色素。 牛奶不凝固，迅速胨化。淀粉水解。纤维素不生长。硝酸盐还原弱，不产生类黑色素。利 用Biolog自动微生物鉴定系统考察小链霉菌对95种不同碳源的代谢情况将菌株接种 于BUG+B平板培养基，37°C恒温培养16h，用无菌棉签将平板上的菌体洗下，与接种液(GN/ GP-IF+T)混合，制成菌悬液，用浊度计调整至20%T。用8孔电动加液器将菌悬液分别加在 Biolog GP2微孔的各孔中，每孔150uL。将微孔鉴定板放在37°C培养箱中，分别在培养6h、 24h和48h后将其置于Biolog读数仪上读取结果。经Biolog读数仪分析代谢指纹，小链霉菌CCTCC NO :M2010136可较强利用其中22 种碳源，对其它73种碳源利用能力较弱或不能利用。系统给出48h鉴定结果见表2。表2小链霉菌CCTCC NO :M2010136对Biolog GP2板上95种碳源的利用能力 说明+，能利用碳源；-，不能利用碳源；B 利用碳源能力较弱实施例3 达托霉素的生产发酵培养1.种子菌种培养及保存固体培养基葡萄糖0. 5g，酵母膏0. 3g，麦芽汁0. 3g，CaC030. 3g，琼脂1. 8g，加水100ml,pH7.0培养菌株接种于固体培养基斜面上，30°C培养7 10天。固体培养结束后，斜面放置4 10°C冷藏备用。2.摇瓶种子培养培养基甘油20g，可溶性淀粉80g，酵母粉6g，生豆粉20g，胰酶大豆蛋白20g， Fe (NH4) 2 (SO4) 2· 6H20 IOg,加水 2000ml，pH 7· 0接种量挖取斜面菌苔块接入2L摇瓶种子培养基中培养30°C，24h摇床转速250rpm在菌丝长起，有明显挂壁现象且菌浓为11%左右，将2L摇瓶种子培养液，接入以 下种子罐中。3.种子罐种子培养培养基甘油4kg，酵母粉1. 2kg，黄豆饼粉1. 6kg，NaNO3 0. 4kg，消泡剂0. 2kg， pH7. 0装量1000L种子罐内装培养基400L, 121°C灭菌30min。接种量2L摇瓶种子液培养30°C，28h4.发酵培养培养基可溶性淀粉100kg，葡萄糖50kg，硝酸钾30kg，黄豆粉100kg，谷氨酸钠 20kg，五水硫酸亚铁 0. 25kg，菜油 100kg, CaCO3 10kg, pH 7. 0装量10吨发酵罐内装培养基5吨接种量400L的种子液培养UOrpm，30°C，140h5.发酵补料在发酵培养过程中pH第一次升到7. 0左右时开始补前体，补料量为0. 03ml/L发酵液.h，即每小时补150ml前体；在发酵进行到35小时左右一直到结束，补料 的量为0. 55ml/L发酵液.h，即每小时补2750ml前体。按照上述发酵条件和工艺，在10吨发酵罐进行3批发酵试验，发酵单位分别为 3780 μ g/ml、3250 μ g/ml 禾口 3420 μ g/ml。实施例4 达托霉素的生产发酵培养1.摇瓶种子培养培养基葡萄糖100g，糖蜜40g，甘油20g，植物性蛋白胨14g，玉米浆36g，KNO3 26g，加水 2000ml, ρΗ7· 0培养:30°C,24h, 250rpm在菌丝长起，有明显挂壁现象且菌浓约13%左右，将2L摇瓶种子培养液，接入以 下种子罐中。2.种子罐种子培养种子罐培养甘油26kg，葡萄糖50kg酵母粉14. 2kg，生豆粉5. 2kg、胰酶大豆蛋白 4kg, Fe (NH4) 2 (SO4) 2· 6H20 0. 6kg，消泡剂 0. 16kg，ρΗ7· 0装量2000L种子罐内装培养基800L, 121°C灭菌30min。
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接种量2L摇瓶种子液培养30°C，32h3.发酵罐培养发酵培养基葡萄糖44kg，甘蔗糖蜜31kg，黄豆粉182kg，蛋白胨165kg，乙酸钠 48kg，硫酸亚铁铵3kg，加水5吨，ρΗ7· 2装量10吨发酵罐内装培养基6吨接种量800L的种子液培养120rpm，30°C，190h4.发酵补料在发酵培养过程中pH第一次升到7. 5左右时开始补前体；前体的量为0. 08ml/L 发酵液.h ；在发酵进行到38小时左右一直到结束，前体的量为0. 45ml/L发酵液.h。但在 发酵至70小时左右，暂停前体的补入而一次性补入菜油，菜油的补量以体积计为发酵罐体 积的0. 5%左右即30kg，空气流量适当减少10 20%;菜油补料结束后4小时继续补前体， 补料量为0. 10ml/L发酵液.h ；在补菜油后24小时，再次暂停补前体而改补菜油，一次性补 入，补料量以体积计为发酵罐体积的1. 5%左右即90kg，空气流量继续适当减少10 15%; 然后接着按前面所述的补前体，0. 45ml/L发酵液.h 一直到发酵结束。放罐所得发酵液效价为3100 μ g/ml。按照上述发酵条件和工艺，若在第二次补菜油后24小时，第三次补菜油，补量以 体积计为发酵罐体积的1. 0%左右即60kg，然后接着按前面所述的补前体，即以0. 25ml/L 发酵液.h—直到发酵结束。放罐时，发酵单位为3200 μ g/ml。实施例5 达托霉素的中试发酵培养1.摇瓶种子培养培养基麦芽糊精20g，植物性蛋白胨40g，K2HPO4IOg, pH自然，加水2000ml培养 300C，培养:30°C, 25h, 250rpm在菌丝长起，有明显挂壁现象且菌浓约为9%左右，将2L摇瓶种子培养液，接入以 下种子罐中。2.种子罐种子培养培养基葡萄糖1.7kg，土豆糊精4. 5kg，甘蔗糖蜜730g，黄豆饼粉2. 6kg， Fe (NH4) 2 (SO4) 2· 6H20 1. 2kg，消泡剂 100g，ρΗ7· 0装量300L种子罐内装培养基100L，121°C灭菌30min。接种量2L摇瓶种子液培养30°C，27h3.发酵罐培养发酵培养基葡萄糖45kg，麦芽糊精65kg，酵母粉3. 5kg，Fe (NH4) 2 (SO4) 2x6H20 1.5kg，消泡剂 2kg，pH 7.0装量2吨发酵罐内装培养基1吨接种量100L的种子液培养120rpm，30°C，160h
4、发酵补料在发酵过程中pH第一次升到8. 5左右时开始补前体，补料的量为0. 2ml/L发酵 液.h ；在发酵进行到45小时左右一直到结束，补料的量为0. 10ml/L发酵液.h。同时监测还原糖的浓度，小于0. 9%时开始补入50%的葡萄糖2L，继续监测还原 糖的浓度，使之维持在左右。放罐所得发酵液效价为3200μ g/ml。实施例6 达托霉素的生产发酵培养1、摇瓶种子培养摇瓶种子培养基糊精180g，胰酶大豆蛋白8g，NaNO3 1. 0g，加2000ml水，240rpm， 30°C, 24 28h。2、种子罐培养种子罐培养基葡萄糖9kg，土豆糊精36kg，甘蔗糖蜜9kg/L，黄豆饼粉9kg， Fe (NH4) (SO) 2. 6H203kg,消泡剂 300g，pH 值 7. 2培养过程pH值流加氨水来控制，pH值控制在6. 5 7. 0之间。装量1000L种子罐内装培养基600L，121°C灭菌30min。接种量2L摇瓶种子液培养30°C，30h3、发酵罐培养发酵罐培养基葡萄糖20kg，土豆糊精42kg，糖蜜28kg/L，酵母粉38kg， Fe (NH4)2SO4. 6H20 4kg，，消毒前加入少量高温淀粉酶，一般3u/g，可以液化即可。装量10吨发酵罐内装培养基6吨接种量600L的种子液培养120rpm，156 164h培养温度30士 1°C，罐压0. 03 0. 05MPa，空气流量1 lvvm，搅拌转速80 140rpm,发酵过程用浓氨水调节pH不低于6. 5，发酵过程中溶氧不低于20 %，4、发酵补料在培养28hr左右(此时发酵液较粘稠，菌丝生长旺盛，菌容20%以上)开始补料 流加癸酸氨(8%以癸酸重量计算)流速1.5 2.0ml/L/h至发酵结束。当癸酸加入一定量 后菌丝开始自溶，溶氧上升，可以适当降低转速、通气。放罐时，发酵单位为3100 μ g/ml。以上所述的实施中所获得的发酵液单位高，杂质少，发酵液经过滤取滤液，通过树 脂吸附并解吸，再进行色谱层析和纯化，即可获得纯度在98%以上的达托霉素。
权利要求
一种菌株，分类命名为小链霉菌SW0702(Streptomyces parvus SW0702)，由武汉中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NOM2010136，保藏日期为2010年6月4日。
2.如权利要求1所述小链霉菌的CCTCCNO :M2010136的菌株在发酵制备达托霉素中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于该制备方法包括下列步骤a.发酵菌株采用小链霉菌CCTCCNO :M2010136的菌株；b.菌株培养按常规方法制备的斜面，挖取斜面菌苔接入摇瓶种子罐培养得摇瓶种子 液；将摇瓶种子液接种于种子罐中培养；将种子罐培养液接种于发酵罐培养基培养，收集 发酵液；其特征在于在发酵培养过程中进行补料，c.发酵产物提取树脂吸附并解吸，色谱层析和纯化，结晶； 优选在所述的步骤b发酵培养过程中进行补料。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于其所述的步骤b为按常规方法制备的斜面， 挖取0. 5 X 1. Ocm2的斜面菌苔接入摇瓶种子培养基，150 250rpm，培养16 32小时，得 摇瓶种子液；将摇瓶种子液按种子罐培养基体积0. 1 5%的接种量接种于种子罐，80 120rpm，培养16 32h ；将种子罐培养液按发酵培养基体积5 15%的量接种于发酵罐培 养基，120 200rpm，发酵培养130 240小时，收集发酵液；其中培养温度均为28 32°C。
5.如权利要求3所述的应用，其特征是所述的步骤b中的发酵培养过程中的补料为1)、待菌丝生长良好后开始补癸酸与油酸甲酯以体积比1 1的混合物料，所补的量为 0. lml/L 0. 6ml/L 发酵液.h ；或2)、待菌丝生长良好后开始流加补8%癸酸氨，流速1.0 3. 0ml/L/h ； 或3)、在发酵过程中pH第一次升到7.0 8.5时开始补癸酸与油酸甲酯以体积比1 1 的混合物料，所补的量为0. 03 0. 2ml/L发酵液.h ；在发酵进行到35 45小时左右一直 到结束，所补的量为0. 10 0. 55ml/L发酵液.h ；其中在发酵至70 78小时，暂停癸酸与油酸甲酯以体积比1 1的混合物料补料，一 次性补入菜油，所补菜油以体积计为发酵罐体积的0. 5 1. 7%，空气流量减少10 20%; 菜油补料结束后4 8小时继续依前方法补癸酸与油酸甲酯以体积比11的混合物料; 在补菜油后24 40小时，暂停补癸酸与油酸甲酯以体积比1 1的混合物料，再次一次性 补入菜油，所补菜油量以体积计为发酵罐体积的0. 5 1. 5%左右，空气流量继续减少10 20%，菜油补料结束后4 8小时继续依前方法补癸酸与油酸甲酯以体积比1 1的混合 物料； 或4)、待菌丝生长良好后开始补癸酸与油酸甲酯以体积比1 1的混合物料，所补的量为 0. lml/L 0. 4ml/L发酵液.h，当培养基中的还原糖降低至以下，开始补葡萄糖，以保持 还原糖的浓度在1%。
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7.如权利要求6所述的应用，其特征是所述的3)中的发酵培养过程补料在第二次补菜 油后24小时，暂停癸酸与油酸甲酯以体积比1 1的混合物料的补入，再补一次菜油，一次性补入，补量以体积计为发酵罐体积的0. 5 1. 2%，菜油补料结束后4 8小时继续依前 方法补癸酸与油酸甲酯以体积比11的混合物料。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征是所述的菜油的总补量以体积计为发酵罐体 积的1. 5 4. 4%。
9.如权利要求3所述的应用，其特征是所述的步骤b中的培养基为按重量体积比计， 摇瓶罐培养过程中的碳源为1. 0 9. 5 %，氮源为0. 4 3. 8 %，无机盐为0. 2 2. 5 %，种子 罐培养过程中的碳源为1. 0 9. 5%，氮源为0. 8 3. 8%，无机盐为0. 2 2. 5%，其余为 水；其中碳源选自麦芽糊精、淀粉、淀粉水解糖、糖蜜、糊精、甘油、葡萄糖、麦芽糖、麦芽汁、 土豆浸出粉、土豆糊精、燕麦片中的一种或几种；所述的氮源选自黄豆饼粉、玉米浆、玉米蛋 白、蛋白胨、植物性蛋白胨、胰酶大豆蛋白、肉胨、尿素、硫酸亚铁铵、酵母粉、酵母浸出物、生 豆粉、硝酸盐、味精中的几种；无机盐选自K2HP04、NaCl, Fe (NH4)2(SO4)2. 6H20、NaNO3 > KNO3 > MgSO4. 7H20、FeSO4. 7H20、KH2PO4 中的一种或几种；发酵培养过程中，碳源为1.5 15%，氮源为0.5 7.0%，无机盐为0. 1 2.0%氨 基酸0 1. 5%，其余为水；其中碳源选自麦芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、淀粉水解糖、甘蔗糖 蜜、甜菜糖蜜、糊精、甘油、菜油、葡萄糖、麦芽糖、麦芽汁、土豆浸出粉、土豆糊精、燕麦片中 的一种或几种；所述的氮源选自黄豆饼粉、玉米浆、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、胰酶 大豆蛋白、肉胨、尿素、硫酸亚铁铵、酵母粉、酵母浸出物、生豆粉、硝酸盐、味精中的几种；无 机盐选自 K2HP04、NaCl、Fe(NH4)2(S04)2· 6H20、NaN03、KNO3、MgSO4. 7H20、FeS04. 7H20、CH3COONa、 CaCO3中的一种或几种。
10.如权利要求9所述的应用，其特征是所述的其特征是所述的步骤b中的培养基为 按重量体积比计，摇瓶培养过程中的碳源为8. 0 9. 0%，氮源为2. 0 2. 8%，无机盐为0. 5 1. 3%， 种子罐培养过程中的碳源为7. 0 9. 0%，氮源为2. 0 3. 0%，无机盐为0. 5 1. 3%，其 余为水；其中碳源选自淀粉水解糖、糖蜜、麦芽糊精、甘油、葡萄糖、土豆糊精中的一种或几 种；所述的氮源为生豆粉、胰酶大豆蛋白、酵母粉三种或植物性蛋白胨、胰酶大豆蛋白二种； 无机盐选自Fe (NH4) 2 (SO4) 2. 6H20、KNO3中的一种或几种；发酵培养过程中，碳源为5 11%，氮源为0. 7 3%，无机盐为0. 5 1. 3%，氨基酸 0.3 0.9%，其余为水；其中碳源选自甘蔗糖蜜、可溶性淀粉、麦芽糊精、葡萄糖、菜油、土 豆糊精中的一种或几种；所述的氮源为黄豆粉、KN03、谷氨酸钠三种或蛋白胨、尿素、硫酸亚 铁铵、酵母粉四种；无机盐选自 Fe (NH4) 2 (SO4) 2. 6H20、NaNO3> KNO3> CH3COONa, CaCO3 中的一种 或几种。
全文摘要
本发明公开了一种小链霉菌及其在达托霉素制备中的应用，该菌株由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NOM2010136，保藏日期为2010年6月4日。本发明制备达托霉素的方法为a.采用小链霉菌CCTCC NOM2010136为发酵菌株；b.菌株培养斜面菌苔接入摇瓶种子罐培养得摇瓶种子液；将摇瓶种子液接种于种子罐中培养；将种子罐培养液接种于发酵罐培养基培养，收集发酵液；发酵培养过程中进行补料，c.发酵产物提取。本发明提供的发酵工艺经过中试和10吨发酵罐中进行试验，其生产能力稳，发酵单位高且发酵副产物相对较少，大大地降低了后提取的难度，适宜于工业化大生产。
文档编号C12R1/465GK101899410SQ201010225330
公开日2010年12月1日 申请日期2010年7月13日 优先权日2010年7月13日
发明者朱健, 李艳, 王蓓, 许永锋, 陈晓霞, 高兴蓉 申请人:杭州华东医药集团生物工程研究所有限公司