专利名称：用于胚胎体外生产的培养液以及牛胚胎体外生产的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于胚胎体外生产的培养液以及牛早期 胚胎体外生产的方法。
背景技术：
动物胚胎移植是指将从一头受孕母畜(供体)的生殖管道中取出的受精卵或发育 到一定时期的早期胚胎，移植到与供体母畜同步发情的母畜(受体)生殖管道的一定部位， 使其继续生长、发育，长成子畜的技术。利用胚胎移植可以缩短动物繁殖周期，进一步挖掘 动物的繁殖潜力，为优良牲畜的大量繁殖，稀有动物的种族延续提供有效的解决办法，在畜 牧业和制药业等领域发挥重要的作用。由于从供体母畜收集受精卵易受动物生殖周期的影响，现在胚胎移植大都采用动 物早期胚胎进行移植，这就使动物早期胚胎的体外培养在胚胎移植中占有重要地位。动物 早期胚胎体外培养是指将采集到的卵母细胞在体外经人工培养成熟后，通过体外受精、核 移植和孤雌激活等技术使卵母细胞受精或被激活，然后移至体外培养基中使其生长发育至 囊胚期的胚胎工程技术，该技术可以不受动物生殖周期的影响，大规模地进行动物早期胚 胎的体外生产。胚胎的体外培养已有40多年的发展历史。目前，胚胎在体外培养条件下能够存活 并发育，移植后能够妊娠产仔，在胚胎工程和生产实践中有了广泛的应用。目前体外胚胎的 生产效率仍然很低，胚胎的质量与体内胚胎相比还存在很大的差距。牛胚胎体外主要存在 的问题为受胎率偏低、妊娠期延长、流产率增加、牛犊的生命力强弱不一、性比例偏斜、围 产期和新生期犊牛的死亡率和畸形率增加等。其主要原因是体外培养体系还不能完全模拟 母畜体内环境，还不够稳定。在体内，胚胎通过输卵管迁移至子宫，胚胎暴露于动态环境。而 已经发展起来的绝大多数胚胎培养系统都是在一段时间相对平衡稳定的环境，胚胎仍然处 于一个相对静止的环境，还无法完全模拟出与雌性生殖道相同的物理或环境条件，无法适 应早期胚胎分化发育的需求。因此，胚胎的体外培养体系还有待于进一步的优化、改进。目前常用的培养方法是体细胞共培养和序贯培养两种。共培养是辅助细胞或体细 胞与胚胎在体外一起培养，更佳地模拟了胚胎在体内的发育环境，各种体细胞的混合培养 以及一些生长因子的添加都极大地推动了体外受精技术的进一步完善。该培养系统可以促 进胚胎的发育，高胚胎质量，使囊胚的形成率得到提高。然而共培养系统中有很多不确定因 子，并且体细胞可能充当病原的传播载体，产生对胚胎的污染。序贯培养是根据体外培养的胚胎在不同生长时间里对不同物质需求和代谢的不 同，配制一系列不同成分的培养液，进行序列更换，从而延长胚胎在体外的培养时间，增加 体外筛选机会的方法，但该方法需要更换多种培养基，所用培养基需要筛选，操作麻烦，而 且容易污染。各培养系统的培养液成分是整个培养过程中最为关键的部分，它决定了动物早期 胚胎生长发育率。目前TCM-199、CZB、KSOM等单纯的基础培养液不能完全模拟胚胎体内发育的环境，并且不能完全提供早期胚胎发育所必须的营养和非营养物质，由此极大降低了 胚胎发育成囊胚的效率。就牛早期胚胎体外生产而言，这些问题尤为突出，极大地制约着畜 牧业的发展。
发明内容
有鉴于此，本发明的一个目的是提供一种用于胚胎体外生产的培养液，所述培养液 可显著促进体外胚胎向囊胚的发育，提高囊胚发育率从而进一步提高牛体外胚胎生产效率。为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案本发明所述用于胚胎体外生产的培养液为包含5-lOmmol/L HepesU5-26. 2mmol/ L NaHCO3>30 50 μ g/L 的 BDNF 以及 3-5% OCS 的 TCM-199 基础培养液。BDNF，脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor)，主要存在于 大脑和外周组织，对神经细胞的分化和神经元存活具有重要作用。最近研究表明，这些因子 也表达在一些非神经系统中，如心血管、免疫、内分泌、生殖系统，并且参与调节这些系统的 功能。在本发明的具体实施方式
中，发现BDNF在不同发育阶段的卵母细胞和胚胎以及 不同方法生产的早期胚胎中均有表达，BDNF对早期胚胎发育有促进作用。用含BDNF的培养 液培养早期胚胎，当BDNF浓度介于30 50 μ g/L时，显著提高牛体外胚胎向囊胚的发育。 本领域技术人员可根据常识将其应用于其它哺乳动物如马、羊等的胚胎体外生产。同样的， 所述培养液也可以提高显著促进发育，提高早期胚胎的囊胚发育率。作为优选，所述用于胚胎体外生产的培养液中BDNF浓度为40μ g/L。本发明的另一个目的是提供一种牛胚胎体外生产的方法，包括在含5-lOmmol/L H印es、15-26. 2mmol/L NaHCO3>30 50 μ g/L 的 BDNF 以及 3-5% OCS 的 TCM-199 培养液培 养早期胚胎，定期更换培养液，获得囊胚期胚胎的步骤。作为优选，所述培养液为含有5mmol/L H印es、26. 2mmol/LNaHCO3、40 μ g/L 的 BDNF 以及3% OCS的TCM-199培养液。所述早期胚胎为通过体外受精、孤雌激活或核移植生产的早期胚胎。体外受精，英文简称为IVF，是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中 完成受精过程的技术。孤雌激活是指是M II期卵母细胞不经过精子刺激，而通过化学或物理等人工刺激 模拟受精过程，恢复并完成第二次减数分裂，发生卵裂并形成早期胚胎。核移植是指将供体细胞核移入去核的卵母细胞中，使后者不经精子穿透等有性过 程即可被激活、分裂并发育成早期胚胎。作为优选，所述方法中每隔48h更换为新鲜的本发明所述培养液。本发明将BNDF应用到胚胎体外培养领域，获得了更为理想、发育率更高的胚胎体 外培养液。利用本发明所述培养液体外培养牛胚胎，可显著提高早期胚胎的囊胚发育率，完 善了现有的培养系统，大大提高了体外胚胎生产的质量和效率。
具体实施例方式本发明公开了一种胚胎体外生产的培养液以及利用该培养液进行牛胚胎体外生产的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的 是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本 发明。本发明所述培养液及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱 离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实 现和应用本发明技术。依照本发明，所述用于胚胎体外生产的培养液为含有5mmol/Iifepes、26. 2mmol/L NaHCO3>40 μ g/L 的 BDNF 以及 3% OCS 的 TCM-199 培养液。在BDNF对早期胚胎发育影响的实验中，以体外受精和孤雌激活方式生产的两种 早期胚胎，在本发明所述牛早期胚胎体外生产的培养液中培养，在BDNF浓度为30 50 μ g/ L时，与未加有BDNF的培养液以及加其它浓度的BDNF的培养液相比，囊胚率显著提高。优选地，所述培养液中BDNF浓度为40 μ g/L时，可使以体外受精方式生产的早期 胚胎的囊胚率提高至51. 22%，以孤雌激活方式生产的早期胚胎的囊胚率提高至58. 41%。本发明另一方面还提供了一种牛早期胚胎体外生产的方法，包括在含5-lOmmol/L H印es、15-26. 2mmol/L NaHCO3>30 50 μ g/L 的 BDNF 以及 3-5% OCS 的 TCM-199 培养液培 养早期胚胎，每隔48h更换培养液，获得囊胚期胚胎的步骤。所述早期胚胎的生产方式包括体外受精、孤雌激活或核移植。卵母细胞正常受精时，精子与卵子质膜直接融合或通过表面上的受体蛋白引起卵 内Ca2+浓度的瞬时升高，由此引起包括皮质颗粒(CG)释放、细胞质内pH的改变、母源mRNA 的补充等一系列激活反应，最终导致原核的形成、DNA合成的起始和卵裂。核移植、卵母细胞体外受精和孤雌激活是胚胎工程研究领域获得胚胎的重要途 径。卵母细胞孤雌激活是一种人工激活卵的方式，通过电脉冲、Ionomycin、乙醇、钙离子载 体、放线菌酮和1，4，5_三磷酸肌醇(IP3)等都可以引起卵母细胞的激活，使MII期卵母细 胞不经过受精过程完成早期胚胎发育，获得孤雌胚胎。孤雌激活与体外受精都是以MII期卵母细胞为起点，都能获得早期胚胎，但孤雌 激活与体外受精存在本质的区别；前者是人工活化卵母细胞，后者是活化卵母细胞；孤雌 激活胚是通过抑制第二极体排放，使其与原来的卵母细胞核融合构成二倍体的胚胎，而体 外受精胚胎是由雌雄配子融合所获得的胚胎，孤雌激活和体外受精是两项相对独立的技术 但又有密切的联系。核移植是指将供体细胞核移入去核的卵母细胞中，使后者不经精子穿透等有性过 程即可被激活、分裂并发育成早期胚胎。下面结合实施例，进一步阐述本发明。实施例1 早期胚胎BDNF mRNA表达水平的检测用荧光定量PCR技术检测BDNF在不同发育阶段卵母细胞和胚胎以及不同方法生 产早期胚胎(体外受精胚胎、孤雌激活、核移植胚胎)中的表达水平，结果见表1和表2。表1不同发育阶段牛卵母细胞和体外受精胚胎BDNF mRNA表达水平 注不同大写字母表示差异极显著(P < 0. 01)表2 牛不同类型胚胎中BDNF mRNA表达水平 注不同大写字母表示差异极显著(P < 0. 01)以上结果表明，BDNF在不同发育阶段的卵母细胞和胚胎以及不同方法生产的早期 胚胎中均有表达，BDNF对早期胚胎发育有促进作用。实施例2 用免疫荧光技术检测BDNF蛋白在胚胎中的表达用免疫荧光技术检测BDNF蛋白在胚胎中的表达，显示BDNF蛋白信号主要集中在 囊胚的外胚层。实施例3 卵母细胞的收集及体外成熟将屠宰场收集的牛卵巢，置于含有K+、Ca2+和Mg2+的35 37°C生理盐水保温瓶 内，4h内送到实验室，用37°C的生理盐水洗净。然后用带有12号针头的IOmL注射器抽取 直径为2 6mm卵泡中的卵母细胞。在实体显微镜下挑选出细胞质均勻、并有完整或部 分致密卵丘细胞的卵母细胞，用洗卵液清洗两遍后，放入含1.5mL成熟培养液的玻璃平皿 (30X IOmm)中，在38. 5°C、5% CO2和饱和湿度的培养箱中培养22 24h，获得成熟的卵母 细胞。实施例4 体外受精生产早期胚胎将冻精在37 0C水浴中解冻后，取0. 25mL精液小心置于含有1. 5mL改良的 Tyrode' s受精液的圆底试管底部，15min悬浮后，活精子上游，然后将上层液吸出，离心洗 涤及浓缩一次去上清，留约30 μ L备用。在培养皿中做30μ1的受精微滴，覆盖以石蜡油， 放入38. 5°C,5% CO2和最大饱和湿度的培养箱中至少平衡lh。用细管机械去除包绕在实 施例1制备的成熟卵母细胞周围的卵丘细胞，用新鲜洗卵液洗涤卵母细胞2 3次。将洗 涤后的卵母细胞放入微滴中，每滴加15 25个卵母细胞，再加2 5 μ L的精子悬液，使得 精子浓度为1. OX IO6 1.5 X IO6个/mL。将含精卵的培养皿放回38. 5°C，5 % CO2培养箱 中培养24h，获得早期胚胎。实施例5 孤雌激活生产早期胚胎取实施例3制备的体外成熟培养20 22h后的卵母细胞，用吸管反复吹打去掉卵 母细胞周围的卵丘细胞。将卵母细胞在含5 μ mol/L离子霉素的培养液内处理5min，之后用 培养液洗3次，再移入含2mmol/L 6- 二甲氨基嘌呤培养液内培养3h，得到早期胚胎。实施例6 本发明所述培养液对体外受精生产的早期胚胎发育影响以 TCM-199+5mmol/L Hepes+26. 2mmol/L NaHC0s+3% OCS 为胚胎基础液，向其中添加不同浓度的BDNF，在38. 5°C,5% CO2条件下对实施例4体外受精生产的早期胚胎进行培 养，培养液每隔48h更换一次，培养48h后检查分裂率，7d后记录发育的囊胚率，结果见表 3。(卵裂数百分比=卵裂数/卵母细胞数％ ；囊胚数数百分比=囊胚数/卵裂数％ ；孵化 数百分比=孵化数/卵裂数％)表3不同浓度BDNF对牛体外受精胚胎的影响 注上标表示与不加BDNF组相比，差异显著a =P < 0. 05，b =P < 0. 01由表 3 得知，含 5-10mmol/L H印es、15-26. 2mmol/L NaHCO3>30 50 μ g/L 的 BDNF 以及3-5% OCS的TCM-199培养液能显著提高体外受精胚胎的囊胚率，优选地培养液中 BDNF 浓度为 40 μ g/L。实施例7 本发明所述培养液对孤雌激活生产的早期胚胎发育影响参照实施例6中方法，对实施例5孤雌激活生产的早期胚胎进行培养，结果见表4。表4不同浓度BDNF对牛孤雌激活胚胎的影响
7. 注上标表示与不加BDNF组相比，差异显著a =P < 0. 05由表 4 得知，含 5-10mmol/L H印es、15-26. 2mmol/L NaHCO3、30 50 μ g/L 的 BDNF 以及3-5% OCS的TCM-199培养液能显著提高孤雌激活胚胎的囊胚率，优选地培养液中 BDNF 浓度为 40 μ g/L。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
权利要求
一种用于胚胎体外生产的培养液，其特征在于，所述培养液为含5-10mmol/L Hepes、15-26.2mmol/L NaHCO3、30～50μg/L的BDNF以及3-5％OCS的TCM-199培养液。
2.根据权利要求1所述培养液，其特征在于，所述培养液为含有5mm0l/LHepes、 26. 2mmol/L NaHCO3>40 μ g/L 的 BDNF 以及 3% OCS 的 TCM-199 培养液。
3.根据权利要求1或2所述培养液，其特征在于，所述胚胎为牛早期胚胎。
4.一种牛胚胎体外生产的方法，其特征在于，包括在含5-lOmmol/Iifepes、 15-26. 2mmol/L NaHCO3>30 50 μ g/L 的 BDNF 以及 3-5% OCS 的 TCM-199 培养液中培养牛 早期胚胎，定期更换培养液，获得囊胚期胚胎的步骤。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述培养液为含有5mm0l/LHepes、 26. 2mmol/L NaHCO3>40 μ g/L 的 BDNF 以及 3% OCS 的 TCM-199 培养液。
6.根据权利要求4或5所述方法，其特征在于，所述早期胚胎为通过体外受精生产的早 期胚胎。
7.根据权利要求4或5所述方法，其特征在于，所述早期胚胎为通过孤雌激活生产的早 期胚胎。
8.根据权利要求4或5所述方法，其特征在于，所述早期胚胎为通过核移植生产的早期 胚胎。全文摘要
本发明涉及生物技术领域，公开了一种用于胚胎体外生产的培养液，所述培养液为含5-10mmol/L Hepes、15-26.2mmol/L NaHCO3、30～50μg/L的BDNF以及3-5％OCS的TCM-199培养液，其中优选地所述培养液中BDNF浓度为40μg/L。本发明所述培养液能显著提高牛体外胚胎发育成囊胚的比率。本发明还提供了利用所述培养液进行牛胚胎体外生产的方法。
文档编号C12N5/073GK101886059SQ201010224589
公开日2010年11月17日 申请日期2010年7月6日 优先权日2010年7月6日
发明者周虚, 易康乐, 李纯锦 申请人:周虚