专利名称：一种提高动物体外胚胎囊胚发育率的方法
技术领域：
本发明涉及动物繁殖育种领域，具体地涉及一种提高动物体外胚胎囊胚发育率的方法。
背景技术：
胚胎体外生产技术不仅能提高动物的繁殖力，还能降低生产成本，并为以胚胎为对象的研究提供大量材料。但是，如何提高囊胚发育率是此技术的难点。目前，国内外提高牛体外囊胚发育率技术主要从改进培养液成分和培养环境两方面入手。例如，在卵母细胞成熟培养液中添加胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸纳(ITS)或者在常规胚胎培养液中添加白血病生长抑制因子(LIF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)和褪黑素(MT)等都可以提供牛的囊胚发育率。因此，市场上不断出现新的胚胎培养液，如美国Millipore和Caisson公司推出不同的SOF和KS0M。目前国内外有关提高体外囊胚发育率方法的技术有(I) 一种提高水 牛体外胚胎生产效率的方法通过向培养液中添加10 u L/mL和20 u L/mL胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)进行体外成熟、体外培养能提高水牛卵母细胞的体外成熟率和囊胚发育率；—种犊牛体外胚胎培养液在商品化的胚胎培养液G2. 5的基础上加入1000u/mL的白血病生长抑制因子和10ng/mL的碱性成纤维生长因子，能够显著提高人废弃胚胎的囊胚发育率和胚胎干细胞的建系效率；早期胚胎体外发育培养液对犊牛体外胚胎进行培养，可以获得较高的囊胚发育率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高动物体外胚胎囊胚发育率的方法。本发明的另一目的在于提供一种动物胚胎发育培养液。本发明提供的提高动物体外胚胎囊胚发育率的方法，是在动物胚胎发育培养液中添加I型干扰素。
具体地，本发明提供的提高动物体外胚胎囊胚发育率的方法，是在动物胚胎发育培养液中添加rbIFN- T。所述的rbIFN-T是本发明前期自行研制的重组蛋白，其制备方法已公开在专利号为200710121136. 8的中国发明专利中，授权公告号为CN101116640B。所述的动物胚胎发育培养液为本领域常用的胚胎发育培养液，如孤雌激活的胚胎发育培养液采用S0Faa+8mg/mLBSA的培养液或S0Faa+8mg/mL BSA ;体外受精胚胎发育培养液选用CRlaa,其配方参见本申请附录或文献Ushijima H, Yamakawa H, NagashimaH. Cryopreservation of bovine pre-morula-stage in vitro matured/in vitrofertilized embryos after delipidation and before use in nucleus transfer. BiolReprod 1999，60:534-539.。本发明提供的提高动物体外胚胎囊胚发育率的方法是在孤雌胚胎激活后的第4天或体外受精卵受精后的第4天的胚胎发育培养液中添加rbIFN- T。
进一步地，添加rblFN-T的终浓度为10(T200ng/mL。优选地，在胚胎发育培养液中添加终浓度为lOOng/mL的rbIFN- x。其中，开始添加rbIFN-T后，每隔48h更换体积百分比为原培养液50%的含rbIFN- T培养液。进一步地，上述培养条件为38. 50C，5%C02和100%湿度。本发明提供的提高动物体外胚胎囊胚发育率的方法适用动物为牛、羊。本发明还提供了一种含有rbIFN-T的动物胚胎发育培养液。 进一步地，上述动物胚胎发育培养液的rbIFN- T的有效浓度为10(T200ng/mL。进一步地，上述动物胚胎发育培养液的rbIFN- T的有效浓度为100ng/mL。本发明提供了 rbIFN-T在动物体外胚胎培养中的应用。本发明通过向胚胎发育培养液中添加rbIFN-T进行胚胎的体外培养，能显著的提高孤雌激活胚胎与体外受精胚胎的发育能力，本发明方法比常规培养液培养下的囊胚率提高79^13%，囊胚孵化率也显著高于常规培养液培养下的囊胚孵化率。本发明提供的提高动物体外胚胎囊胚发育率的方法能够显著提高了牛体外胚胎早期发育能力，从而提高了牛胚胎体外生产效率，降低了生产成本，同时为以胚胎为材料的研究和生产提供了大量优质的胚胎。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中使用的试剂除特别说明外，均为市售。实施例I rbIFN-T对牛卵母细胞孤雌激活胚胎发育的影响I、牛卵母细胞的采取与体外成熟培养从屠宰场收集牛卵巢，将其置于含有27±2°C的生理盐水的保温瓶内。到实验室之后用37°C预热的灭菌生理盐水洗涤卵巢3遍，然后用注射器抽吸卵巢上面2-8mm卵泡内的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，将具有完整卵丘细胞层或部分致密卵丘细胞在的洗卵液中洗涤2次，然后在成熟液中洗涤3次，将洗净的卵母细胞移入100 u L卵母细胞体外成熟培养微滴中，每个微滴放入15 20个卵母细胞，最后置入38. 5°C、5%C02和饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养24小时。2、牛卵母细胞的孤雌激活将成熟24小时的卵母细胞放入含有0. I %透明质酸酶管内，用移液枪反复吹打I分钟去除卵丘细胞，然后用含10% FBS的H199液洗涤3遍，将形态完整、细胞质均匀的卵母细胞在5iimol/L离子霉素中激活5分钟后，移入含有2.0mmol/L 6-DMAP (二甲基嘌呤)的S0Faa+8mg/mL BSA培养液中培养4小时。然后用S0Faa+8mg/mLBSA洗3遍，转到预平衡4小时的S0Faa+8mg/mL BSA微滴中，每滴15-20枚，置于38. 5°C，5% CO2和饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，孤雌激活后48小时检查卵裂率，继续培养6天，作为对照组。统计囊胚率(详见表I)。每隔48小时换半液，即换去50%的S0Faa+8mg/mLBSA的胚胎发育培养液，加入50%的新的SOFaa+8mg/mLBSA胚胎发育培养液。3、rbIFN- x对牛孤雌激活胚胎发育的影响从屠宰场取屠宰牛的卵巢吸取2_8mm直径卵泡的COCs，经IVM 24小时后进行孤雌激活，然后将其置于S0Faa+8mg/mLBSA中培养，每隔48小时换液1/2体积培养条件38. 5°C, 5% CO2和饱和(100%)湿度，第2天观察卵裂率，第8天观察囊胚率。在孤雌激活后的第4天换半液开始添加rbIFN-T使整个培养液中rbIFN-T终浓度为100ng/mL。实验重复3次(详见表I)。表I rblFN-T对牛孤雌激活胚胎发育的影响
权利要求
1.一种提高动物体外胚胎囊胚发育率的方法，其特征在于，在动物胚胎发育培养液中添加I型干扰素。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，在动物胚胎发育培养液中添加rbIFN-T。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在孤雌胚胎激活后的第4天或体外受精卵受精后的第4天的胚胎发育培养液中添加rbIFN- T。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在动物胚胎发育培养液中添加终浓度为100 200ng/mL 的 rbIFN- x。
5.如权利要求2 4任一所述的方法，其特征在于，每隔48h更换体积百分比为原培养液50%的含rbIFN- T的培养液。
6.如权利要求I 4任一所述的方法，其特征在于，培养条件为38.5°C，5% CO2和100%湿度。
7.如权利要求I 4任一所述的方法，其特征在于，所述的动物为牛或羊。
8.权利要求I 7任一所述的方法在体外胚胎培养中的应用。
9.一种动物胚胎发育培养液，其特征在于，含有rbIFN-T。
10.rbIFN- T在动物体外胚胎培养中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种提高动物体外胚胎囊胚发育率的方法。本发明方法通过向胚胎发育培养液中添加I型干扰素进行胚胎的体外培养，能显著的提高孤雌激活胚胎与体外受精胚胎的发育能力，比常规培养液培养下的囊胚率提高7％～13％，囊胚孵化率也显著高于常规培养液培养下的囊胚孵化率。本发明方法提高了牛、羊体外胚胎早期发育能力，从而提高了牛、羊胚胎体外生产效率，为以牛羊胚胎为材料的科研和生产领域提供高质量的胚胎。
文档编号C12N5/073GK102703377SQ201210190389
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月8日 优先权日2012年6月8日
发明者曾申明, 赵栓, 鲍忠剑 申请人:中国农业大学