专利名称：一种分离纯化达托霉素的方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种分离纯化达托霉素的方法。
背景技术：
达托霉素是从玫瑰孢链霉菌发酵液中提取得到的环脂肽类物质，最初是由美国Lily公司于80年代开发，1997年11月，Lily公司将达托霉素的全球独家开发、生产及销售权转让给Cubist制药公司，2003年9月12日，FDA首次批准Cubicin (Daptomycin注射齐U)上市。它是获准上市的首个环脂肽类抗生素药物，用于治疗由一些革兰氏阳性敏感菌株引起的并发性皮肤及皮肤结构感染。2006年在澳大利亚，德国，荷兰，西班牙，英国上市，2007年在瑞士上市。随后在加拿大，韩国，欧盟等10多个国家注册。2006年3月美国FDA又批准了达托霉素的新的适应症一用于治疗对甲氧西林敏感的金葡菌(MSSA)或耐甲氧西林金葡菌(MRSA)性菌血症及其引起的右侧心内膜炎。作为近四十年开发的仅有两类新结构抗生素之一，2000年Pfizer公司研发的利奈唑烷(linezolid)上市不到一年就出现交叉耐药菌的报道。达托霉素具有可以赋予其临床优势的数项独特性质。首先，它的作用机制与现已上市的各类抗菌药物都不相同，这意味着达托霉素将不会受到来自其它抗生素所致交叉耐药性的影响，达托霉素作为应用到临床的首个环脂肽类抗生素，至今尚未有交叉耐药菌的报道，临床耐药菌株的出现几率极低(〈O. 2%)。其次，达托霉素已经显现能在体外迅速抑制大多数临床重要革兰阳性球菌，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素粪肠球菌和耐万古霉素金黄色葡萄球菌。第三，与传统抗生素至少一日2次给药相比，达托霉素仅需一日I次用药，剂量方案明显简化并可有效降低医疗成本支出。基于上述诸因素，据统计，此药上市后第一年即取得约6000万美元的收入，2006年的销售额较2005年涨幅是68% ；2009销售额5 6亿美元。而且在以后数年还有上升潜力，市场前景广阔。目前，卡比斯特制药公司掌握全球独家开发、生产及销售权，国内也有多家机构正在研究，但现有的纯化水平仍然较低。现有技术关于达托霉素的纯化方法的报道，纯度均在98%以下,且操作复杂。美国卡比斯特制药公司申请的中国专利CN1404487中通过交替使用阴离子交换色谱、疏水相互作用色谱和阴离子交换色谱进行反复纯化，最后制得色谱纯度大于98%的达托霉素。另一篇卡比斯特制药公司专利CN201010578392. I纯度95%。丹麦的埃克斯利亚制药有限公司申请的中国专利CN201080008292. 3使用阴离子交换色谱柱和反向色谱柱进行纯化，最终纯度95%。中国专利200910058577. 7使用阴离子和C4反向硅胶复合物作为复合型反向硅胶柱进行纯化，所报道的达托霉素纯度98. 64%。中国专利CN201010196247. 7采用凝胶型弱阴离子树脂进行纯化，所报道的达托霉素纯度98%
发明内容
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本发明的目的是提供一种分离纯化达托霉素的方法。该方法克服了达托霉素现有的提取技术的不足，提高了达托霉素的纯度，从而提供一种能够工业化纯化达托霉素的方法。本发明主要包括如下步骤I)陶瓷膜过滤达托霉素发酵液；2)大孔吸附树脂柱层析；3)纳滤浓缩；4)疏水树脂柱层析第一步粗分；5)离子交换树脂柱层析； 6)疏水树脂柱层析第二步粗分；7)超滤；8)冷冻干燥。具体地包括如下操作步骤I)陶瓷膜过滤达托霉素发酵液用纯化水或5% 30%的乙醇溶液将发酵液稀释，控制料液温度范围20 40°C进行陶瓷膜过滤，当过滤至陶瓷膜未透过液体积为发酵液初始体积的30% 35%时，对陶瓷膜未透过液进行清洗。清洗方式有两种第一种方式，向发酵液中加纯化水5L，加完纯化水后循环5分钟后开始收集陶瓷膜透过液；当发酵液再次浓缩到初始体积的35%左右时继续向发酵液中加入纯化水5L，如此循环，直到加入的纯化水总体积和发酵液初始总体积相等或HPLC检测陶瓷膜透过液中达托霉素单位小于50mg/L时，陶瓷膜过滤结束，收集陶瓷膜透过液。第二种方式，连续向发酵罐中加入纯化水，调节流速使发酵液暂存罐中液位保持不变，直到加入的纯化水总体积和发酵液初始总体积相等或HPLC检测陶瓷膜透过液中达托霉素单位小于50mg/L时，陶瓷膜过滤结束，收集陶瓷膜透过液。2)大孔吸附树脂柱层析将收集的陶瓷膜透过液上样大孔吸附树脂柱，树脂型号为H103，树脂柱径高比1:3 4，流速I I. 5倍柱体积/小时，上样结束后用酒精度5% 15%的乙醇冲洗树脂柱,流速I I. 5倍柱体积/小时，共冲洗5倍柱体积，HPLC检测最后流出液无达托霉素穿透，然后用酒精度60% 80%的乙醇冲洗树脂柱以洗脱达托霉素，流速I I. 5倍柱体积/小时，直到流出液HPLC检测达托霉素单位低于100mg/L，停止洗脱，收集达托霉素单位大于100mg/L的60% 80%乙醇洗脱液。用85% 90%乙醇洗脱吸附在柱子上的杂质至无杂质峰出现，最后用酒精度10% 20%的乙醇对树脂柱进行平衡处理。3)纳滤对收集到的酒精度60% 80%的乙醇洗脱液进行纳滤以除掉小分子量的杂质，并对收集液进行浓缩。控制温度在20 30°C，收集纳滤浓缩液，然后向其中加入氯化钠或氯化钾，加入量为每升浓缩液中加入5 20g氯化钠或氯化钾，再用0. 5 2mol/L醋酸溶液调pH值至4 5。4)疏水树脂柱层析第一步粗分
采用LP20mm树脂柱层析，树脂柱径高比1:3 4。对pH值4 5的纳滤浓缩液上样，上样流速控制在0. 6 I倍柱体积/小时，上样结束后，用10%乙腈进行洗脱，收集达托霉素纯度大于85%的洗脱液。5)离子交换层析树脂型号NM-Q，树脂柱径高比1:3 4。用0. 5 2mol/L氢氧化钠溶液将达托霉素纯度大于85%的收集液调节pH值至7. 5，上离子交换树脂柱，上样流速0. 5 2. 0倍柱体积/小时，用10 30g/L的氯化钠溶液洗脱，进一步去除杂质分离纯化，收集液中达托霉素的纯度在92% 93%。6)疏水树脂柱层析第二步粗分选用XT-30树脂，树脂柱径高比1:3 4。上步收集的洗脱液乙酸调pH值为4. 8作为待上样液。 上样，上样流速0. 5 I. 5倍柱体积/小时，上样结束后，用20%乙醇(V/V)(含醋酸铵40 70mmol/L，pH值4 5)冲洗树脂柱3 5倍柱体积，然后用30%乙醇(V/V)(含醋酸铵40 70mmol/L，pH值4 5)冲洗树脂柱3 5倍柱体积，然后用50%乙醇(V/V)(含醋酸铵40 70mmol/L，pH值4 5)进行洗脱，收集达托霉素纯度大于99%的洗脱液。7)超滤用聚醚砜超滤膜，截留分子量3000。对收集到的纯度大于99%的洗脱液超滤，以去除洗脱液中的乙醇、醋酸盐并对收集液浓缩，用纯化水清洗超滤浓缩液至乙醇含量在
0.05%以下。8)冷冻干燥先在_60°C _45°C压力低于20Pa的条件下冷冻2 8小时；然后在_60°C 20°C，压力为20 60Pa条件下冻干50 80小时；最后在20°C 30°C，压力低于IOPa的条件下冻干2 8小时即可得到达托霉素纯品，达托霉素纯度在99. 2%以上。文献报道所制制备的达托霉素纯度在98%，我们的纯化方法所得达托霉素产品纯度在99. 2%以上，高于现有技术。能够为制剂的制备提供更优良的原料，减少药物使用过程中的副作用。
图I达托霉素纯化工艺路线
具体实施例方式通过下面具体实施例，可以更清楚地了解本发明的特征和进步，但本发明不受这些实施例的限制。实施例I接收待放罐发酵液20L，发酵效价1200mg/L，用纯化水18L将发酵液稀释，稀释后发酵单位631. 5mg/L，料液温度25°C，陶瓷膜过滤。当浓缩至6L时，向陶瓷膜未透过液中加A 2. 5L纯化水，搅拌5min，继续陶瓷膜过滤。当再次浓缩至6L时，向陶瓷膜未透过液中加A 2. 5L纯化水，搅拌5min，继续陶瓷膜过滤。如此重复操作8次，共加入纯化水20L。取样，HPLC检测陶瓷膜透过液中达托霉素48mg/L，陶瓷膜过滤结束。共收集陶瓷膜透过液52L，含达托霉素21. 8g。将收集的陶瓷膜透过液上样，大孔吸附树脂柱，树脂型号H103，体积3L，树脂柱径高比1:4，流速I. 2倍柱体积/小时。上样结束后用酒精度5%的乙醇冲洗树脂柱，流速I倍柱体积/小时，共冲洗5倍柱体积，HPLC检测最后流出液无达托霉素穿透；然后用酒精度60%的乙醇冲洗树脂柱以洗脱达托霉素，流速I倍柱体积/小时，即时取样检测达托霉素含量，收集达托霉素单位大于100mg/L的洗脱液，共收集7L，含达托霉素20. 3g。对7L收集液进行纳滤浓缩，温度在20°C，收集纳滤浓缩液2L，加入3L纯化水稀释，然后向其中加入氯化钠60g，用0. 5mol/L醋酸溶液调pH值至4. 5。准备上样进行树脂柱层析第一步粗分。采用LP20mm树脂，柱体积1L，树脂柱径高比1:4，上样流速控制在0. 8倍柱体积/小时，上样结束后，用10%乙腈进行洗脱，对洗脱液即时取样，收集达托霉素纯度大于85%的洗脱液，共收集洗脱液3L，达托霉素纯度87%，含达托霉素15g。 用0. 5mol/L氢氧化钠溶液将纯度87%的收集液调节pH值至7. 5，上离子交换树脂柱，树脂型号NM-Q，柱体积1L，树脂柱径高比1:4，上样流速0. 5倍柱体积/小时，用20g/L的氯化钠溶液洗脱，收集达托霉素纯度大于90%的洗脱液，共收集洗脱液2L，达托霉素纯度92. 5%，含达托霉素12. 8g。将收集液用纯化水稀释I倍后，用乙酸调pH值为4. 8作为待上样液，进行树脂柱层析第二步粗分，树脂型号XT-30，柱体积800毫升，树脂柱径高比1:4，上样流速0. 6倍柱体积/小时。上样结束后，用20%乙醇(V/V)(含醋酸铵50mmol/L，pH值4. 8)冲洗树脂柱3倍柱体积,然后用30%乙醇(V/V)(含醋酸铵50mmol/L，pH值4. 8)冲洗树脂柱3倍柱体积，然后用50%乙醇(V/V)(含醋酸铵50mmol/L，pH值4. 8)进行洗脱，收集达托霉素纯度大于99%的洗脱液，共收集2. 3L，收集液中达托霉素纯度99. 4%，含达托霉素9. 5g。用稀醋酸调节收集液pH值为3. 2，用截留分子量3000的聚醚砜超滤膜超滤，滤除收集液中的乙醇和醋酸盐，用纯化水清洗超滤浓缩液至乙醇含量在0. 03%。收集超滤浓缩液冷冻干燥，先在_45°C，压力低于ISPa的条件下冷冻6小时；然后在_60°C，压力为50Pa条件下冻干80小时；最后在25°C，压力8Pa的条件下冻干8小时，得达托霉素冻干粉末8. 5g，HPLC检测达托霉素纯度99. 4%。实施例2接收待放罐发酵液25L，发酵效价1320mg/L，用5%的乙醇25L将发酵液稀释，稀释后发酵单位660mg/L，料液温度25°C，陶瓷膜过滤。当浓缩至8L时，向陶瓷膜未透过液中加入3L5%的乙醇，搅拌5min，继续陶瓷膜过滤。当再次浓缩至8L时，向陶瓷膜未透过液中加入3L5%的乙醇，搅拌5min，继续陶瓷膜过滤。如此重复操作8次，共加入5%的乙醇24L。取样，HPLC检测陶瓷膜透过液中达托霉素42mg/L，陶瓷膜过滤结束。共收集陶瓷膜透过液65L，含达托霉素30. lg。将收集的陶瓷膜透过液上样大孔吸附树脂柱，树脂型号H103，柱体积3L，树脂柱径高比1: 3，流速I. 2倍柱体积/小时。上样结束后用酒精度15%的乙醇冲洗树脂柱，流速
I.5倍柱体积/小时，共冲洗5倍柱体积，HPLC检测最后流出液无达托霉素穿透；然后用酒精度80%的乙醇冲洗树脂柱以洗脱达托霉素，流速I. 5倍柱体积/小时，即时取样检测达托霉素含量，收集达托霉素单位大于100mg/L的洗脱液，共收集洗脱液8L，含达托霉素27g。
对8L收集液进行纳滤浓缩，温度在22°C，收集纳滤浓缩液2. 5L，加入4. 5L纯化水稀释，然后向其中加入氯化钠35g，用2mol/L醋酸溶液调pH值至4. 2。准备上样进行树脂柱层析第一步粗分。采用LP20mm树脂，柱体积1L，树脂柱径高比1:4，上样流速控制在0. 8倍柱体积/小时，上样结束后，用10%乙腈进行洗脱，对洗脱液即时取样，收集达托霉素纯度大于85%的洗脱液，共收集洗脱液3L，达托霉素纯度88%，含达托霉素21.5g。用2mol/L氢氧化钠溶液将纯度88%的收集液调节pH值至7. 5，上离子交换树脂柱，树脂型号NM-Q，柱体积1L，树脂柱径高比1: 4，上样流速2倍柱体积/小时，用10g/L的氯化钠溶液洗脱，收集达托霉素纯度大于90%的洗脱液2L，达托霉素纯度92. 5%，含达托霉素 19. Ig0将收集液用纯化水稀释I倍后，用乙酸调pH值为4. 8作为待上样液，进行树脂柱层析第二步粗分，树脂型号XT-30，柱体积800毫升，树脂柱径高比1:4，上样流速0. 5倍柱·体积/小时。上样结束后，用20%乙醇(V/V)(含醋酸铵40mmol/L，pH值4)冲洗树脂柱3倍柱体积，然后用30%乙醇(V/V)(含醋酸铵40mmol/L，pH值4)冲洗树脂柱5倍柱体积，然后用50%乙醇(V/V)(含醋酸铵40mmol/L，pH值4)进行洗脱，收集达托霉素纯度大于99%的洗脱液，共收集2. 5L，收集的洗脱液中达托霉素纯度为99. 7 %，含达托霉素15. 3g。用稀醋酸调节收集液pH值为3. 2，用截留分子量3000的聚醚砜超滤膜超滤，滤除收集液中的乙醇和醋酸盐，用纯化水清洗超滤浓缩液至乙醇含量在0. 05%。收集超滤浓缩液冷冻干燥，先在_60°C，压力低于20Pa的条件下冷冻2小时；然后在20°C，压力为20Pa条件下冻干80小时；最后在20°C，压力IOPa的条件下冻干2小时，得达托霉素冻干粉末11. 5g, HPLC检测达托霉素纯度99. 6%。实施例3接收待放罐发酵液27L，发酵效价1180mg/L，用30%的乙醇15L将发酵液稀释，稀释后发酵单位758mg/L，料液温度40°C，陶瓷膜过滤。当浓缩至9L时，向陶瓷膜未透过液中加入3L30%的乙醇，搅拌5min，继续陶瓷膜过滤。当再次浓缩至9L时，向陶瓷膜未透过液中加入3L30%的乙醇，搅拌5min，继续陶瓷膜过滤。如此重复操作8次，共加入30%的乙醇24L。取样，HPLC检测陶瓷膜透过液中达托霉素40mg/L，陶瓷膜过滤结束。共收集陶瓷膜透过液56L，含达托霉素28. 8g。将收集的陶瓷膜透过液上样大孔吸附树脂柱，树脂型号H103，柱体积3L，树脂柱径高比1:4，流速I. 5倍柱体积/小时。上样结束后用酒精度5%的乙醇冲洗树脂柱，流速I倍柱体积/小时，共冲洗5倍柱体积，HPLC检测最后流出液无达托霉素穿透；然后用酒精度80%的乙醇冲洗树脂柱以洗脱达托霉素，流速I倍柱体积/小时，即时取样检测达托霉素含量，收集达托霉素单位大于100mg/L的洗脱液，共收集洗脱液8L，含达托霉素26g。对8L收集液进行纳滤浓缩，温度在30°C，收集纳滤浓缩液2. 5L，加入4L纯化水稀释，然后向其中加入氯化钠130g，用0. 5mol/L醋酸溶液调pH值至5。准备上样进行树脂柱层析第一步粗分。采用LP20mm树脂，柱体积1L，树脂柱径高比1:4，上样流速控制在I倍柱体积/小时，上样结束后，用10%乙腈进行洗脱，对洗脱液即时取样，收集达托霉素纯度大于85%的洗脱液，共收集3L，达托霉素纯度89%，含达托霉素19. 5g0
用0. 5mol/L氢氧化钠溶液将纯度89%的收集液调节pH值至7. 5，上离子交换树脂柱，树脂型号NM-Q,柱体积1L，树脂柱径高比1:4，上样流速2倍柱体积/小时，用30g/L的氯化钠溶液洗脱，收集达托霉素纯度大于90%的洗脱液，共收集洗脱液2L，达托霉素纯度93%,含达托霉素15. 6g。将收集液用纯化水稀释I倍后，用乙酸调pH值为4. 8作为待上样液，进行树脂柱层析第二步粗分，树脂型号XT-30，柱体积800毫升，树脂柱径高比1:4，上样流速I. 5倍柱体积/小时。上样结束后，用20%乙醇(V/V)(含醋酸铵70mmol/L，pH值5)冲洗树脂柱3倍柱体积，然后用30%乙醇(V/V)(含醋酸铵70mmol/L，pH值5)冲洗树脂柱3倍柱体积，然后用50%乙醇(V/V)(含醋酸铵70mmol/L，pH值5)进行洗脱，收集达托霉素纯度大于99%的洗脱液，共收集2. 5L，HPLC检测收集液中达托霉素纯度99. 5%,含达托霉素12g。用稀醋酸调节收集液pH值为3. 2，用截留分子量3000的聚醚砜超滤膜超滤，滤除收集液中的乙醇和醋酸盐，用纯化水清洗超滤浓缩液至乙醇含量在0. 05%。
收集超滤浓缩液冷冻干燥，先在_45°C，压力低于ISPa的条件下冷冻8小时；然后在_60°C，压力为60Pa条件下冻干50小时；最后在30°C，压力8Pa的条件下冻干2小时，得达托霉素冻干粉末11. 2g，HPLC检测达托霉素纯度99. 5%。实施例4接收待放罐发酵液28L，发酵效价1230mg/L，用纯化水22L将发酵液稀释，稀释后发酵单位688mg/L，料液温度25°C，陶瓷膜过滤。当浓缩至9L时，以恒定的流速向陶瓷膜未透过液中连续加入纯化水28L，保持浓缩液体积基本不变，从陶瓷膜透过液中取样，HPLC检测达托霉素含量45mg/L，陶瓷膜过滤结束。共收集陶瓷膜透过液68L，含达托霉素31. 3g。将收集的陶瓷膜透过液上样大孔吸附树脂柱，树脂型号H103，柱体积3L，树脂柱径高比1:4，流速I. 5倍柱体积/小时。上样结束后用酒精度5%的乙醇冲洗树脂柱，流速I倍柱体积/小时，共冲洗5倍柱体积，HPLC检测最后流出液无达托霉素穿透；然后用酒精度60%的乙醇冲洗树脂柱以洗脱达托霉素，流速I倍柱体积/小时，即时取样检测达托霉素含量，收集达托霉素单位大于100mg/L的洗脱液，共收集洗脱液7L，含达托霉素28. lg。对7L收集液进行纳滤浓缩，温度在20 22°C，收集纳滤浓缩液3L，加入4L纯化水稀释，然后向其中加入氯化钠105g，用0. 5mol/L醋酸溶液调pH值至4.5。准备上样进行树脂柱层析第一步粗分。采用LP20mm树脂，柱体积1L，树脂柱径高比1:4，上样流速控制在0. 8倍柱体积/小时，上样结束后，用10%乙腈进行洗脱，对洗脱液即时取样，收集达托霉素纯度大于85%的洗脱液，共收集3L，达托霉素纯度87%，含达托霉素
21.5g0用0. 5mol/L氢氧化钠溶液将纯度87%的收集液调节pH值至7. 5，上离子交换树脂柱，树脂型号NM-Q，柱体积1L，树脂柱径高比1:4，上样流速0. 5倍柱体积/小时，用20g/L的氯化钠溶液洗脱，收集达托霉素纯度大于90%的洗脱液，共收集2L，达托霉素纯度92. 5%,含达托霉素17. 5g。将收集液用纯化水稀释I倍后，用乙酸调pH值为4. 8作为待上样液，进行树脂柱层析第二步粗分，树脂型号XT-30，柱体积800毫升，树脂柱径高比1:4，上样流速0. 6倍柱体积/小时。上样结束后，用20%乙醇(V/V)(含醋酸铵50mmol/L，pH值5)冲洗树脂柱3倍柱体积，然后用30%乙醇(V/V)(含醋酸铵50mmol/L，pH值5)冲洗树脂柱3倍柱体积，然后用50%乙醇(V/V)(含醋酸铵50mmol/L，pH值5)进行洗脱，收集达托霉素纯度大于99%的洗脱液，共收集3L，收集的洗脱液中达托霉素纯度99. 5%,含达托霉素14g。用稀醋酸调节收集液pH值为3. 2，用截留分子量3000的聚醚砜超滤膜超滤，滤除收集液中的乙醇和醋酸盐，用纯化水清洗超滤浓缩液至乙醇含量在0. 03%。收集超滤浓缩液冷冻干燥，先在_45°C，压力低于ISPa的条件下冷冻8小时；然后在_60°C，压力为50Pa条件下冻干60小时；最后在25°C，压力8Pa的条件下冻干8小时，得达托霉素冻干粉末12. 5g，HPLC检测达托霉素纯度99. 5%。实施例5接收待放罐发酵液25L，发酵效价1310mg/L，用纯化水20L将发酵液稀释，稀释后发酵单位727mg/L，料液温度25°C，陶瓷膜过滤。当浓缩至9L时，以恒定的流速向陶瓷膜未 透过液中连续加入纯化水25L，保持浓缩液体积基本不变，从陶瓷膜透过液中取样，HPLC检测达托霉素含量40mg/L，陶瓷膜过滤结束。共收集陶瓷膜透过液62L，含达托霉素29. 5g。将收集的陶瓷膜透过液上样大孔吸附树脂柱，树脂型号H103，柱体积3L，树脂柱径高比1:4，流速I. 5倍柱体积/小时。上样结束后用酒精度5%的乙醇冲洗树脂柱，流速I倍柱体积/小时，共冲洗5倍柱体积，HPLC检测最后流出液无达托霉素穿透；然后用酒精度60%的乙醇冲洗树脂柱以洗脱达托霉素，流速I倍柱体积/小时，即时取样检测达托霉素含量，收集达托霉素单位大于100mg/L的洗脱液，共收集洗脱液7. 5L，含达托霉素26. 5g。对7. 5L收集液进行纳滤浓缩，温度在20 22°C，收集纳滤浓缩液2. 5L，加入4L纯化水稀释，然后向其中加入氯化钠100g，用0. 5mol/L醋酸溶液调pH值至4. 5。准备上样进行树脂柱层析第一步粗分。采用LP20mm树脂，柱体积1L，树脂柱径高比1:4，上样流速控制在0. 8倍柱体积/小时，上样结束后，用10%乙腈进行洗脱，对洗脱液即时取样，收集达托霉素纯度大于85%的洗脱液，共收集3L，达托霉素纯度88%，含达托霉素
21.5g0用0. 5mol/L氢氧化钠溶液将纯度88%的收集液调节pH值至7. 5，上离子交换树脂柱，树脂型号HZ-201，柱体积1L，树脂柱径高比1: 4，上样流速0. 5倍柱体积/小时，用20g/L的氯化钠溶液洗脱，收集达托霉素纯度大于90%的洗脱液，共收集I. 5L，达托霉素纯度92%，含达托霉素14. 3g。将收集液用纯化水稀释I倍后，用乙酸调pH值为4. 8作为待上样液，进行树脂柱层析第二步粗分，树脂型号XT-30，柱体积800毫升，树脂柱径高比1:4，上样流速0. 6倍柱体积/小时。上样结束后，用20%乙醇(V/V)(含醋酸铵50mmol/L，pH值5)冲洗树脂柱3倍柱体积，然后用30%乙醇(V/V)(含醋酸铵50mmol/L，pH值5)冲洗树脂柱3倍柱体积，然后用50%乙醇(V/V)(含醋酸铵50mmol/L，pH值5)进行洗脱，收集达托霉素纯度大于99%的洗脱液，共收集2L，收集的洗脱液中达托霉素纯度99. 2%，含达托霉素10. 5g。用稀醋酸调节收集液pH值为3. 2，用截留分子量3000的聚醚砜超滤膜超滤，滤除收集液中的乙醇和醋酸盐，用纯化水清洗超滤浓缩液至乙醇含量在0. 03%。收集超滤浓缩液冷冻干燥，先在_45°C，压力低于ISPa的条件下冷冻8小时；然后在_60°C，压力为50Pa条件下冻干60小时；最后在25°C，压力8Pa的条件下冻干8小时，得达托霉素冻干粉末9g，HPLC检测达托霉素纯度99. 2%。
权利要求
1.一种分离纯化达托霉素的方法，其特征在于它依次包括如下步骤 1)陶瓷膜过滤达托霉素发酵液； 2)大孔吸附树脂柱层析； 3)纳滤浓缩； 4)疏水树脂柱层析第一步粗分； 5)离子交换树脂柱层析； 6)疏水树脂柱层析第二步粗分； 7)超滤； 8)冷冻干燥。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤I)所述陶瓷膜过滤包括用纯化水或5% 30%的乙醇将发酵液稀释，控制料液温度范围20 40°C，进行陶瓷膜过滤。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤2)所述大孔吸附树脂柱的树脂型号为H103，树脂柱径高比1:3 4。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤2)所述大孔吸附树脂柱吸附包括控制上样流速I I. 5倍柱体积/小时；上样结束后先用酒精度5% 15%的乙醇冲洗树脂柱直至HPLC检测最后流出液无达托霉素达托霉素穿透，冲洗流速I I. 5倍柱体积/小时，共冲洗5倍柱体积；然后用酒精度60% 80%的乙醇冲洗树脂柱以洗脱达托霉素，流速I I. 5倍柱体积/小时，直到流出液HPLC检测达托霉素单位低于100mg/L，停止洗脱，收集酒精度60% 80%乙醇洗脱收集液。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤3)所述纳滤包括控制温度在20 30°C，收集纳滤浓缩液，然后向其中加入氯化钠或氯化钾，加入量为每升浓缩液中加入5 20g氯化钠或氯化钾,再用0. 5 2mol/L醋酸溶液调pH值至4 5。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述疏水树脂柱为LP20mm树脂柱，树脂柱的径高比1:4。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤4)所述疏水树脂柱层析第一步粗分包括上样流速控制在0. 6 I倍柱体积/小时，上样结束后用10%乙腈进行洗脱，收集达托霉素纯度大于85%的洗脱液。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤5)所述的离子交换层析的树脂型号NM-Q，树脂柱径高比1:4。
9.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤5)所述的离子交换层析包括用0.5 2mol/L氢氧化钠溶液将步骤4)所得收集液调节pH值至7. 5，上离子交换树脂柱，上样流速0.5 2. 0倍柱体积/小时，用10 30g/L的氯化钠溶液洗脱。
10.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤6)中所述疏水树脂柱中的树脂型号XT-30，树脂柱径高比1:4。
11.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤6)包括将步骤5)收集的洗脱液用乙酸调PH值为4. 8作为待上样液，上样，上样流速0. 5 I. 5倍柱体积/小时，上样结束后，用20%乙醇(V/V)(含醋酸铵40 70mmol/L，pH值4 5)冲洗树脂柱3 5倍柱体积，然后用30%乙醇(V/V)(含醋酸铵40 70mmol/L，pH值4 5)冲洗树脂柱3 5倍柱体积，然后用50%乙醇(V/V)(含醋酸铵40 70mmol/L，pH值4 5)进行洗脱，收集达托霉素纯度大于99%的洗脱液。
12.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤7)所述的超滤膜用聚醚砜超滤膜，截留分子量3000。
13.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤7)所述的超滤使用纯化水清洗超滤浓缩液至乙醇含量在0. 05%以下。
14.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤8)包括先在_60°C _45°C压力低于20Pa的条件下冷冻2 8小时；然后在-60°C 20°C，压力为20 60Pa条件下冻干50 80小时；最后在20°C 30°C，压力低于IOPa的条件下冻干2 8小时。
全文摘要
本发明提供了一种分离纯化达托霉素的方法。该方法克服了达托霉素现有的提取技术的不足，提高了达托霉素的纯度，使最终达托霉素纯度达到99.2以上，从而提供一种能够工业化纯化达托霉素的方法。
文档编号C07K1/34GK102718839SQ20121023089
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月5日 优先权日2012年7月5日
发明者孙颖, 张培训, 朱海洋, 武猛, 王蒙, 赵志全, 邵长阔 申请人:鲁南新时代生物技术有限公司