专利名称：添加达托霉素合成关键酶辅因子提高达托霉素产量的方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵技术领域，特别涉及添加达托霉素合成关键酶辅因子以提
高达托霉素产量的方法。
背景技术：
病原菌对抗生素的普遍耐药性，是全球面临的严峻挑战，每年都有成百上千耐药 病原菌株出现。万古霉素曾经被公认为抗革兰氏阳性菌的最后一道防线，现在在国内外已 经发现了很多该药的抗性菌株。因此开发一种具有新型作用机理的能有效抑制耐药性病原 菌的新型抗生素，迫在眉睫。"玫瑰孢链霉菌"(拉丁名称为"Str印tomyces roseosporus")是一种链霉菌属 的放线菌，其生长指数增长后期到稳定期合成的达托霉素(英文名"d即tomycin")为N_癸 酰晒_色氨酰晒_天冬酰胺酰晒_天冬氨酰晒_苏氨酰甘氨酰晒_鸟氨酰晒-D-天冬氨酰 朌_丙氨酰晒_天冬氨酰甘氨酰朌_丝氨酰空hreo-3-甲基晒-谷氨酰？-丙氨酸e 1-内 酯，是由一个十碳烷侧链与一个环状P氨基酸肽链N-末端的色氨酸连接而成，是一种大环 内酯类新型抗生素。 达托霉素是一种钙离子依赖型的抗生素，在钙离子存在的条件下，达托霉素将以 非共价键的形式结合到细胞膜蛋白上，细胞膜上的达托霉素结合蛋白(DBPs)为其作用靶 位，达托霉素可扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的磷壁(酸)脂质 (LTA)的生物合成，改变细胞质膜的性质；另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容 物外泄而达到杀灭细菌的目的。也有报道是其与细胞膜的结合，导致膜电位的降低，从而破 坏胞内RNA和DNA的合成，最终抑制细菌生长。达托霉素由于独特的结构特征和作用机理， 对于耐药菌，如耐万古霉素的肠球菌(VRE)，耐甲氧西林的金葡菌(MRSA)，糖肽类敏感的金 葡菌(GISA)，凝固酶阴性的葡萄球菌(CNS)和耐青霉素的肺炎链球菌(PRSP)的感染具显著 的治疗效果。 2003年，达托霉素(D即tomycin，LY146032)成为第一个被美国FDA批准上市的首 个脂肽类抗生素。2006年1月，达托霉素再次获得了欧洲药品评价署(EMEA)在整个欧洲的 认证，从此它更加由于其能够从多个方面破坏细胞膜功能，并迅速杀死革兰氏阳性菌确切 疗效引起了人们普遍关注。尽管国内已经有生产达托霉素的菌种，以初步实现中试生产，但 是没有经过发酵优化，特别是没有添加达托霉素合成关键酶辅因子的，达托霉素的产量低， 生产成本很高。 在培养基添加优化的辅因子在发酵工艺优化技术中应用较广，其作用于相应的目 的代谢产物的合成途径中的关键酶，显著提高酶活，将代谢流更多的导向目的代谢产物。刘 立明等利用添加优化组合的浓度的硫酰氨(VB1)和生物素使代谢流从丙酮酸更多流向三 羧酸循环，使a-酮戊二酸得到极大的积累，浓度达到43.7g/L。李正军等将烟酰胺腺嘌 呤二核苷酸(NAD)激酶在大肠杆菌中过表达，以提高NADra在胞内水平，使聚三羟基丁酸 (PHB)的产量从7g/L提高到14g/L。而把辅因子用在达托霉素发酵培养基优化方面，还未
3见有相关文献和报道。
发明内容
本发明的目的是提出一种添加优化浓度的关键酶辅因子以提高达托霉素的产量，
依此法可以有效的提高达托霉素的产量。 本发明的目的是通过如下技术方案实现的 本发明的一种在发酵培养基中添加达托霉素合成关键酶辅因子提高达托霉素产 量的方法，在室温下取玫瑰孢链霉菌Str印tomyces reseosporus斜面孢子用无菌水制成 孢子悬液；然后用0. 5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中， 28°C 32°C，180 220rpm摇床中培养48小时；然后以1 %的接种量，加到装有发酵培养 基的自动7. 5LDE发酵罐中；添加0. 5 30毫克每升的辅因子亚铁血红素或甲酰四氢叶酸 或吡哆醛磷酸VB6的一种或其组合；在28°C 32。C，通气量控制0. 8 1. 2v/v/m，pH6. 5 7. 5发酵90 144小时。 所述的种子液体培养基组成及质量含量为糊精1 1. 5g，葡萄糖0. 2 0. 5g，蛋 白胨0. 3 0. 5g，酵母浸粉0. 2 0. 5g， K2HP04 3H200. 01 0. 05g， MgS04 7H20 0. 01
0. 05，CaC03 0. 01 0. 02g，溶解到1L蒸馏水中，初始pH 7.5。 发酵培养基组成及质量含量为葡萄糖0.6 1.0g，糊精2 4g，干酪素0.5
1. Og，花生饼粉0. 4 0. 6g， L-天冬素0. 8 1. 2g， K2S04 0 . 4 0. 6g，溶解到1L蒸馏水 中，初始pH7. 5。 本发明的优点在于利用添加达托霉素合成关键辅因子的方法来调节生物酶活，使 通向达托霉素合成的胞内代谢流增大，从而提高达托霉素产量，是基于玫瑰孢链霉菌代谢 网络指导下发酵培养基优化新技术。本法操作简单，成本低廉，较传统的培养基优化技术新 颖有效。依照此法发酵培养玫瑰孢链霉菌，达托霉素的发酵单位可比对照提高0. 24 4. 6 倍。
具体实施例方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明。
实施例1 在室温下取玫瑰孢链霉菌Str印tomycesreseosporus斜面孢子用无菌水制成孢 子悬液。然后用0. 5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中， 28°C， 180 220rpm摇床中培养48小时，其中种子液体培养基(组成及质量含量为糊精 1.5g，葡萄糖0.5g，蛋白胨0.5g，酵母浸粉0.5g， K2HP04* 3H20 0. 05g， MgS04 7H20 0.05， CaC030 . 02g，溶解到1L蒸馏水中，初始pH7. 5。)。然后以1%的接种量，自动7. 5LDE发酵罐 中。其中发酵培养基(组成为葡萄糖0.2g/L，糊精2g/L，干酪素0.5g/L，花生饼粉0.4g/ L，L-天冬素0. 8g/L，K2S040. 4g/L，初始pH 7. 5。)添加0. 5mg/L的吡哆醛磷酸(VB6)。然 后，在28°C ，通气量控制0. 8v/v/m， p朋.5的条件下，发酵120小时。通过HPLC监测发酵液中 的达托霉素浓度。达托霉素发酵单位由原来的120mg/L提高到了 149mg/L，提高了 24.6%。
实施例2 在室温下取玫瑰孢链霉菌Str印tomycesreseosporus斜面孢子用无菌水制成孢子悬液。然后去0. 5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中， 30°C，180 220rpm摇床中培养48小时。其中种子液体培养基(组成及质量含量为糊 精lg，葡萄糖0. 2g，蛋白胨0. 3g，酵母浸粉0. 2g， K2HP04 3H20 0. Olg， MgS04 7H20 0. Olg， CaC030. Olg，溶解到lL蒸馏水中，初始p朋.5。)然后以1%的接种量，自动7. 5LDE发酵罐中。 其中发酵培养基(组成为葡萄糖lg/L，糊精4g/L，干酪素lg/L，花生饼粉0. 6g/L，L-天冬 素1. 2g/L，K2S040. 6g/L，初始pH 7. 5。)添加30mg/L亚铁血红素(heme)。然后，在32°C， 通气量控制1. 2v/v/m， pH7. 5的条件下，发酵120小时。通过HPLC监测发酵液中的达托霉 素浓度。达托霉素发酵单位由原来的120mg/L提高到了 421mg/L，提高了 3. 5倍。
实施例3 在室温下取玫瑰孢链霉菌Str印tomycesreseosporus斜面孢子用无菌水制成孢 子悬液。然后去0. 5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中， 30°C， 180 220rpm摇床中培养48小时。其中种子液体培养基(组成及质量含量为糊精 1. 5g，葡萄糖0. 3g，蛋白胨0. 4g，酵母浸粉0. 35g， K2HP04 3H20 0. 03g， MgS04 7H200. 03g， CaC030 . 0 1 5g，溶解到1L蒸馏水中，初始pH7. 5。)然后以1%的接种量，自动7. 5LDE发酵罐 中。其中发酵培养基(组成为葡萄糖1. Og/L，糊精4g/L，干酪素1. Og/L，花生饼粉0. 6g/ L， L-天冬素1. 2g/L， K2S040 . 6g/L，初始pH 7. 5。)添加15mg/L甲酰四氢叶酸(MTHF)。然 后，在3(TC，通气量控制0.8 v/v/m，pH7.0的条件下，发酵90小时。通过HPLC监测发酵液 中的达托霉素浓度。达托霉素发酵单位由原来的120mg/L提高到了 236. 9mg/L，提高了 1. 97 倍。 实施例4 在室温下取玫瑰孢链霉菌Str印tomycesreseosporus斜面孢子用无菌水制成孢 子悬液。然后去0. 5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中， 30°C， 180 220rpm摇床中培养48小时。其中种子液体培养基(组成及质量含量为糊精 1. 3g，葡萄糖0. 3g，蛋白胨0. 4g，酵母浸粉0. 35g， K2HP04 3H20 0. 03g， MgS04 7H200. 03g， CaC030 . 0 1 5g，溶解到1L蒸馏水中，初始pH7. 5。)然后以1%的接种量，自动7. 5LDE发酵罐 中。其中发酵培养基(组成为葡萄糖O. 75g/L，糊精3g/L，干酪素1.0g/L，花生饼粉0. 5g/ L，L-天冬素lg/L，K2S040. 5g/L，初始pH 7. 5。)添加5mg/L甲酰四氢叶酸(MTHF)和15mg/ L亚铁血红素(heme)。然后，在30°C ，通气量控制1. Ov/v/m， pH7. 2的条件下，发酵144小 时。通过HPLC监测发酵液中的达托霉素浓度。达托霉素发酵单位由原来的120mg/L提高 到了 529. 8mg/L，提高了 4. 4倍。
实施例5 在室温下取玫瑰孢链霉菌Str印tomycesreseosporus斜面孢子用无菌水制成孢 子悬液。然后去0. 5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中， 30°C， 180 220rpm摇床中培养48小时。其中种子液体培养基(组成及质量含量为糊精 1.5g，葡萄糖0.5g，蛋白胨0.5g，酵母浸粉0.5g， K2HP04 3H20 0. 05g， MgS04 7H200. 05g， CaC030 . 02g，溶解到1L蒸馏水中，初始pH7. 5。)然后以1%的接种量，自动7. 5LDE发酵罐中。 其中发酵培养基(组成为葡萄糖0. 75g/L，糊精3g/L，干酪素1. Og/L，花生饼粉0. 5g/L， L-天冬素lg/L，K2S040. 5g/L，初始pH 7. 5。)添加15mg/L甲酰四氢叶酸(MTHF)和0. 5mg/ L的吡哆醛磷酸(VB6)。然后，在3(TC，通气量控制0. 9v/v/m， pH7. 0的条件下发酵120小时。通过HPLC监测发酵液中的达托霉素浓度。达托霉素发酵单位由原来的120mg/L提高到314mg/L，提高了 2.6倍。
实施例6 在室温下取玫瑰孢链霉菌Str印tomycesreseosporus斜面孢子用无菌水制成孢子悬液。然后去0. 5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中，3(TC，180 220rpm摇床中培养48小时。其中种子液体培养基(组成及质量含量为糊精1 1.5g，葡萄糖0. 3g，蛋白胨0.4g，酵母浸粉0. 35g， K2HP04* 3H20 0. 03g，MgS04 *7H200. 03g，CaC030. 015g，溶解到1L蒸馏水中，初始pH7. 5。)然后以1%的接种量，自动7. 5LDE发酵罐中。其中发酵培养基(组成为葡萄糖0. 75g/L，糊精3g/L，干酪素1. Og/L，花生饼粉0. 5g/L，L-天冬素lg/L，K2S040. 5g/L，初始pH 7. 5。)添加5mg/L甲酰四氢叶酸(MTHF) ， 15mg/L亚铁血红素(heme)和0. 5mg/L的吡眵醛磷酸(猫)。然后，在30。C，通气量控制0. 9v/v/m， p朋.5 7. 5的条件下，发酵144小时。通过HPLC监测发酵液中的达托霉素浓度。达托霉素发酵单位由原来的120mg/L提高到559mg/L，提高了 4. 65倍。
本发明并不局限于实例中所描述的技术，它的描述是说明性的，并非限制性的，本发明的权限由权利要求所限定，基于本技术领域人员依据本发明所能够变化、重组等方法得到的与本发明相关的技术，都在本发明的保护范围内。
权利要求
一种添加达托霉素合成关键酶辅因子以提高达托霉素产量的方法，其特征是在室温下取玫瑰孢链霉菌Streptomyces reseosporus斜面孢子用无菌水制成孢子悬液；然后用0.5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中，28℃～32℃，180～220rpm摇床中培养48小时；然后以1％的接种量，加到装有发酵培养基的自动7.5LDE发酵罐中；添加0.5～30毫克每升的辅因子亚铁血红素或甲酰四氢叶酸或吡哆醛磷酸VB6的一种或其组合；然后，28℃～32℃，通气量控制0.8～1.2v/v/m，pH6.5～7.5发酵90～144小时。
2. 如权利要求1所述的的方法，其特征是所述的种子液体培养基组成及质量含量为糊精1 1. 5g，葡萄糖0. 2 0. 5g，蛋白胨0. 3 0. 5g，酵母浸粉0. 2 0. 5g， K2HP04 *3H200.01 0. 05g，MgS04 7H20 0.01 0. 05， CaC030. 01 0.02g，溶解到1L蒸馏水中，初始pH7. 5。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征是所述的发酵培养基组成及质量含量为葡萄糖0. 6 1. 0g，糊精2 4g，干酪素0. 5 1. 0g，花生饼粉0. 4 0. 6g， L天冬素0. 8 1. 2g，K2S040. 4 0. 6g，溶解到1L蒸馏水中，初始pH7. 5。
全文摘要
本发明涉及添加达托霉素合成关键酶辅因子以提高达托霉素产量的方法。在室温下取玫瑰孢链霉菌Streptomycesreseosporus斜面孢子用无菌水制成孢子悬液；然后用0.5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中，28℃～32℃，180～220rpm摇床中培养48小时；然后以1％的接种量，加到装有发酵培养基的自动7.5LDE发酵罐中；添加0.5～30毫克每升的辅因子亚铁血红素或甲酰四氢叶酸或吡哆醛磷酸VB6的一种或其组合；在28℃～32℃，通气量控制0.8～1.2v/v/m，pH6.5～7.5发酵90～144小时。利用本发明的方法来调节生物酶活，使通向达托霉素合成的胞内代谢流增大，从而提高达托霉素产量，本方法操作简单，成本低廉，本发明的发酵培养玫瑰孢链霉菌，达托霉素的发酵单位可比对照提高0.24～4.6倍。
文档编号C12R1/465GK101724674SQ20101030005
公开日2010年6月9日 申请日期2010年1月6日 优先权日2010年1月6日
发明者宇光海, 贾晓强, 闻建平 申请人:天津大学