一种蝉拟青霉菌株及其应用的制作方法

专利名称：一种蝉拟青霉菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物领域，具体涉及一种蝉拟青霉菌株及其应用。
背景技术：
蝉花，别名虫花，是某些蝉若虫受蝉拟青霉菌寄生后的产物，是一种菌虫复合体。 此菌于1838年由Miquel定名为蝉棒束孢霉Isaria cicadae。此后出现多种同物异名。如蝉
Cordyceps cicadae,Isaria basili,5^ ^ Sphaeria sinclairii, 丛生虫壳菌Torrubia caespitosa,辛克莱虫草Cordyceps sinclairii,哈里棒束抱 Isariahariottii,小[Il单驾Cordyceps sobolifera,辛克莱棒束抱 Isaria sinclairii,蒙克苏棒束抱Isaria mokanshawii禾口多枝棒束抱Isaria arbuscula等等。蝉拟青霉的有性阶段被认为是大蝉草Cordyc印s cicadae，在自然界广为分布的是蝉拟青霉，大蝉草稀少。常采到的是蝉拟青霉及其寄主山蝉若虫寄生后的复合体。根据历史产区浙江的1467份样品的调查，药材蝉花主要是蝉拟青霉寄生后的虫菌复合体。蝉拟青霉属半知菌类真菌，其孢梗束自虫体头部长出，单生或丛聚成束，浅黄色，长1. 5 8. O厘米，前端膨大，呈纺锤形或呈鸡冠花状。蝉花含有多糖、腺苷、虫草酸、多种人体必需氨基酸、D-甘露醇、多种生物碱、麦角甾醇等活性成分，与冬虫夏草有相似的活性成分。传统中医认为蝉花具有疏散风热，透疹， 熄风止痉，名目退翳之功效，现代医学研究发现，蝉花具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、降血脂、降血压、明目、抗辐射、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮、改善肾功能等作用。野生冬虫夏草资源有限，多年来由于其身价昂贵，形成了滥采滥摘，给植被及生态环境带来严重破坏。鉴于蝉花与冬虫夏草有相似的活性成分，还有免疫调节、解热镇痛、改善肾功能、镇静催眠等多种药理作用，说明蝉花是一种具有应用前景广阔的药用虫生真菌， 可作食品、保健品、药品、化妆品等研究开发。

发明内容
本发明的目的在于提供一种蝉拟青霉菌株及其应用。本发明通过如下技术方案解决上述技术问题一种蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson]，该菌株已于 2009 年 11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)注册保藏，保藏号为 CGMCC No. ；3453。本发明的蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson]采用如下方法进行分离从云南三江源头采集纯净无污染野生蝉花标本，在净化工作台上用火焰灭菌过的移植镊从样本上取少量分生孢子于加入孟加拉红的PSA平板上置22°C -25°c下培养120h 后再挑取单菌落接入斜面培养基，在22°C _25°C下培养并经反复纯化即可得本发明所述的蝶拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson]。
本发明的蝉拟青霉菌株属于半知菌亚门Deuteromycotina，丝孢纲Hyphomycetes， 束梗孢目 Stilbellales，束梗孢科 Stilbellaceae，拟青霉属 Paecilomyces。本发明的蝉拟青霉菌株于2009年9月10日送交中国科学院生物研究所进行形态特征鉴定，鉴定结果为蝉拟青霉[Paecilomycescicadae (Miq. ) Samson]，其主要形态特征为在PDA培养基上25°C培养10天，菌落圆形，平展，初絮状，后粉状，白色至浅黄色， 背面浅黄色，直径5 6厘米。菌丝无色，分枝，具隔膜，宽1.2 2.5 μ m。分生孢子梗多分枝，宽3. 0 5. 5 μ m，由每轮2 5个产孢细胞组成轮状分枝。产孢细胞瓶形，基部球状膨大，向上变细窄，4. 5 6. 5 X 2. 5 3. 5 μ m。分生孢子圆柱形，单细胞，无色，平滑，链生，直或弯曲，6. 5 8. 8( 11. 0) X2. 5 3. 5 μ m。蝉拟青霉[Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson]，具有以下微生物学特征1、培养学的特征(1)置分生孢子于，1 %的C6H12O6溶液作载片培养，4h萌动，他出芽长菌丝，从分生孢子萌发开始到次代分生孢子产生需要36h ；(2)菌落在马铃薯-蔗糖-琼脂上，生长繁茂，温育14d，直径达60 72mm。 菌丝体灰白到浅黄，茸毛状。培养后期，因产生大量分生孢子，致使菌落外观显粉质状。菌落在蛋白胨-蔗糖-琼脂上生长佳，14d直径M 70mm，局部凸起或陷落，肉色，后期布满分生孢子，背面深褐色；(3)液体深层发酵合成培养基以Richard培养基(KNO3 IOgjKH2PO4 5g,MgSO4. 7H20 2. 5g，蔗糖 50g, FeCl3 0. 03g，水 1000ml)为佳；(4)温湿度 ①温度此菌生长起点温度6°C，最佳生长温度M ，但孢梗束生长期温度偏低，纯培养物经过40°C处理30h，50°C处理2. 5h后失活；②湿度在饱和湿度下，分生孢子萌发率24h为86%，96h为99%;RH 90%时，24h 萌发率为0%，％h为78. 3% ；RH 76%时，7 萌发率为0%，％h为18% ；(5) PH 此菌在PH 4 12范围均能正常生长，但PH 5 6菌丝体产量高，斜面培养菌落不易老化；(6)C、N源利用该菌能利用葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘露糖、甘油等碳源，但不利用菊糖、山梨糖、鼠李糖和乳糖。以葡萄糖做为碳源，分生孢子产量显著高于上述几种碳源， 用果糖做为碳源，菌丝体产量高于其他碳源。对硝基、亚硝基、氨基等9种无机N培养情况来看，此菌对KNO3利用好，而且利用硝基N比氨基N好，但不能利用NaNO2和硫脲。该菌对碳源要求量相当敏感。譬如，将碳源维持在2 %的正常生长发育水平上，提高N源或降低N 源对孢梗束生长和产孢量影响不大；但将N源固定在正常生长水平上，将碳源从2%降低到 0.5%，发现不产生孢梗束，或极少有孢梗束产生。反之，将碳源提高10倍(20%)，则孢梗束多而不易老化，但分生孢子产生较晚；(7)光该菌有明显趋光性，孢梗束生长朝向光源方向倾斜，暗培养菌丝生长旺， 仅产生菌核而不形成孢梗束。自然光和灯光均能刺激孢梗束生长和分生孢子形成；(8)此菌有强烈抗辐射现象，平板菌落离30Wt紫外光源0. 5m处照射^lh,移殖后未见失活，亦未见生长异常；
(9)固体发酵以小麦等谷物做培养基，接种量3% 5% (重量百分比)，接种后 3 5天，可见灰白色茸毛状菌丝体覆盖基质表面。20 25天形成菌核并长出与寄主体上相类似的孢梗束。孢梗束蛋黄色，直立、柱状或掌状分枝，20 30( 80) X3 5mm，通常 30天后产生大量分生孢子，嗣后孢梗束逐渐枯萎倒伏。2、蝉拟青霉菌种序列测定本发明所述蝉拟青霉菌株[Paecilomycescicadae (Miq. ) Samson]于 2009 年 9 月 11日送于中国科学院微生物研究所进行菌种鉴定，并收到检测鉴定报告O009)微检字第 249号，鉴定结果表明送检的菌种为蝉拟青霉[Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson]。本发明的蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae (Miq.) Samson]的18S rRNA基因序列如序列表中序列1所示；其ITSl基因序列如序列表中序列2所示；其5. 8S rRNA基因序列如序列表中序列3所示；其ITS2基因序列如序列表中序列4所示。本发明的蝉拟青霉菌株可以在上述培养基和培养条件下进行培养，具有易于培养、产量高的特点，其培养产物具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、降血脂、降血压、明目、抗辐射、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮、改善肾功能等功能，因此具有广泛的工业化应用价值。


图1 虫草多糖标准曲线图2:甘露醇标准曲线图3 腺苷虫草素校正曲线图
具体实施例方式下面通过具体实施例进一步描述本发明的技术方案。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1、蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson] CGMCC No. 3453 的分离1、按照如下配比制备培养基；马铃薯蔗糖琼脂培养基马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，水1000ml ；蛋白胨蔗糖琼脂培养基蛋白胨20g，蔗糖10g，琼脂20g，水1000ml。2、菌种分离从云南三江源头采集纯净无污染野生蝉花标本，在净化工作台上用火焰灭菌过的移植镊从样本上取少量分生孢子于加入孟加拉红的PSA平板上置22°C -25°C下培养120h 后再挑取单菌落接入斜面培养基，在22°C _25°C下培养并经反复纯化即可得本发明所述的蝶拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson]。3、菌种培养将蝉拟青霉菌株[Paecilomycescicadae (Miq. ) Samson] CGMCC No. !M53接于铃薯蔗糖琼脂培养基上，温育14天，直径达60 72mm，生长繁茂，培养初期，菌丝体灰白到浅黄，茸毛状；培养后期，因产生大量分生孢子，致使菌落外观显粉质状。将蝉拟青霉菌株[Paecilomycescicadae (Miq. ) Samson] CGMCC No. ；3453接于蛋白胨蔗糖琼脂培养基上，24°C温育14天，直径M 70mm，生长佳，局部凸起或陷落，肉色；后期布满分生孢子，背面深褐色。4、菌种序列测定按如下配比制备马铃薯蔗糖培养液马铃薯200g，蔗糖20g，水1000ml。将蝉拟青霉菌株[Paecilomycescicadae (Miq. ) Samson] CGMCC No. ；3453在马铃薯蔗糖培养液摇瓶培养3天(140rpm，M°C )，过滤收集菌丝体，加液氮研磨破碎，以氯化苄法提取菌种的总DNA。以总 DNA 为模板，参照文献《Eiji Yokoyama, Kenzo Yamagishi，Akira Hara, Development of a PCR—based mating—type assay for Clavicipitaceae, FEMS MicrobiologyLetters 237 (2004) 205-212》的方法扩增蝉拟青霉 ITS1-5. 8S_ITS2rDNA 区域。所用引物为Foreword primer :5，GTCATATGCTTGTCTCAAAG 和 Reverse primer 5，TTACTGGGGCAATCCCTGTT。PCR 反应体系(25 μ L)为2. 5 μ LlOXTaq 酶缓冲液，dNTP 各 200ymol/L, MgCl2 1. 5mmol/L，引物 0. 2ng, Taq 酶 1. 5U，模板 DNA20ng 1 μ g。扩增反应在PCR仪上的反应程序95°C预变性5分钟；95°C变性30秒，55°C退火 30秒，72 °C保持4分钟，共运行35个循环；72°C延伸10分钟。PCR反应完毕后，将凝胶电泳产物用凝胶回收试剂盒纯化回收对所得序列与 NCBI数据库进行序列比较分析，结果表明本发明所述菌种为蝉拟青霉[Paecilomyces cicadae(Miq. ) Samson]。实施例2 蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae (Miq.) Samson] CGMCC No. 3453 固体培养及成分分析菌种的固体培养(1)菌种制备实施例1所得菌种；(2)配料装盒配制固体培养基，将配好的培养基装入培养盒中，装料量为15%， 用封口膜封口 ；本实施方式所述的固体培养基配比为基质46重量份，甘蔗渣10重量份，贝壳粉0. 5重量份，蚕蛹粉5重量份，硝酸钾0. 5重量份，水为44重量份；其中基质为粟和蔗糖(以粟和蔗糖的总重量计，粟的重量百分比为98%，蔗糖的重量百分比为2%)。其制备方法为先将粟煮熟，将蔗糖、硝酸钾在水中溶解，再与甘蔗渣、贝壳粉、蚕蛹粉按照比例混合均勻。(3)灭菌将培养盒放入灭菌锅中，于0. 15MPa压力下灭菌30min ；(4)接种在固体培养基冷却至20°C以下后，在无菌条件下接种，每300ml —级种接80只培养盒；(5)固体发酵接种后的培养盒移至培养室在25°C，相对湿度80%下培养50天， 后期孢梗束生长阶段要求采光，且环境温度相较前期菌丝体生长阶段需低2 3°C，每天需适时开窗通气，保持培养室内空气新鲜；(6)采收当蝉花培养物的孢梗束高度达9cm左右、表面有少量分生孢子出现时即可采收；采收时，去掉封口膜，用工具将培养基培养物取出分离孢梗束，烘干分级，冷却后用薄膜袋真空包装，菌质置于-20°C贮存。一 多糖检测方法1实验原理
采用苯酚硫酸比色法对样品多糖进行检测。其原理是多糖类在浓硫酸作用下先水解成单糖分子，并迅速脱水生成糖醛衍生物，糖醛衍生物再与酚性物质如苯酚反应生成有色化合物，在波长490nm处有最大吸收，且满足朗伯-比尔定律，通过检测样品在该波长下的吸光值，即可算出样品中多糖的含量。2仪器与材料2. 1主要仪器紫外可见分光光度计；电子天平；可调式封闭电炉；离心机H-1650。2. 2实验试剂无水葡萄糖(AR)；苯酚(AR)；浓硫酸(AR)；屈臣氏蒸馏水。试剂配制5%苯酚溶液精确称取5g苯酚，用水定容至100ml。葡萄糖标准液配制配制浓度为0. 25mg/mL的葡萄糖标准液，精确称取0. 2500g烘干后的葡萄糖，加水定容至1000mL。2. 3材料实施例3的培养产物天然蝉花(产自云南)3实验方法3. 1样品粗多糖提取液的制备精确称取Ig样品置于干燥的500ml锥形瓶内，称量瓶与样品的总质量记为ml，向三角瓶中加入沸腾蒸馏水约70ml，放置于电炉之上使其持续沸腾15min后，迅速放于冷水中冷却至室温，取出，擦干瓶外壁的水珠后，向其中加入蒸馏水至最终质量为ml+100g，加水完毕之后摇勻，过滤，接取过滤液，稀释2倍备用，即为待测样品，-20°C保存。3. 2样品粗多糖的测定3. 2. 1标准曲线的绘制精密称取无水葡糖0. 2500g，用蒸馏水配制成0. 25mg/ml 的葡萄糖标准品溶液，吸取葡萄糖标准液0、0. 1,0. 3,0. 5,0. 7,0. 9、1. 1ml，分别置于具塞试管中，各加蒸馏水，使体积为2. 0ml，再加5%苯酚溶液1ml，摇勻，迅速滴加98%硫酸5ml， 摇勻后放置5分钟，置沸水浴中加热15分钟，取出冷水冷却至室温；另加蒸馏水anl，同上操作做空白对照，于490nm处测定吸光值(Abs)。以标准品葡萄糖浓度(mg/ml)为横坐标， Abs为纵坐标，得回归方程Y = 0. 6622Χ+0. 0088，R2 = 0. 9997，说明标准品葡萄糖量在0 2. 75mg/ml范围内，与Abs呈良好的线性关系。3. 2. 2实验数据处理
ax CXVX(SniL) _ M= WX(0.1nC)M 多糖含量(mg/g) ；a 稀释倍数；C 待测液多糖浓度(mg/mL)；V 体积(mL) ；W 样品质量(g)二 甘露醇检测方法1实验原理利用多元醇化合物甘露醇成分与高碘酸钠及Nash试剂产生的显色反应，测定样品中甘露醇的含量。2仪器与材料2. 1主要仪器紫外可见分光光度计；电子天平；离心机H-1650 ；电热恒温水箱 ⑶600型；可调式封闭电炉。2. 2实验试剂甘露醇标准品；醋酸铵、乙酰丙酮、冰醋酸、高碘酸钾、L-鼠李糖。试剂配制高碘酸钾溶液15mmol (即3. 45g)高碘酸钾溶于IL 0. 12mol/L盐酸溶液中。
Nash试剂150g醋酸铵+2mL冰醋酸+2mL乙酰丙酮，用蒸馏水稀释至IL (现用现配)。L-鼠李糖溶液L-鼠李糖lOOmg，用蒸馏水定容至lOOmL。2. 3实验材料实施例3的培养产物天然蝉花(产自云南)3实验方法3. 1样品甘露醇提取液的制备精确称取Ig样品置于干燥的500ml锥形瓶内，称量瓶与样品的总质量记为ml，向三角瓶中加入沸腾蒸馏水约70ml，放置于电炉之上使其持续沸腾15min后，迅速放于冷水中冷却至室温，取出，擦干瓶外壁的水珠后，向其中加入蒸馏水至最终质量为ml+100g，加水完毕之后摇勻，过滤，接取过滤液，即为待测样品，-20°C保存。3. 2样品甘露醇的测定3. 2. 1标准溶液的配制精密称取D-甘露醇标准品0. Ig于烧杯中，加少量蒸馏水溶解完全，转移至IOOml容量瓶中定容，配制成lmg/ml的甘露醇溶液，进行稀释后，得到质量浓度分别为10、50、90、130、170mg/L的甘露醇标准溶液。取上述浓度标准品甘露醇溶液各lmL，分置不同试管中，然后分别加ImL高碘酸钠溶液，混勻，室温放置lOmin，加2mL0. 1 % L-鼠李糖溶液以除去过多的高碘酸盐，振荡混勻，加4mL新鲜配制的Nash试剂，53°C水浴加热15min使其显色，快速冷却至室温，在412nm波长处测定其吸光度。以蒸馏水代替甘露醇标准溶液，用同样的方法操作作为对照，测定其吸光度。以标准液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。以标准品甘露醇浓度(mg/ml)为横坐标，Abs为纵坐标，得回归方程=Y = 0. 0826Χ+0. 0019，R2 = 0. 9998，说明标准品甘露醇量在O 21. 25mg/L范围内，与 Abs呈良好的线性关系。3. 2. 2实验数据处理
aXCX VX(SiiiL)M=-
WX(IniL)M 甘露醇含量(mg/g) ；a 稀释倍数；C 待测液甘露醇浓度(mg/mL)；V 提取溶液体积(mL) ；W 测试样品量(g)三腺苷含量测定方法1仪器与试剂11 仪器
Waters 1525 Binary HPLC Pump ；Waters 2998 Photodiode Aarry Detector ；超声波清洗仪SB25-12DT，宁波新芝生物科技股份有限公司；电子天平AL104型，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；二两装高速万能粉碎机QE-100克，浙江屹立工贸有限公司；Simplicity, Millipore ；针筒式过滤器0. 22 μ m，Pall。1.2 试剂腺苷068K0691，Sigma ；
虫草素2007914，Sigma ；乙腈 HPLC, Lot 100606，Fisher ；甲醇 HPLC，Lot096964, Fisher ；石油醚AR级，60_90°C，国药集团化学试剂有限公司；磷酸二氢钾AR，10017618，国药集团化学试剂有限公司；屈臣氏蒸馏水，广州屈臣氏食品饮料有限公司。1.3样品实施例3的培养产物天然蝉花(产自云南)2 方法2.1色谱条件色谱柱XBridgeC18 色谱柱(Waters，4. 6mmX 250mm，5 μ m)；流动相乙腈-0.04mol/L磷酸二氢钾(5 95)；流速1. OmL/min ；检测波长260nm;柱温35°C;进样量20μ L。2. 2腺苷虫草素标准曲线绘制精密称取50mg腺苷对照品，置50mL容量瓶中，加超纯水溶解并稀释至刻度制成 lmg/mL溶液。精密移取适量lmg/mL腺苷对照品溶液，分别配制成1、5、10、30、50、100 μ g/ mL的腺苷标准液，备用。2. 3供试品溶液的制备取约1. Og样品粉末，精密称定，置具塞IOOmL具塞锥形瓶中，加石油醚 (60-900C ) IOmL,密塞，超声30分钟，滤过，弃去石油醚，取药渣挥干，连同滤纸一并置具塞瓶中，在瓶中加入20mL超纯水，称总重(包括锥形瓶重量)，超声30min。快速冷却后称重， 以超纯水补至总重，混勻后离心，取上清液，过0. 22 μ m微孔滤膜，备用。2. 4标准曲线绘制将对照品1 μ g/mL、5 μ g/mL、10 μ g/mL、30 μ g/mL、50 μ g/mL、100 μ g/mL 溶液进样，按2. 1项下色谱条件测定，以样品浓度(μ g/mL)为横坐标，峰面积(微伏 秒)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y = 7. 08e+004x-l. 05e+004, R2 = 0. 999978，在1 100 μ g/mL与峰面积线性关系良好。2. 5供试品腺苷含量测定取2. 3项下制备的供试品溶液，与超纯水以2 1的比例混合，制成待测液。取待测液按2. 1项下色谱条件进样，由回归方程得待测液腺苷浓度χ( μ g/mL)，根据下列公式得到供试品腺苷含量(mg/g)。
权利要求
1.一种蝉拟青霉菌株 Paecilomyces cicadae (Miq.) Samson CGMCC No. 3453。
2.蝉拟青霉菌株Paecilomyces cicadae (Miq.) Samson CGMCC No. 3453 在食品、保健品、药品和化妆品制备中的应用。
全文摘要
本发明属于微生物领域，具体涉及一种蝉拟青霉菌株及其应用。本发明所提供的是蝉拟青霉菌株[Paecilomycescicadae(Miq.)Samson]CGMCCNo.3453。本发明的蝉拟青霉菌株[Paecilomycescicadae(Miq.)Samson]CGMCCNo.3453具有易于培养、产量高的特点，其培养产物具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、降血脂、降血压、明目、抗辐射、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮、改善肾功能等功效，因此具有广泛的工业化应用价值。
文档编号A61P9/12GK102242069SQ20111012060
公开日2011年11月16日 申请日期2011年5月11日 优先权日2010年5月14日
发明者孙长胜, 李成, 赵伟, 陈祝安 申请人:浙江泛亚生物医药股份有限公司