一种富硒蝉花孢子粉的培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种富硒蝉花孢子粉的培养方法。首先从野外采集的蝉花上分离纯化鉴定得到蝉拟青霉菌，平板培养得到单菌落，再转接至液体培养基进行培养，得到液体二级种子液，再转接于含有机硒肥的复合培养基上，控制温度15～35℃、控制湿度60～90%，通风培养4～6周，采收得到富硒蝉花孢子粉。本发明人工模拟最接近蝉花野生环境所需要的营养及生长条件，使蝉花的生长不受季节变化的限制，复合培养基更接近天然竹林的蝉花野生环境，透气性好、吸水性及保湿性能优越，子实体生长快速，子实体孢子头部孢子粉丰富、粗壮饱满，孢子粉量大，质优，硒含量20～100mg/Kg，且易于采收，方法简单，成本低，孢子收获期短，可产业化生产。
【专利说明】
_种富砸蜂花孢子粉的培养方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种富砸蝉花孢子粉的培养方法。
【背景技术】
[0002]蝉花，是麦角菌科蝉草属真菌大蝉草的蝉拟青霉寄生在蝉若虫上形成的虫菌复合体，具有丰富的营养及活性成分。文献古籍记载蝉花具有散风热、镇惊、明目之功效，注治少儿天吊、夜啼心悸，祛风止痉，麻疹、目赤、多泪。药用部位是蝉花全株。蝉花由菌核、孢梗束和孢子粉三部分构成，文献药理研究报道及临床经验绝大部分均全株入药或研究。据现代药理研究发现，蝉花主要有免疫调节作用、抗肿瘤作用、镇痛安眠缓解精神压力、促进血液红细胞再生改善血液环境状态、滋补肾亏肾虚、改善糖尿病性视网膜病变等多种药理作用等。临床药理学家顾振纶教授利用蝉花孢子展开了抗肿瘤的药理实验研究，并发现蝉花孢子粉对胰腺癌、白血病、宫颈癌、胃癌、胶质瘤、回盲肠癌等9种肿瘤细胞有极强的杀伤作用，并对肿瘤细胞有选择性的杀灭作用，对正常体细胞并无明显伤害。最新的报道蝉花孢子粉在临床治疗中晚期的胰腺癌及肺癌两种重大病症，使得中晚期的肿瘤患者的不适症消失，临床方面取得治疗明显的康复前景。因此，开展对蝉花孢子的人工培养对药理临床的研究，为开发新一代高效抗肿瘤药物提供新药的资源，造福人群。
[0003]蝉花在我这主要分布于安徽、浙江、湖北、云南等省份。在民间，其药用价值已得到普遍的认可。但鉴于蝉花孢子的特殊环境，野生蝉花的孢子的大量收集存在一定的难度，并且绝大部分在采收时孢子几乎损失殆尽，因此孢子的药用价值未能完全体现。野生蝉花孢子粉的特效药理活性及其资源的稀缺性和季节性，远远不能满足市场的要求。
[0004]因此，研发探索蝉花及其孢子粉的人工培养技术具有重要的研究和应用价值。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是克服现有蝉花利用不足以及蝉花孢子粉人工培育技术的缺陷，提供一种利用真菌蝉拟青霉、含有机砸肥的复合培养基进行人工培养蝉花并得到富砸蝉花孢子粉的方法，该方法利用野生蝉花生长的环境，人工模拟最接近野生环境所需要的营养及生长条件，使蝉花的生长不受季节变化的限制，该方法简单并易于规模化培养和采收，蝉花富砸孢子粉的采收量远远高于野生蝉花孢子粉。
[0006]本发明的目的是提供一种富砸蝉花孢子粉的培养方法。
[0007]本发明另一目的是提供由上述方法培养得到的富砸蝉花孢子粉。
[0008]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
一种富砸蝉花孢子粉的培养方法，是从野生蝉花上分离纯化蝉拟青霉菌，以此蝉拟青霉菌在含有机砸肥的复合培养基上进行培养，采收得到富砸蝉花孢子粉。
[0009]具体优选地，所述富砸蝉花孢子粉的培养方法，包括如下步骤:
51.分离蝉拟青霉:从野外采集的蝉花上分离纯化鉴定得到蝉拟青霉菌；
52.制备二级种子液:将SI所述蝉拟青霉菌的单菌落转接至液体培养基进行培养，得到液体二级种子液；
S3.无菌条件下，将二级种子液接于含有机砸肥的复合培养基上，长出菌蕾后，控制温度为15?35°C、湿度控制为60?90%，通风培养4?6周(15?35°C培养2?3周为蝉花子实体生长较旺盛时期，继续生长2?3周即收获得到富砸蝉花孢子粉)，直至子实体成熟后采收孢子，采收得到富砸蝉花孢子粉。
[0010]其中，优选地，步骤SI所述蝉拟青霉菌的分离方法为平板培养法:在无菌条件下，将采集的蝉花标本切片，接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基(可分离纯化野生蝉花上的蝉拟青霉分生孢子)，置25?30°C连续培养3?10天;待长出菌落后，对菌落进行分离，纯培养，鉴定，反复多次分离、纯培养，得到纯的蝉拟青霉菌。
[0011]更优选地，所述切片是切成I?2cm的方块。
[0012]更优选地，所述平板培养法中，所述连续培养是28°C连续培养5?10天。
[0013]另外，优选地，步骤S2所述液体培养基为液体PDA培养基。
[0014]所述液体PDA培养基的配方为:200g/L土豆液、30g/L葡萄糖，水补足。
[0015]优选地，步骤S2所述培养的条件为28°C、转速100?140转/分钟，培养2?5天。
[0016]优选地，所述含有机砸肥的复合培养基由以下质量份的组分组成:纤维类培养物与谷物类培养物混合物40?60份，葡萄糖5?10份，蛋白胨I?5份、K2HPO4 0.1?0.3份，MgSO4 0.0I?0.03份，有机砸肥0.0I?0.1份和水70?110份;其中，所述纤维类培养物为竹纤维、小麦/大麦纤维、荞麦纤维、秸杆纤维、苷蔗纤维、燕麦纤维、高梁纤维、稻谷纤维或青稞纤维等中的一种或几种;所述谷物类培养物为马铃薯切片、黄豆粗粉、玉米粗粉、小麦粗粉、大麦粗粉、麸皮、高梁粗粉、小米、大米粗粉或青稞粗粉等中的一种或几种。
[0017]更优选地，纤维类培养物:谷物类培养物=1?4:1?4。即所述纤维类培养物与谷物类培养物混合物中两者的质量百分含量分别为20%?80%、20%?80%。
[0018]另外，更优选地，所述含有机砸肥的复合培养基在使用前，需要按比例与水混合后高温高压灭菌，复合培养基:水=4?6:7?11。
[0019]所述含有机砸肥的复合培养基在使用前，需要经过检测保证重金属含量低，并10?20目筛网过筛，清洗后灭菌使用。
[0020]另外，优选地，步骤S3所述控温是通过采用100?600LUX光照8?12小时实现。
[0021 ] 更优选地，所述光照为100?400LUX光照。
[0022]更优选地，步骤S3所述通风培养的时间为35?40天。
[0023]在本发明的培养方法中，蝉花孢子生长期为35?40天，平均每50克含有机砸肥的复合培养基可收获2.0?4.0克孢子粉，有机砸含量为20?100mg/Kg。
[0024]值得强调注意的是:在步骤S3的蝉花及其孢子粉培养过程，需要始终控制温度15?35°C、湿度60?90%(通过光照强度100?600LUX光照时间8?12小时实现)，直至孢子粉采收为止。
[0025]另外，利用上述培养方法培养得到的富砸蝉花孢子粉，以及所述富砸蝉花孢子粉在制备药物或保健品中的应用，也都在本发明的保护范围之内。
[0026]本发明利用野生蝉花生长的环境，人工模拟最接近野生环境所需要的营养及生长条件，使蝉花的生长不受季节变化的限制，该方法简单并易于规模化培养和采收，富砸蝉花孢子粉的采收量远远高于野生蝉花孢子粉。
[0027]而且，本发明在培养蝉花时添加有机砸肥在培养基质当中，使得蝉花在生长过程中吸收有机砸肥达到蝉花孢子也富含砸元素的效果。砸能有效防治地方性克山病，人们逐步发现砸与人和动物的几十种疾病相关，还具有抗癌、防衰老、保护人体免疫功能等作用。砸作为微量元素，量虽小，但在人体生理进程中对某些酶活性起重要作用，包括我国在内的世界40多个国家处于缺砸状态，1973年世界卫生组织将砸定为人和动物必需营养元素之一。因此，本发明的富砸蝉花孢子粉在相关的药物和保健品的应用、制备方面具有很好的应用前景。
[0028]本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种富砸蝉花孢子粉的培养方法，利用野生蝉花生长的环境，人工模拟最接近野生环境所需要的营养及生长条件，使蝉花的生长不受季节变化的限制，该方法简单并易于规模化培养和采收，蝉花富砸孢子粉的采收量远远高于野生蝉花孢子粉。
[0029]而且，产富砸蝉花孢子粉培养基选择了复合培养基，更接近天然竹林的蝉花野生环境，经复合培养基所产生的子实体生长快速，子实体孢子头部孢子粉丰富，饱满。该复合培养基具有天然纤维，透气性及吸水性保持持久，是蝉花生长的良好介质，也便于采收。所用复合培养基经检测重金属含量低，筛网过筛，清洗后灭菌使用。在蝉花生长阶段采用了控制温度，湿度，光照强度等，完全模拟了野外生长的环境。
[0030]本发明方法培养25天左右可收获子实体，35天左右可收获孢子粉，子实体末端的孢子粗壮饱满，孢子粉量大，质优，砸含量20?100 mg/Kg。本发明复合培养基配方透气性好、吸水性及保湿性能优越，更好的接近野生环境中的生长介质，亦易于采收，方法简单，生产成本低，孢子收获期短，可产业化生产。
【附图说明】
[0031]图1为蝉花在含有机砸肥的复合培养基中生长20天的生长情况。
[0032]图2为蝉花在含有机砸肥的复合培养基中生长35?40天富砸蝉花孢子粉丰产情况。
【具体实施方式】
[0033]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0034]除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
[0035]实施例1富砸蝉花孢子粉的培养
1、一种富砸蝉花孢子粉的培养方法，包括如下步骤:
(I)分离蝉拟青霉:
从野外采集蝉花，在无菌条件下，将采集的蝉花标本切片为I?2cm的方块，接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基(可分离纯化野生蝉花上的蝉拟青霉分生孢子)，置28°C连续培养10天;待长出菌落后，对菌落进行分离，纯培养，鉴定，反复多次分离、纯培养，得到纯的蝉拟青霉菌。
[0036](2)制备二级种子液: 将上述分离的蝉拟青霉菌的单菌落转接至液体培养基，28 °C、摇床转速10?140转/分钟培养2?5天，得到液体二级种子液；
其中，所述液体培养基为液体PDA培养基，配方为:200g/L土豆液、30g/L葡萄糖，水补足
IL0
[0037](3)孢子粉培养:
I)首先配制含有机砸肥的复合培养基:
所述含有机砸肥的复合培养基由以下质量份的组分组成:纤维类培养物与谷物类培养物混合物40?60份，葡萄糖5?1份，蛋白胨I?5份、K2HPO4 0.1?0.3份，MgSO4 0.01?0.03份，有机砸肥0.01?0.1份和水70?110份；
其中，所述纤维类培养物为竹纤维、小麦/大麦纤维、荞麦纤维、秸杆纤维、苷蔗纤维、燕麦纤维、高梁纤维、稻谷纤维或青稞纤维等中的一种或几种;所述谷物类培养物为马铃薯切片、黄豆粗粉、玉米粗粉、小麦粗粉、大麦粗粉、麸皮、高梁粗粉、小米、大米粗粉或青稞粗粉等中的一种或几种。
[0038]而且，纤维类培养物:谷物类培养物=1?4:1?4。即所述纤维类培养物与谷物类培养物混合物中两者的质量百分含量分别为20%?80%、20%?80%
所述含有机砸肥的复合培养基在使用前，需要经过检测保证重金属含量低，并10?20目筛网过筛，按比例与水混合后高温高压灭菌后使用;所述复合培养基:水=4?6:7?11。
[0039]2)培养
无菌条件下，将二级种子液接于含有机砸肥的复合培养基上，长出菌蕾后，采用100?600LUX光照8?12小时，控制温度为15?35°C，并湿度控制为60?90%，通风培养35?40天，直至子实体成熟后采收孢子，采收得到富砸蝉花孢子粉。
[0040]在本发明的培养方法中，蝉花孢子生长期为35?40天，15?35°C培养2?3周为蝉花子实体生长较旺盛时期，继续生长2?3周即收获得到富砸蝉花孢子粉。
[0041]值得强调注意的是:在蝉花及其孢子粉培养过程，需要始终控制温度15?35°C、湿度60?90%(通过光照强度100?600LUX光照时间8?12小时实现)，直至孢子粉采收为止。
[0042]2、结果
经过测定统计，结果显示，平均每50克含有机砸肥的复合培养基可收获2.0?4.0克孢子粉，有机砸含量为20?100mg/Kg。
[0043]3、另外，针对上述从野生蝉花上分离纯化蝉拟青霉菌，再以此蝉拟青霉菌在含有机砸肥的复合培养基上进行培养，采收得到富砸蝉花孢子粉的方法，发明人经过了大量的重复试验验证，结果显示，该方法的稳定性好，可重复性高，适合大规模生产应用。
【主权项】
1.一种富砸蝉花孢子粉的培养方法，其特征在于，是从野生蝉花上分离纯化蝉拟青霉菌，以此蝉拟青霉菌在含有机砸肥的复合培养基上进行培养，采收得到富砸蝉花孢子粉。2.根据权利要求1所述富砸蝉花孢子粉的培养方法，其特征在于，包括如下步骤: 51.分离蝉拟青霉:从野外采集的蝉花上分离纯化鉴定得到蝉拟青霉菌； 52.制备二级种子液:将SI所述蝉拟青霉菌的单菌落转接至液体培养基进行培养，得到液体二级种子液； 53.将二级种子液接于含有机砸肥的复合培养基上，长出菌蕾后，控制温度15?35°C、控制湿度60?90%，通风培养4?6周，采收得到富砸蝉花孢子粉。3.根据权利要求2所述的富砸蝉花孢子粉的培养方法，其特征在于，步骤SI所述蝉拟青霉菌的分离方法为平板培养法:在无菌条件下，将采集的蝉花标本切片，接种于固体PDA培养基，置25?30 °(:连续培养3?10天;待长出菌落后，对菌落进行分离，纯培养，鉴定，反复多次分离、纯培养，得到纯的蝉拟青霉菌。4.根据权利要求2所述的富砸蝉花孢子粉的培养方法，其特征在于，步骤S2所述液体培养基为液体PDA培养基;所述培养的条件为28°C、转速100?140转/分钟，培养2?5天。5.根据权利要求2所述的富砸蝉花孢子粉的培养方法，其特征在于，步骤S3所述含有机砸肥的复合培养基由以下质量份的组分组成:纤维类培养物与谷物类培养物混合物40?60份，葡萄糖5?10份，蛋白胨I?5份、K2HPO4 0.I?0.3份，MgSO4 0.01?0.03份，有机砸肥0.01?0.1份和水70?110份;其中，所述纤维类培养物为竹纤维、小麦/大麦纤维、荞麦纤维、秸杆纤维、苷蔗纤维、燕麦纤维、高梁纤维、稻谷纤维或青稞纤维中的一种或几种;所述谷物类培养物为马铃薯切片、黄豆粗粉、玉米粗粉、小麦粗粉、大麦粗粉、麸皮、高梁粗粉、小米、大米粗粉或青稞粗粉中的一种或几种。6.根据权利要求5所述的富砸蝉花孢子粉的培养方法，其特征在于，纤维类培养物:谷物类培养物=1?4:1?4。7.根据权利要求5所述的富砸蝉花孢子粉的培养方法，其特征在于，所述含有机砸肥的复合培养基在使用前，需要按比例与水混合后灭菌;复合培养基:水=4?6:7?11。8.根据权利要求2所述的富砸蝉花孢子粉的培养方法，其特征在于，步骤S3所述控温是通过采用100?600LUX光照8?12小时实现。9.利用权利要求1?8任一所述培养方法培养得到的富砸蝉花孢子粉。10.权利要求9所述富砸蝉花孢子粉在制备药物或保健品中的应用。
【文档编号】A01G1/04GK106069195SQ201610491471
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】黄锡山, 潘亚宏, 佘志刚, 梅秀丽, 李闯彪
【申请人】中山大学