金蝉花多糖及其在制备神经保护和抗衰老药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及金蝉花多糖及其在制备神经保护和抗衰老药物中的应用。所述金蝉花多糖按照下述方法获得：干燥金蝉花药材，粉碎过药典2号筛，粉末在90℃下用水回流提取两次，每次2小时，提取液减压浓缩后，加无水乙醇，4℃一25℃下过夜沉淀；3000r/min离心10一30min；干燥沉淀部分得金蝉花多糖(JCHCPS)。所得金蝉花多糖可明显抑制谷氨酸诱导的PC12细胞的衰老损伤，阻止细胞LDH释放，提高细胞的存活率，能降低细胞内的氧自由基水平，提高谷胱甘肽还原酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，并且在清除DPPH·和超氧阴离子(O2·-)自由基实验中表现出较好的体外抗氧化活性。
【专利说明】金蝉花多糖及其在制备神经保护和抗衰老药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医药【技术领域】，具体涉及从中药材金蝉花中制备具有神经保护和抗衰老活性的部位及在制备神经保护和抗衰老药物方面的应用。
【背景技术】
[0002]随着我国人口老龄化加剧，神经退行性疾病的发病率日益增高，衰老与神经退行性疾病的研究已成为神经科学的热点。人体的衰老，往往会导致加快神经细胞数目的减少，从而产生一些以阿尔茨海默病(Alzheimer’ s Disease, AD)为代表的神经退行性疾病。目前，神经退行性疾病，病因不明，而且尚无有效的治疗措施，仅有少数几个药物可用于治疗神经退行性疾病。
[0003]金蝶花为麦角菌科真菌大蝶草(Cordyceps cicadae Shing)及其寄主山蝶(Cicada flammata Dist)若虫形成的干燥复合体,其性味甘寒，与冬虫夏草的无性型同属，功效相近。甄权所著《药性论》云:“其蜕壳，头上有一角，如冠状，谓之蝉花，最佳。味甘寒，无毒。主小儿天吊,惊痫瘈,夜啼心悸。《证类本草》蝉花能解痉、散风热”。《本草图经》曾有记载:“今蜀中有一种蝉，其蜕壳上有一角，如花冠状，谓之蝉花。西人有赍至都下者，医工云，入药最奇”。《本草纲目》中亦记载:“蝉花可治疗惊痫 ，夜啼心悸，功同蝉蜕”。现代药理研究表明，金蝉花为传统的补益中药，具有明显的抗衰老、免疫调节、改善肾功能、抗肿瘤等药理活性。近年来研究发现，金蝉花中主要含有多糖、腺苷、虫草酸、氨基酸、多球壳菌素、麦角甾醇等多种化学成分。
[0004]蝉花水煎剂能明显延长实验小鼠的游泳时间，明显提高常压缺氧状态下的存活时间及在高温下的存活时间，表明蝉花水煎剂有抗应激、抗疲劳的作用；机体处在不良环境下，蝉花水煎剂能促进内环境保持相对稳定，从而增强了机体对有害刺激的抵抗力。蝉花水煎剂高剂量组对雄性果蝇能显著地延长寿命，表明其有一定的抗衰老作用(王砚，等.蝉花药理作用的初步探讨[J].浙江中医杂志，2001,36(5):219-220)。金蝉花总多糖能促进造血和免疫功能，减轻老龄大鼠体内脂质过氧化物含量，与抗衰老有关(杨介钻，等.蝉拟青霉多糖抗衰老作用的实验研究[J].中国老年学杂志，2004，24(4) =343-344.)
[0005]鉴于蝉花和名贵中药冬虫夏草的无性型同属真菌(虫草属)，且蝉拟青霉有免疫等多种药理作用，并具有毒性小、易培养等优点，有希望作为冬虫夏草的代用品，但对其相应的活性功能成分尚未十分明确，大多的药理实验仅停留在原药材或粗提物的基础上，尚无金蝉花提取物进一步精制至活性部位并用于制备神经保护和抗衰老药物的报道。
[0006]为了测试和评估本发明金蝉花活性部位的神经保护和抗衰老方面的应用潜力，已使用本领域技术人员所熟悉的方法测试药材各部位的生物活性。这些已知的测试方法包括谷氨酸损伤神经细胞PC12衰老模型，抗氧化模型等。结果表明选定的金蝉花多糖活性部位具有较好的神经保护和抗衰老的活性。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供金蝉花具有神经保护和抗衰老活性应用潜力的有效部位。
[0008]金蝉花提取物的各部位经过反复多次的神经保护和抗衰老活性筛选，确认金蝉花水提物的多糖部位具有可明显抑制谷氨酸诱导的PC12细胞的衰老损伤，阻止细胞LDH释放，提高细胞的存活率，能降低细胞内的氧自由基水平，提高谷胱甘肽还原酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，显示出良好的神经保护和抗衰老活性，并且在清除DPPH.和超氧阴离子(02‘_)自由基实验中表现出较好的体外抗氧化活性，表明金蝉花的多糖部位具有良好的抗氧化作用，具有抗衰老的潜力。
[0009]因此，本发明的第一个方面涉及提供金蝉花多糖活性部位及其制备方法:金蝉花多糖制备方法，按照下述步骤进行:干燥金蝉花药材，粉碎过药典2号筛，粉末在90°C下用水回流提取两次，每次2小时，提取液减压浓缩后，加无水乙醇，4°C一 25°C下过夜沉淀；3000r/min离心10 — 30min ;干燥沉淀部分得金蝶花多糖(JCHcps)。
[0010]本发明第二个方面涉及对所述金蝉花多糖活性部位用于制备神经保护和抗衰老药物的用途。
[0011]为了检测本发明所得的神经保护和抗衰老活性组分的性能，将本发明所得的神经保护和抗衰老活性组分按照配制成50~200 μ g/ml药液，用于大鼠肾上腺嗜铬细胞的PC12细胞处理，分别观察样品在不同剂量下对谷氨酸诱导的PC12细胞衰老的保护作用。结果表明金蝉花多糖活性部位具有显著的神经保护和抗衰老活性，可用于制备治疗神经退行性疾病等疾病的辅助药物；同时在体外模型中具有显著的抗氧化活性，表明金蝉花多糖活性部位在制备抗衰老药物方面具有良好的潜力。
[0012]本发明第三个方面涉及提供金蝉花活性部位与药学上可接受的辅料组成的药物组合物。
[0013]金蝉花活性部位可单独或几种部位组合，再进一步与辅料组合，剂型包括:片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂等。
[0014]本发明所述的载体或赋形剂包括药剂学常规应用的载体和赋形剂，例如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂、粘合剂等。
[0015]下面的实施例和药理活性实验是对本发明的进一步详细说明，以下所列举的实施例不以任何方式构成限制。
【具体实施方式】
[0016]实施例1金蝉花多糖(JCHcps)的制备:
[0017]取粉碎过药典2号筛干燥金蝉花粉末80g，在90°C下，用800mL水回流提取两次，每次2小时，提取液减压浓缩后，加4倍体积的无水乙醇，置4°C冰箱过夜沉淀；3000r/min离心15min ;干燥沉淀部分得JCHepJ.02g。
[0018]实施例2JCHePS对谷氨酸诱导的PC12细胞衰老的保护作用
[0019](I)MTT法、LDH法测定细胞活力:
[0020]取对数生长期PC12细胞(由江苏大学医学院提供)，以2 X IO4/孔接种于96孔培养板，200μ 1/L。在37°C、5% CO2条件下培养过夜后，将细胞分为对照组、模型组、药物处理组。即对照组(不含Glu的完全培养基)；模型组(完全培养基+Glu);药物处理组(完全培养基 +JCHePS+Glu，浓度分别为 200 μ g/mL, 100 μ g/mL,、50 μ g/mL，用培养液稀释)。JCHcps预处理Ih后加Glu孵育24h每组设4个平行孔。培养24h后，每孔加5g/L MTT20 μ 1，继续培养4h后终止培养，小心吸取孔内上清液，做LDH实验。每孔加入DMS0150 μ L，使结晶充分溶解，用酶联免疫仪在波长570nm处读取吸光度(OD)。取4孔OD值的均数按公式计算细胞存活率结果见表1。细胞存活率％ =实验组OD/对照组ODX 100%。数据表明，JCHcps能保护Glu诱导PC12细胞的损伤作用。
[0021]收集培养液，按试剂盒说明书测定乳酸脱氢酶(LDH)(购买于南京建成生物工程研究所)的活性结果见表2。LDH的释放抑制率按下式计算:LDH抑制率(％ ) = (LDHtsa组-LDH给難)/ (LDH模型组-LDH正常组)X 100%。数据表明，JCHgps能抑制Glu诱导PC12细胞LDH释放。
[0022]表1MTT测定JCHcps对Glu诱导PC12细胞生存率的影响(7±.s’, n = 4)
[0023]
【权利要求】
1.一种金蝉花多糖，具有神经保护和抗衰老活性，其特征在于所述金蝉花多糖按照下述方法获得:干燥金蝉花药材，粉碎过药典2号筛，粉末在90°C下用水回流提取两次，每次2小时，提取液减压浓缩后，加无水乙醇，4°C一 25°C下过夜沉淀；3000r/min离心10 —30min ;干燥沉淀部分得金蝶花多糖。
2.权利要求1所述金蝉花多糖在制备神经保护和抗衰老药物中的用途。
3.—种以金蝉花制备的神经保护和抗衰老药物，其特征在于该药物含有治疗有效量的权利要求1所述的金蝉花多糖。
4.一种药物制剂，其特征在于含有有效剂量的权利要求1所述金蝉花多糖和一种或多种药学上可接受的药 物赋形剂，或可与金蝉花多糖组方的其他药物。
【文档编号】C08B37/00GK103992416SQ201410232441
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月28日 优先权日:2014年5月28日
【发明者】欧阳臻, 张魏琬麒, 赵明, 王吉标, 尚磊, 王璠, 汪愿 申请人:江苏大学