专利名称：一种团青霉的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种丝状真菌微生物。
三七系中国著名的传统中药材，民间具有活血化瘀、消肿止痛、滋补强壮等功效，是治疗跌打损伤的要药。现代医药、临床证实了三七对治疗人心血管系统、血液及造血系统、中枢神经系统、脑缺血、肝损伤、抗炎症、抗肿瘤、老年病、代谢等方面的疾病，都有很好的作用。三七含有的达玛烷型四环三帖成分不少于20个，主要属于人参二醇或原人参三醇及其衍生物。国内外至今未发现三七含有人参皂GF1化合物。
本发明的目的是提供一种能够使三七药物成分类型发生变化的三七发酵微生物——团青霉。
本发明所述的团青霉命名为团青霉(Penicillium commune)，系由云南中甸土壤中采集，在实验室分离培养获得，该菌株已在国家知识产权局专利局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2001年7月27日，保藏登记号为CCTCC NOM201029。
本发明所述的团青霉的培养条件一、PDA培养基28℃培养5天，菌落直径31mm，7天48mm，11天55mm。菌落紧密细绒状浅灰绿色，边缘整齐，中间稍隆起浅肉红色，具放射状花纹，分泌棕色水珠，背面黄棕色；二、麦芽法培养基28℃培养4天，菌落直径31mm，7天45mm，11天70mm。菌落绒状，边缘整齐，浅灰绿色至白色，具放射状花纹；背面棕黄色。
三、察贝克培养基28℃培养4天，菌落直径21mm，7天37mm，11天45mm。菌落紧密绒粉状，黄绿色，边缘整齐，有同心环及不规则沟纹，背面乳黄色。
形态特征一、无性世代，菌丝有隔无色，分生孢子梗从菌丝垂直生出，小梗瓶状，项端细长，轮状分枝或生于短侧枝上或直接从菌丝生出4.0～5.6×1.6！2.4微米，分生孢子串生、圆形粗糙2.4～3.2微米。
二、有性世代，未发现。
本发明所述的三七微生物发酵，其工艺步骤为
菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵培养→烘干→三七发酵物→提取→总皂甙。
在此步骤中，发酵原料为有数或无数头三七中药材，其发酵条件参数如下1.发酵方式固体发酵；2.种子培养一级种子培养采用马铃薯葡萄糖固体培养基(固体PDA)。二级种子培养为马铃薯葡萄糖液体培养基(液体PDA)；马铃薯葡萄糖培养基(PDA)制备取新鲜马铃薯200克，去皮切成小块，加水1升煮沸30分钟，过滤弃马铃薯，滤液水补足至1升，加入葡萄糖20克，PH自然；3.发酵培养发酵的培养基为80～100目三七粉50％，新鲜黄豆渣50％，水份65％，PH自然；4.培养时间菌种活化培养48小时，一级种子静止培养时间72小时，二级种子摇床培养时间72，发酵培养时间12天；5.培养温度一级种子培养温度28℃±1℃，二级种子摇床培养温度28℃±2℃，发酵培养温度为28℃±2℃；6.烘干三七发酵完毕，发酵物置60℃下烘干，供提取分离皂甙元用。
本发明所述的团青霉经PCR技术，DNA测序仪分析，该菌分子生物学特征为18SRNA全系列由501个碱基组成。
1TAAAGATTAA GCCATGCATG TCTAAGTATA AGCACTTTAT ACTGTGAAAC51 TGCGAATGGC TCATTAAATC AGTTATCGTT TATTTGATAG TACCTTACTA101 CATGGATACC TGTGGTAATT CTAGAGCTAA TACATGCTAA AAACCCCGAC151 TTCAGGAAGG GGTGTATTTA TTAGATAAAA AACCAACGCC CTTCGGGGCT201 CCTTGGTGAA TCATAATAAC TTAACGAATC GCATGGCCTT GCGCCGGCGA251 TGGTTCATTC AAATTTCTGC CCTATCAACT TTCGATGGTA GGATAGTGGC301 CTACCATGGT GGCAACGGGT AACGGGGAAT TAGGGTTCGA TTCCGGAGAG351 GGAGCCTGAG AAACGGCTAC CACATCCAAG GAAGGCAGCA GGCGCGCAAA401 TTACCCAATC CCGATACGGG GAGGTAGTGA CAATAAATAC TGATACGGGG451 CTCTTTTGGG TCTCGTAATT GGAATGAGAA CAATTTAAAT CCCTTAACGA501 GGAACAATTG GAGGGCAAGT CTGGTGCCAG
本发明所述的团青霉，通过该菌生命代谢活动转化中药材三七总皂甙药用成分，通过微生物发酵手段，有仅能使三七原药物有效成分类型发生质的改变，而且还能不同程度地转化三七总皂甙组分数量。本发明所述的团青霉，其所述的菌株发酵三七中药材12天后，三七发酵物所含药物成分各类发生变化。提取的总皂甙中，除可分离得到觉皂甙元，如三七原人参二醇皂甙nR1、Rd、Rg3、Rh2和原人参三醇型皂甙Re、Rg1、Rg2、Rh1等组分之外。最显著的特征是通过发酵转化生成原三七没有的人参皂甙GF1新化合物，其含量不少于总甙的18％。本发明是三七的微生物发酵，以中药材三七为原料，采用固体发酵方法，能使原三七药物成分类型发生变化，转化新化合物人参皂甙GF1。同时在原基础上，能使三七原人参二醇型皂甙Rd含量提高30％以上；nR1含量提高10％左右；Rb1和Rc组分含量消失或降低；使人参三醇型皂甙Rh1组分含量增加15％的优良菌株YM3513。该菌株是发酵转化三七皂甙，筛选抗人类心血管疾病或抗肿瘤新药成分的微生物菌种。
本发明所述的团青霉已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址中国.武汉.武汉大学，分类命名Penicilium sp.YM3513。
图1为本发明所述的团青霉菌株DNA测序图谱。
下面结合实施例对本发明作进一步描述，但不限于实施例。
取YM3513团青霉种，在无菌条件下，用接种针挑取少许菌种，转接于已灭菌的固体PDA培养基试管中，置培养箱内28℃±1℃活化培养48小时的菌种，在无菌条件下，以同样方式接入活化好的菌种到已灭菌的一级种子固定PDA培养基中，在28℃±1℃下培养72小时，即为YM3513一级种子。
采用500毫升玻璃三角瓶，装入配制好的液体PDA培养基100毫升，15磅灭菌30分钟备用，取YM3513一级种子，在无菌条件下，接种于装有100毫升液体PDA培养基的100毫升玻璃三角瓶中，一级种子接种量为每支斜面接三个三角瓶，置于28℃±1℃摇床培养72小时后，作为三七发酵二级种子用。
根据发酵规模大小，发酵料按重量比率，称取50％三七粉(80～100目)，加入50％的新鲜黄豆渣，充分拌匀，发酵料水分不低于65％。三七发酵料配制好后，装入500毫升罐头瓶中，牛皮纸封口，置灭菌锅内15磅灭菌60分钟后，取出待冷却至30℃，接入液体二级种子，二级种子接用量为5％(v/w)。摇匀后放置28℃±2℃下，静止发酵12天。在发酵期间，注意发酵室保温不低于80％相对湿度，第3天分另进行摇瓶一次，每三天倒瓶一次，检查有无染菌现象。
发酵完毕，分别掏出发酵物，装入已灭菌纸袋内，置60℃下烘干，便得到提取人参皂甙GF1化合物，以及三七皂甙组分含量发生变化的三七发酵物。GF1化学结构式为
权利要求
1.一种团青霉，其特征在于命名为团青霉(Penicillium commune)，其保藏登记号为CCTCC NOM201029。
2.根据权利要求1所述的团青霉，其特征在于培养条件为一、PDA培养基28℃培养5天，菌落直径31mm，7天48mm，11天55mm。菌落紧密细绒状浅灰绿色，边缘整齐，中间稍隆起浅肉红色，具放射状花纹，分泌棕色水珠，背面黄棕色；二、麦芽法培养基28℃培养4天，菌落直径31mm，7天45mm，11天70mm。菌落绒状，边缘整齐，浅灰绿色至白色，具放射状花纹；背面棕黄色；三、察贝克培养基28℃培养4天，菌落直径21mm，7天37mm，11天45mm。菌落紧密绒粉状，黄绿色，边缘整齐，有同心环及不规则沟纹，背面乳黄色。
3.根据权利要求1所述的团青霉，其特征在于其形态特征为一、无性世代，菌丝有隔无色，分生孢子梗从菌丝垂直生出，小梗瓶状，项端细长，轮状分枝或生于短侧枝上或直接从菌丝生出4.0～5.6×1.6！2.4微米，分生孢子串生、圆形粗糙2.4～3.2微米；二、有性世代，未发现。
4.根据权利要求1所述的团青霉，其特征在于经PCR技术，DNA测序仪分析，该菌分子生物学特征为18SRNA全系列由501个碱基组成1 TAAAGATTAA GCCATGCATG TCTAAGTATA AGCACTTTAT ACTGTGAAAC51 TGCGAATGGC TCATTAAATC AGTTATCGTT TATTTGATAG TACCTTACTA101 CATGGATACC TGTGGTAATT CTAGAGCTAA TACATGCTAA AAACCCCGAC151 TTCAGGAAGG GGTGTATTTA TTAGATAAAA AACCAACGCC CTTCGGGGCT201 CCTTGGTGAA TCATAATAAC TTAACGAAATC GCATGGCCTT GCGCCGGCGA251 TGGTTCATTC AAATTTCTGC CCTATCAACT TTCGATTGGTA GGATAGTGGC301 CTACCATGGT GGCAACGGGT AACGGGGAAT TAGGGTTCGA TTCCGGGAGAG351 GGAGCCTGAG AAACGGCTAC CACATCCAAG GAAGGCAGCA GGCGCGCAAA401 TTACCCAATC CCGATACGGG GAGGTAGTGA CAATAAATAC TGATACGGGG451 CTCTTTTGGG TCTCGTAATT GGAATGAGAA CAATTTAAAT CCCTTAACGA501 GGAACAATTG GAGGGCAAGT CTGGTGCCAG
全文摘要
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种丝状真菌微生物，一种团青霉，其特征在于命名为团青霉(Penicillium commune)，其保藏登记号为CCTCCNOM201029，本发明所述的团青霉，通过该菌生命代谢活动转化中药材三七总皂甙药用成分，通过微生物发酵手段，有仅能使三七原药物有效成分类型发生质的改变，而且还能不同程度地转化三七总皂甙组分数量。
文档编号C12N15/31GK1408846SQ01141480
公开日2003年4月9日 申请日期2001年9月27日 优先权日2001年9月27日
发明者陈有为, 李治滢, 杨丽源, 李绍兰, 周斌 申请人:云南省微生物研究所