一种kpc碳青霉烯酶抑制肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物医药领域，具体设及一种KPC碳青霉締酶抑制肤及其应用。
【背景技术】
[0002] 2013年美国疾病预防与控制中屯、宣布优先研发用于治疗耐碳青霉締类肠杆菌科 细菌（Carbapenem-resistantE；nte;robacte;riaceae，CRE)的抗菌药物。其原因在于产KPC 碳青霉締酶化lebsiellapneumoniaeCarbapenemase，KPC)的CRE菌的出现及扩散，严重 降低了β-内酷胺类抗菌药物（包括碳青霉締类抗生素）的临床疗效，使得临床上治疗耐 药菌感染面临严峻考验。CREs往往对于大多数抗生素均耐药，令医务人员头疼的是运一类 耐药菌有时仅对毒性较大的抗菌剂多黏菌素敏感。
[0003] 在CREs中，产KPC-2酶的克雷伯菌属化lebsiellaSPP.)最为普遍，且在希腊曾出 现过爆发性流行（MaltezouΗC,GiakkoupiP,MaragosA,etal.Ou忧reakofinfections duetoKPC-2-producingKlebsiellapneumoniaeinahospitalinCrete(Greece)[J]. JournalofInfection, 2009, 58 (3) : 213-219)。KPC-1 碳青霉締酶于 1996 年在美国北卡罗 来纳州分离得到的K.peneumoniae中首次被发现。编码KPC-2的基因存在于可转移质粒的 Τη3家族转座子内。到目前为止已经发现了十余种KPC酶的亚型，如表1 (纪明宇，耿大影， 裴凤艳，等.KPC碳青霉締酶研究概况及进展[J].临床检验杂志，2013, 31 (4) : 282-285)。 KPC碳青霉締酶不仅能水解包括青霉素类、头抱菌素类、碳青霉締类、单环类等所有类型的 0 -内酷胺类抗生素，而且同时能够灭活克拉维酸、舒己坦、他挫己坦等β-内酷胺酶抑制 剂。
[0004] 表1KPC酶种类、发现时间和地点
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[0007] 目前临床上使用的β-内酷胺酶抑制剂（克拉维酸、舒己坦、他挫己坦），对于不 断出现的新β-内酷胺酶的抑制效果越来越不明显，因此迫切需要一种可W用于治疗因产 KPC碳青霉締酶而耐药的病原菌引起的细菌感染的KPC碳青霉締酶抑制剂。临床分离获得 的产碳青霉締酶的耐药菌株中，W产KPC-2酶的多药耐药菌株最为常见。
【发明内容】
[0008] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种KPC碳青霉締酶抑 制肤。
[0009] 本发明的另一目的在于提供上述KPC碳青霉締酶抑制肤的应用。将本发明的KPC 碳青霉締酶抑制肤与β内酷胺类抗生素合用，可显著提高β内酷胺类抗生素的抗菌活性。
[0010] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0011] 一种KPC碳青霉締酶抑制肤，为4个氨基酸组成的线性小肤，其氨基酸序列为 Pro-Asn-Gln-T巧，理论分子量591. 58,化学结构式如图1所示。
[001引上述KPC碳青霉締酶抑制肤可通过固相合成法制备，方法简单，技术成熟、产物质 量容易控制，能满足大规模工业化生产的需要。
[0013] 上述KPC碳青霉締酶抑制肤在抑制KPC碳青霉締酶中的应用。
[0014] 上述KPC碳青霉締酶抑制肤在制备预防和/或治疗耐药菌感染相关疾病的药物和 /或抗菌药物中的应用。所述的耐药菌为因产KPC碳青霉締酶而获得耐药性的细菌，所述的 抗菌为抗因产KPC碳青霉締酶而获得耐药性的细菌。
[0015] 一种抗菌药物组合物，包含所述的KPC碳青霉締酶抑制肤，还包含该抑制肤药学 上可接受的盐和/或药学上可接受的载体。
[0016] 所述的KPC碳青霉締酶抑制肤与β-内酷胺类抗生素具有良好的协同作用，能明 显抑制耐药菌生长并且大幅度降低β-内酷胺类抗生素的最小抑菌浓度（MIC)。该抑制肤 通过抑制KPC碳青霉締酶活性从而保护β-内酷胺类抗生素的药效结构一-β内酷胺环 免于被该类酶水解从而发挥抗生素的抗菌活性。
[0017] 一种抗菌药物组合物，包含所述的KPC碳青霉締酶抑制肤和β-内酷胺类抗生素， 还包含该抑制肤和β-内酷胺类抗生素药学上可接受的盐和/或药学上可接受的载体。将 本发明的抑制肤与β内酷胺类抗生素合用能更有效的抑制耐药菌的生长。
[0018] 所述的β-内酷胺类抗生素优选为氨节西林、阿莫西林、赃拉西林、替卡西林、氣 氧头抱、头抱替挫、头抱嚷朽、头抱曲松钢、头抱他晚、头抱化朽、头抱洛林、亚胺培南、美罗 培南、比阿培南、多尼培南、厄他培南、氨曲南中的一种或多种。更优选的，所述的β-内酷 胺类抗生素为美罗培南。
[0019] 通过溶血实验表明，所述的KPC碳青霉締酶抑制肤在浓度高达7. 5mg/mL时未发生 明显的溶血反应，其安全性高。
[0020] 上述抗菌药物组合物可W根据药学领域的常规制剂方法制备成注射剂、片剂、注 射用无菌粉末、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂等多种剂型。该抗菌药物组合物可 W通过注射、口服、滴鼻、滴眼、物理或化学介导的方法导入肌肉、内皮、皮下、静脉或粘膜组 织，或是被其他物质混合或包裹后导入肌体。
[0021] 本发明具有如下优点与效果：本发明的KPC碳青霉締酶抑制肤具有良好的KPC碳 青霉締酶抑制活性，且安全性高；其人工合成方便，生产成本低，适合工业化大规模生产； 将该抑制肤与β-内酷胺类抗生素联合使用可避免抗生素被酶水解破坏而失效，在治疗耐 药菌感染领域具有良好的开发前景；本发明的KPC碳青霉締酶抑制肤为开发新的抗菌药物 及复方制剂提供了新的选择。
【附图说明】
[0022] 图1是KPC碳青霉締酶抑制肤Pro-Asn-Gln-T巧的化学结构式图。
[0023] 图2是制备的KPC碳青霉締酶抑制肤Pro-Asn-Gln-T巧的质谱结果图。
[0024] 图3是KPC碳青霉締酶抑制肤Pro-Asn-Gln-T巧对KPC-2碳青霉締酶抑制活性的 测定结果图；图中，KPC-2酶：KPC-2碳青霉締酶，抑制肤：KPC碳青霉締酶抑制肤。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。其 中
[0026] 下属实施例中表达KPC-2碳青霉締酶的工程菌E.coliRosetta(DE3) / 祀T28a-KPC-2的构建及该酶的表达纯化方法如下：
[0027] 根据GenBank中编码KPC-2碳青霉締酶的基因化laiipc2基因）全序列（GenBank ID:KJ151293. 1)，用PrimerPremier5设计PCR引物，上下游引物序列分别为：KPC-2-F:5' -CGCGGATCCATGTCACTGTATCGCC-3' (下划线部分为BamHI酶切位点）；KPC-2-R:5'-CCAAGC 111'174押601^1764〔6(：-3'（下划线部分为化11(1111酶切位点）。61曰阳。2〇臟模板由上海捷瑞 生物工程有限公司合成。
[002引通过PCR扩增blawc2基因，PCR反应条件为：94°C预变性3min;94°C变性0. 5min， 54°C退火1. 5min，72°C延伸1. 5min，共30个循环；72°C再延伸lOmin。PCR扩增产物经电泳 鉴定后测序。
[0029] 将经PCR扩增产物及祀T28a空质粒分别经BamHI和化ndIII双酶切，用核酸凝胶 回收试剂盒回收blawc2基因片段和质粒片段。用T4DNALigase将blawc2基因与祀T28a 质粒片段于16°C连接12h。连接产物转化至E.coliRosetta(DE3)感受态细胞中。
[0030] 挑取测序正确的阳性单克隆菌株E.coliRosetta(DE3)/pET28a-KPC-2,接种于新 配的灭菌LB液体培养基中（含 50mg/mLKanamycin)，WE.coliRosetta(DE3)/pET28a作 为阴性对照，37°C、200r/min培养至ODe。。为0. 6~0. 8,加入终浓度为0. 2mmol/LIPTG诱 导表达，28°C继续培养化。取1血菌液于EP管中，80(K)r/min离屯、2min，弃去上清，收集菌 体沉淀，SDS-PAGE检测。
[0031]将500血诱导表达的菌液于4°C、lOOOOr/min冷冻离屯、20min，弃去培养基，收集菌 体，W每克湿菌加入10血缓冲液（30mmol/L胞&?〇4,lOOmmol/L化C1，pH7.W的比例重悬 菌体。冰浴超声将菌体破坏后于4°C、lOOOOr/min离屯、20min，弃去破碎的菌体沉淀，保留上 清液。将5血上清液加入Ni2+-NTA层析柱中，先加入25血洗涂缓冲液（30mmol/LTris-肥1， lOOmmol/LNaCl，30mmol/L咪挫，pH7. 5)，然后加入 10血洗脱缓冲液（30mmol/LTris-HCl， lOOmmol/LNaCl，lOOmmol/L咪挫，pH7. 5)获得KPC-2 重组蛋白（KPC-2 碳青霉締酶）。
[0032] 实施例1 KPC碳青霉締酶抑制肤的制备
[0033]KPC碳青霉締酶抑制肤的氨基酸序列为Pro-Asn-Gln-Trp，化学结构式如图1所 /J、- 〇
[0034]W9-巧甲氧幾基（FM0C)为N端保护基团，采用固相合成法合成KPC碳青霉締酶 抑制肤。用92%Ξ氣乙酸、5%水和3%Ξ异丙甲硅烷Ο?Α)的混合液（92%、5%、3%均为 质量百分比）将其从ΜΒΗΑ树脂上裂解。乙酸多次沉淀后，经制备型反相高效液相色谱法 (RP-册LC)纯化。使用C18反相制备柱（20mmX250mm，5ym);流动相：0. 06%Ξ氣乙酸， 0% -80%化06%、0% -80%为体积百分比）乙腊为流动相，1. 5血/min的流速进行梯度洗 脱。经RP-HPLC检测，其纯度>98%，冻干备用。经ESI-QT0F-MS鉴定，其分子量与相应肤的 理论分子量一致，m/巧92. 71 [M+田+，质谱结果见图2。
[0035] 实施例2 KPC碳青霉締酶抑制肤对KPC-2碳青霉締酶抑制活性的测定
[0036] W美罗培南为报告底物，实验分为3组，保持溫度为37 ±rC:
[0037] (1)美罗培南+KPC-2碳青霉締酶组：向5μL浓度为2mmol/L的美罗培南与90μL 浓度为30mmol/L的肥阳S缓冲液（ρΗ7. 4)的混合溶液中加入5μL浓度为1ymol/L的 KPC-2碳青霉締酶，总体积为100μL。
[0038] (2)美罗培南+KPC-2碳青霉締酶+酶抑制肤组：向5μL浓度为2mmol/L的美罗 培南与80μL浓度为30mmol/L的肥PES缓冲液（pH7. 4)的混合溶液中加入5μL浓度为 1μmol/L的KPC-2碳青霉締酶与10μL浓度为1μmol/L的KPC碳青霉締酶抑制肤，总体积 为 100μL。
[0039] (3)美罗培南组：向5μL浓度为2mmol/L的美罗培南中加入95μL浓度为30mmol/ L的肥阳S缓冲液（pH7. 4)，总体积为100μL。
[0040] 由于报告底物美罗培南被酶水解后其吸光度下降，因而通过测定波长为300nm的 吸光度的变化可W反应出底物的水解程度。结果如图3所示：（1)组吸光度在500秒内下 降最快，说明KPC-2碳青霉締酶能高效地催化底物美罗培南的水解；(2)组吸光度虽然也有 一定程度的降低，但相对于（1)