一种利用淡紫拟青霉yt08生产壳聚糖酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体地设及一种利用淡紫拟青霉YT08生产壳聚糖酶 的方法。
【背景技术】
[0002] 壳聚糖是由D-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖巧键连接的一类阳离子型氨基多糖，是几 下质部分或完全脱乙酷基的衍生物，由于在生理条件下的低溶解性和高粘度导致其有效应 用受到阻碍。壳寡糖是壳聚糖经水解后产生的一类聚合度在2-20且可溶于水的氨基糖类化 合物，具有独特的生理活性和优越的功能性质，在食品、工业、医药和化工领域具有重要应 用。
[0003] 壳聚糖酶(CMtosanase，EC 3.2.1.132)是一类催化氨基葡萄糖间的护1，4-糖巧 键断裂，专一性降解壳聚糖的糖巧水解酶，是在催化壳聚糖底物水解转化制备壳寡糖的产 业化领域具有重要应用前景的酶类，尤其是在低分子量且高生理活性的壳寡糖制备方面的 应用引人注目。根据其作用位点不同，壳聚糖酶可分为3类：1)水解GlcN-GlcN键及GlcNAc- GlcN键；2)只能水解GlcN-GlcN键；3)既可水解GlcN-GlcN键又可水解GlcN-GlcNAc键。所有 壳聚糖酶有一个共同催化性质就是要求糖巧键的一侧至少有1个GlcN残基，而不能催化 GlcNAc-GlcNAc键的断裂，不同生物来源壳聚糖酶催化特性和酶解模式不同造成产物壳寡 糖聚合度存在差异。
[0004] 壳聚糖酶广泛分布于细菌、真菌、放线菌、蓝藻和植物等生物体中，其中细菌来源 的壳聚糖酶的研究报道较多，而真菌来源的相对较少。从已有发表文献的结果，虽然壳聚糖 酶的生物来源较多，但是多数生物体的壳聚糖酶产量偏少，难W进行产业化生产应用。本发 明是在筛选获得一株用于番茄和葡萄根结线虫害防治的淡紫拟青霉（发明专利CN 104818216 A)的基础上，发现该菌株也高产壳聚糖酶，W此确定其培养方法，并适应于产业 化生产制备壳聚糖酶，进一步应用于壳寡糖转化制造领域。
【发明内容】
[0005] 本发明针对上述技术存在的不足，提供一种利用淡紫拟青霉YT08菌株发酵生产高 活性壳聚糖酶的方法，所述的酶可通过高效水解壳聚糖来生产高生理活性的壳寡糖。
[0006] 本发明是通过如下技术方案来实现的：
[0007] 淡紫拟青霉(paecilomyces lelacinus)YT08菌株，保藏单位：中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期： 2014年 11 月26日，保藏号为CGMCC No. 10026。
[000引本发明提供一种利用该菌株发酵生产壳聚糖酶的方法，具体步骤如下：
[0009] (1)菌种活化：取保存的淡紫拟青霉YT08菌种接种于活化培养基中，在28°C、 20化pm下培养至菌体浑浊，制得活化种子液；
[0010] 进一步，所述的活化培养基(g/L):蛋白腺5,葡萄糖10,憐酸二氨钟1，硫酸儀0.5， pH 7.0，12rC灭菌20min备用。
[0011] (2)发酵生产壳聚糖酶:按照0.2~0.8%(v/v)的接种量在灭菌后的发酵培养基中 接入步骤（1)活化种子液，在18化pm的旋转摇床中培养，控制溫度为30~34°C，发酵3-5d后 培养完毕，发酵液经离屯、过滤除菌后直接作为壳聚糖酶液使用；或者在发酵罐中W70%的 体积比例装入发酵培养基，经118°C蒸汽灭菌20min后，按照0.2~0.8%(v/v)的比例接入活 化的菌种，控制发酵过程中的抑始终维持在抑5~6.5，调节培养溫度在30~34°C，溶解氧 维持在10% (mg/ml)W上，经发酵2-4d后发酵完毕，经离屯、过滤除菌后直接作为壳聚糖酶液 使用。
[0012] 进一步，所述得发酵培养基（g/L):甘油10~20,大豆蛋白腺20~35，MnS化0.5~ 2.5，粉末壳聚糖(85%^上的脱乙酷度）12~20，船(：12.5~4，(：曰(：12〇.5~1.5，]\%5〇4 1.5 ~3.5，FeS〇4 0.5~2,地 5~6.5。
[0013] 本发明的培养方法与现有技术相比的有益效果在于：
[0014] (1)产壳聚糖酶的活力高
[0015] 本发明的培养方法，酶活力高于W往多数报道的酶活力值，表明其单位时空产率 增加幅度大，具备产业化生产潜力。
[0016] (2)培养方法简单
[0017] 淡紫拟青霉YT08的培养方法简单，对于碳源等营养因子需求低，培养容易且过程 不易染菌;发酵罐培养过程中不需要复杂的补料工艺，适合工厂化放大生产。
[0018] (3)培养方法切合实际，酶活提高幅度大
[0019] 采用本发明的培养方法，在实际发酵生产过程中的壳聚糖酶活力值，与初期的培 养方法比较，其酶产量提高了 100多倍，培养方法的产量突出。
[0020] (4)壳聚糖酶的生物来源新型
[0021] 本发明设及的是淡紫拟青霉来源壳聚糖酶的培养方法，目前还未见该生物来源壳 聚糖酶的产业化报道，市场前景应用广阔。
【附图说明】
[0022] 图1为实施例3中淡紫拟青霉YT08摇瓶发酵生产壳聚糖酶的培养曲线。
【具体实施方式】
[0023] W下结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，运些实施例用于理解而不是限 制本发明的保护范围。
[0024] 实施例1:淡紫拟青霉YT08生产壳聚糖酶发酵组分优化
[0025] 碳源对菌株产壳聚糖酶的影响见表1，可W看出甘油、薦糖和甘露醇作为碳源发酵 生产壳聚糖酶的效果较好，最好的是甘油。所用的初始培养基成分(g/L):酵母粉3,蛋白腺 5，硝酸锭2，硫酸儀1，硫酸锭0.5，憐酸氨二钟3，憐酸二氨钢1，粉末壳聚糖5，碳源30，其中碳 源为葡萄糖、麦芽糖、果糖、薦糖、甘油、糊精、淀粉、甘露醇，接入活化种子后在18化pm和30 °C的摇床中发酵48h后测定酶活力。
[0026] 表1碳源对菌株产酶的影响
[0027]
[0028] ~氮源对菌株产壳聚糖酶的影响见表2,大豆蛋白腺、酵母膏、膜蛋白腺、酵母粉是发 酵生产壳聚糖酶的较好氮源，其中最佳氮源为大豆蛋白腺。所用的初始培养基组分(g/L): 甘油30,氮源10,硫酸儀1，憐酸氨二钟3,憐酸二氨钢1，粉末壳聚糖5,接入活化种子后在 18化pm和30°C的摇床中发酵4她后测定酶活力。
[0029] 表2氮源对菌株产酶的影响
[0030]
[0031]
[0032] 金属盐对菌株产壳聚糖酶的影响见表3,对壳聚糖酶的发酵生产具有正效应的因 素是硫酸儘、氯化钢、硫酸儀、氯化巧和硫酸亚铁，其中最佳产酶的金属盐为硫酸儘。所用的 初始培养基组分(g/L):甘油30,大豆蛋白腺10,金属盐2,粉末壳聚糖5,接入活化种子后在 18化pm和30°C的摇床中发酵4她后测定酶活力。
[0033] 表3金属盐对菌株产酶的影响
[0034]
[0035] 诱导物对菌株产壳聚糖酶的影响见表4,可W看出添加粉末壳聚糖对壳聚糖酶的 诱导效果最好，所用的初始发酵培养基(g/L):甘油30,大豆蛋白腺10,硫酸儘1，硫酸儀1，氯 化钢1，诱导物5。
[0036] 表4诱导物对菌株产酶的影响
[0037]
[0038] 选取对淡紫拟青霉YT08发酵生产壳聚糖酶有正影响的因素：甘油(XI)、大豆蛋白 腺（X2)、NaCl(X3)、FeS〇4(X4)、CaCl2(Xs)、MgS〇4(X6)、MnS〇4(X7)、粉末壳聚糖（X8)，进行 Plackett-Burman试验设计W筛选对菌株产酶有显著影响的培养因子，其试验设计和测定 结果见表5。利用Desi即 E邱ert 7.1.6(Sl:at-Ease , Inc. ,Minneapolis ,USA)软件分析，表 明甘油(Xi)、大豆蛋白腺(X2)、MnS〇4(X7)、粉末壳聚糖(X8)是对菌株产壳聚糖酶影响极其显 著的培养因子。
[0039] 表SPlackett-Burman试验设计与显著因素筛选
[0040]
[0041 ] 采用初始发酵培养基(g/L):化Cl 3，FeS〇4 l，CaCb l，MgS〇4 2,对甘油(Xi)、大豆 蛋白腺(X2)、MnS化(X?)、粉末壳聚糖(X8)运四个因素进行爬坡试验设计与优化，其结果见表 6，可W看出序号4组获得最大壳聚糖酶活力。
[0042] 表6爬坡试验设计与优化
[0043]
[0044] W爬坡试验设计与优化的结果为中屯、点，进行甘油（XI)、大豆蛋白腺(X2)、MnS〇4 (&)、粉末壳聚糖(X8)运四个培养组分的中屯、组合设计与优化，其组合设计和结果见表7。利 用Desi即 Expert 7.1.6(Stat-Ease, Inc. ,Minneapolis ,USA)软件分析，表明将甘油的浓 度调至12g/L，大豆蛋白腺的浓度调至29g/L，硫酸儘的浓度调至Ig/L，粉末壳聚糖的浓度调 至18g/L，可W得到最大的壳聚糖酶活性，为14.50U/mL。采用中屯、组合设计优化获得的培养 组分，发酵4她后壳聚糖酶活性值为14.5抓/mL，故本优化设计方案准确。
[0045] 表7中屯、组合设计培养组分与优化
[0046]
[0047] 实施例2:淡紫拟青霉YT08生产壳聚糖酶发酵条件优化
[004引采用实施例1中的优化培养组分(g/L):甘油12,大豆蛋白腺29,化C1 3，FeS化1， 化C12 l，MgS化2，MnS04 1，粉末壳聚糖18,通过对不同培养抑、培养溫度和接种量条件下的 发酵96h后的培养物进行壳聚糖酶活力测定，其结果见表8、表9和表10,可W看出淡紫拟青 霉YT08产壳聚糖酶的最优培养pH为6，溫度为32°C，接种量为0.6% (v/v)。
[0049]表8培养抑对菌株产酶的影响
[(K)加 ]
[0055] W单因素优化的培养溫度、抑和接种量为中屯、点，进行Box-Behnken设计，深入优 化优化培养条件，其组合设计和优化结果见表11。利用Design Expert 7.1.6(Stat-Ease, 1〇(3.，1111116曰9〇113