一种有效提高四烯大环内酯类抗生素产量的方法
【专利说明】
[0001]
技术领域
[0002] 本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种有效提高四烯大环内酯类抗生素产 量的方法。
【背景技术】
[0003] 目前许多自主开发的新型农用抗生素只是停留在实验室阶段，其中关键的原因就 是生产菌的产素水平未达到工业化要求。所以，当前摆在研究工作者面前一个主要的问题 就是提高现有和正在开发的农用抗生素生产菌的产素水平，加快农用抗生素的产业化进 程。常规的微生物诱变育种费时费力、随机性高，通过基因工程手段已可实现单基因编码的 酶类的定向进化并进行超量表达，但对需要成簇基因编码的抗生素等天然产物的产量提高 则困难重重。研究表明联合抗药性突变筛选方法是一种新颖的优化抗生素产生菌的新方 法，联合抗药性突变可加强微生物合成抗生素的水平，并且这一优化菌株的新方法能够应 用于多种抗生素生产菌株的优化并且能够提高野生型菌株的抗生素产量。
[0004] 四烯大环内酯类抗生素可抑制多种植物病原真菌的生长，在生物防治上具有广阔 的应用前景。淀粉酶产色链霉菌（StrejOtopees i/iasia可合成3种四稀 大环内酯类抗生素：四霉素 P、四烯菌素 B和四霉素 A，利用联合抗药性突变筛选方法改良淀 粉酶产色链霉菌D使其提高四烯大环内酯类抗生素合成能力的研究未见有报道。
【发明内容】
[0005] 本发明通过联合抗药性突变株的筛选，获得对利福平、低浓度链霉素和高浓度链 霉素都产生抗药性的淀粉酶产色链霉菌D的突变株，获得的突变株合成四烯大环内酯类抗 生素的能力比淀粉酶产色链霉菌D显著提高。该发明为提高四烯大环内酯类抗生素的产量 提供了一种可靠的方法。
[0006] 本发明的目的是针对野生型菌株淀粉酶产色链霉菌D产四烯大环内酯类抗生素 水平低的不足，提供一种提高四烯大环内酯类抗生素产素水平的方法；本发明的另一目的 是提供了一株高产四烯大环内酯类抗生素的淀粉酶产色链霉菌D突变株。
[0007] 本发明目的通过以下技术方案来实现： 一种有效提高四烯大环内酯类抗生素产量的方法按以下步骤进行： (1)利福平抗性突变株的获得(第一轮抗药性突变株筛选） 淀粉酶产色链霉菌（SirejOi/iasia ，定名为淀粉酶产色链霉菌 D。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，保藏日期2007年5月25日，保藏登记号CGMCC No. 2060。
[0008] 制备利福平终浓度为20 μ g/mL的GYM固体平板，也即GYM固体平板中利福平浓 度为20 μ g/mL。GYM固体培养基组分与浓度为葡萄糖4 g/L，Dried yeast extract 4 g/L，Dried Malt extract-S 10 g/L，N-Z-Amine A I g/L，NaCl 2 g/L，OB 溶液 600 yL， 定容后用2 mol/L NaCl溶液调节pH至7. 3,琼脂20 g/L ;其中OB溶液配置方法：称取 MgS04 · 7H20 25g，CuSO4 · 5H20 2. 5g，FeSO4 · 7H20 3. 75g，MnSO4 · 5H20 I. 8g，CaCl2 · 2H20 17. 5g，ZnSO4 · 7H20 4. 5g，加500 mL水，用前摇匀；用移液枪吸取100 μ L淀粉酶产色链霉 菌D孢子悬液（I X IO6个/mL)于含有20 μ g/mL利福平的GYM固体平板上，用无菌涂布棒 涂布均勾，置28 °C培养箱培养7天，分别挑取单菌落至新的含有20 μ g/mL利福平的GYM 固体平板(一个单菌落划一个平板)，置28 °C培养箱培养5天，能再次在该新的GYM固体平 板上长出的菌株即为利福平抗性突变株。
[0009] (2)低浓度链霉素抗性突变株的获得(第二轮抗药性突变株筛选） 制备链霉素终浓度为30 μ g/mL的GYM固体平板，也即GYM固体平板中链霉素浓度为 30 μ g/mL。GYM固体培养基组分与浓度同步骤（1);用移液枪吸取100 μ L利福平抗性突 变株(也即第一轮抗药性筛选获得的突变株)孢子悬液（I X IO6个/mL)于含有30 μ g/mL链 霉素的GYM固体平板上，用无菌涂布棒涂布均匀，置28 °C培养箱培养7天，分别挑取单菌 落至新的含有30 μ g/mL链霉素的GYM固体平板(一个单菌落划一个平板)，置28 °C培养箱 培养5天，能再次在该新的GYM固体平板上长出的菌株即为低浓度链霉素抗性突变株。
[0010] (3)高浓度链霉素抗性突变株的获得(第三轮抗药性突变株筛选） 制备链霉素终浓度为300 μ g/mL的GYM固体平板，也即GYM固体平板中链霉素浓度为 300 μ g/mL。GYM固体培养基组分与浓度同步骤（1);用移液枪吸取1000 μ L第二轮筛选 获得的突变株孢子悬液（I X 1〇12个/mL)于含有300 μ g/mL链霉素的GYM固体平板上，用 无菌涂布棒涂布均匀，置28°C培养箱培养10~15天，分别挑取单菌落至新的含有300 μ g/ mL链霉素的GYM固体平板(一个单菌落划一个平板)，置28°C培养箱培养7~10天，能再次在 该新的GYM固体平板上长出的菌株即为高浓度链霉素抗性突变株。
[0011] (4)淀粉酶产色链霉菌突变株液体发酵 发酵培养：发酵培养液为GYM液体培养基，组分与浓度为葡萄糖4 g/L，Dried yeast extract 4 g/L，Dried Malt extract-S 10 g/L, N-Z-Amine A I g/L，NaCl 2 g/L, OB 溶液600 μ L，定容后用2mol/L NaCl溶液调节pH至7. 3 ;其中OB溶液配置方法：称取 MgS04 · 7H20 25g，CuSO4 · 5H20 2. 5g，FeSO4 · 7H20 3. 75g，MnSO4 · 5H20 I. 8g，CaCl2 · 2H20 17. 5g，ZnSO4 · 7H20 4. 5g，加500 mL水，用前摇匀；每300 mL三角瓶装60 mL发酵培养液， 配制后121°C灭菌20 min，待冷却至50 °C，无菌条件下分别挑取一铂金环淀粉酶产色链霉 菌D和突变株孢子接种，28°C ± 1°C，发酵培养6天；发酵液经5000 r/min离心10 min，上 清液用于四烯大环内酯类抗生素含量的测定； (5)四烯大环内酯类抗生素的检测 方法：采用SHIMADZU C18色谱柱（150 mmX4.6 mm，5 μπι)，甲醇为流动相A，水为流 动相 Β，梯度洗脱，洗脱程序为 0-30 min，65%-80% A;30-50 min，80%-100% A;50-60 min， 100%-65% Α;流速 LO mL/min，检测波长 305 nm，柱温 30 °C。
[0012] 本发明的有益效果： 一是本发明通过联合抗药性突变株的筛选，获得的突变株合成四烯大环内酯类抗生素 的能力比淀粉酶产色链霉菌D显著提高，这为提高四烯大环内酯类抗生素的产量提供了一 种可靠的方法； 二是本发明提供了一株高产四烯大环内酯类抗生素的淀粉酶产色链霉菌突变株，为今 后四烯大环内酯类抗生素产