专利名称：大环内酯类化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一组具有杀虫和杀螨活性的新的大环内酯类化合物。由于目标生物对目前使用的杀虫剂和杀螨剂迅速产生抗性，所以急需新型的杀虫剂和杀螨剂。节肢动物对杀虫剂的抗性很普遍，至少有400个物种对一种或多种杀虫剂有抗性。对较老的杀虫剂如DDT、氨基甲酸酯类和有机磷酸酯类产生抗性已为人所熟知。但目前甚至对某些比较新的拟除虫菊酯类杀虫剂和杀螨剂也已产生了抗性。因此需要新型的杀虫剂和杀螨剂。
外寄生虫(如蚤、蜱、刺螫蝇等)的防治早已被认为是畜牧业中的一个重要问题。对家畜的传统治疗方法是局部施用杀虫剂，如对绵羊进行的有名的药浴法。实际上，这类治疗法仍在广泛使用。但目前随着研究的深入，已发现了能够给家畜施用尤其是口服的化合物，这些化合物能够在寄生虫摄取治疗家畜的血液时使寄生虫中毒，从而防治外寄生虫。
本发明涉及一种新的命名为“A83543”的发酵产物，它由以下各成分组成A83543A、A83543B、A83543C、A83543D、A83543E、A83543F、A83543G、A83543H和A83543J。A83543及其各种成分可用于防治昆虫，特别是鳞翅目昆虫(如亚热带粘虫)和双翅目昆虫(如丽蝇、厩螫蝇和蚊子)，从而提供了可用的杀虫剂组合物和利用A83543化合物来减少昆虫或螨虫虫口的方法。
本发明的A83543化合物为具有式1的化合物或该化合物在R不为氢时的酸加成盐。
其中，R为H或选自如下基团;
R2为
R2、R3、R5和R6为氢或甲基;R4为甲基或乙基。
从易于制备的角度来看，本发明的优选化合物是这样一些化合物及这些化合物在R不为氢时的酸加成盐，这些化合物中的R、R1、R3、R4、R5和R6取下列组合之一R R1R3R4R5R6(a)MeHEtMeMe(b)MeHEtMeMe(c)MeHEtMeMe(a)MeMeEtMeMe(a)MeHMeMeMe(a)HHEtMeMe(d)MeHEtMeMe(a)MeHEtHMe(a)MeHEtMeHHMeHEtMeMeHMeMeEtMeMeHMeHMeMeMeHHHEtMeMeHMeHEtHMeHMeHEtMeH已证明A83543A中的氨基糖为β-D-福罗糖胺(forosamine);A83543A中的中性糖为α-2，3，4-三-O-甲基鼠李糖。
A83543的九个成分已进行了定性。这些成分为R不为H的式1化合物，它们的结构如下
成分 R R1R3R4R5R6A(a)MeHEtMeMeB(b)MeHEtMeMeC(c)MeHEtMeMeD(a)MeMeEtMeMeE(a)MeHMeMeMeF(a)HHEtMeMeG(d)MeHEtMeMeH(a)MeHEtHMeJ(a)MeHEtMeH可以从A83543的各成分中除去氨基糖而得到假糖苷配基(R＝H的式1化合物)。成分A、B、C和G具有共同的假糖苷配基(A83543A假糖苷配基或假A)。后来发现A83543A假糖苷配基是作为A83543的一个成分而天然产生的。成分D、E、F、H和J各具有独特的假糖苷配基。A83543假糖苷配基具有如下结构假糖苷配基aR1R3R4R5R6A83543AMeHEtMeMeA83543DMeMeEtMeMeA83543EMeHMeMeMeA83543FHHEtMeMeA83543HMeHEtHMeA83543JMeHEtMeHaR＝H这些假糖苷配基可用作(例如)A83543各成分的中间体。
以下几段总结A83543各成分和假糖苷配基的物理性质和光谱性质。在下面的讨论中使用下列缩写EI-MS电子碰撞质谱FAB-MS快速原子轰击质谱FD-MS场解吸质谱HPLC高效液相层析IR红外NMR核磁共振UV紫外A83543A的特性分子量731经验分子式C41H65NO10FD-MS见图4FAB-MS(M+1)实测值732.4706;计算值C41H66NO10＝732.4687(见图8)EI-MS实测值731.4612;计算值731.4608(见
图10)UV(EtOH)λmax243nm(ε8，920)IR(CHCl3)ν(内酯)1713;(共轭酮)1657;C-H振动多重峰在2940cm-1附近，C-O振动多重峰在1060cm-1附近(见图1)〔α〕529D-121.8°(c1.03，CHCl3)(α〕365D+6.8°(c1.03，CHCl3)表Ⅰ总结了用A83543A所观察到的1H和13C NMR数据(在丙酮-d6中)。
表ⅠA83543A在丙酮-d6中的1H和13C NMR根据位置13C1Ha1172.02-233.833.07/2.45348.132.94441.653.485129.125.866129.665.89741.462.15836.501.99/1.349 76.31+4.311037.652.36/1.361146.420.931249.742.8713147.787.0114144.27-15202.46-1647.743.301780.413.531830.331.511921.851.78/1.172034.451.5021 76.24+4.662228.511.48238.970.812415.711.121′96.344.812′77.613.513′81.873.374′82.433.005′68.033.486′17.641.182′-OCH356.66＊3.373′-OCH358.39＊3.414′-OCH360.12 3.451″103.454.452″31.241.92/1.373″18.141.84/1.524″65.342.125″73.353.566″18.871.21N(CH3)240.38 2.22
a某些测定结果由1H/13C相关法取得。
+，＊带有相同上角标的共振值可以互换。
A83543B的特性分子量717经验分子式C40H63NO10FAB-MS(见图9)A83543C的特性分子量703经验分子式C39H61NO10FD-MS(见图5)A83543D的特性分子量745经验分子式C42H67NO10UV(EtOH)λmax244nm(ε9，910)IR(CHCl3)ν(内酯)1708;(共轭酮)1658;C-H振动的多重峰在2940cm-1附近，C-O振动的多重峰在1070cm-1附近(见图2)〔α〕389D-142.9°(c 1.02，CHCl3)〔α〕365D-29.9°(c 1.02，CHCl3)FD-MS见图6表Ⅱ总结了用A83543D(在丙酮-d6中)所观察到的1H和13C NMR数据。
表ⅡA83543D在丙酮-d6中的1H和13C NMR数据位置13C1Ha1172.68-234.383.08/2.43349.012.90442.833.475123.275.546137.26-6-CH320.81 1.74744.412.18835.612.01/1.45976.724.321038.642.37/1.371147.041.021250.052.7813148.477.0414145.19-15203.16-1648.473.301781.033.531830.991.491922.511.78/1.192035.121.492176.844.652229.161.48239.550.812416.321.121′97.114.852′78.333.543′82.583.404′83.153.035′68.713.506′18.261.182′-OCH357.31＊3.403′-OCH359.02＊3.434′-OCH360.71 3.471″104.144.472″31.961.94/1.393″18.831.81/1.494″66.062.125″74.123.556″19.421.20N(CH3)240.99 2.21
a某些测定结果由1H/13C相关法取得。
＊共振值可以互换。
A83543E的特性分子量717经验分子式C40H63NO10FAB-MS(M+1)实测值718.4526;计算值C40H64NO10＝718.4530UV(EtOH)λmax244nm(ε8，600)IR(KBr)(见图13)表Ⅲ总结了用A83543E(在丙酮-d6中)所观察到的1H和13C NMR数据表ⅢA83543E在丙酮-d6中的1H和13C NMR数据位置13C1Ha1172.46-234.953.06/2.40348.882.95442.113.435129.785.866130.395.90742.112.14837.181.96/1.39977.064.331038.312.36/1.361147.180.931250.402.8613148.377.0614144.84-15203.09-
表ⅢA83543E在丙酮-d6中的1H和13C NMR数据(续)位置13C1Ha1648.053.341781.353.551834.981.62/1.481922.251.77/1.132033.731.502172.974.682221.611.1223--2416.521.131′97.114.832′78.363.553′82.553.374′83.133.025′68.723.506′18.261.182′-OCH359.01 3.433′-OCH357.30 3.404′-OCH360.69 3.461″104.244.472″32.001.93/1.393″18.861.82/1.504″66.062.125″74.133.576″19.421.21N(CH3)240.99 2.21a某些测定结果由1H/13C相关法取得。
A83543F的特性分子量717经验分子式C40H63NO10FAB-MS(M+1)实测值718.4534;计算值C40H64NO10＝718.4530UV(EtOH)λmax243nm(ε10，500)和282nm(ε109)
IR(KBr)(见图14)表Ⅳ总结了用A83543F(在丙酮-d6中)所观察到的1H和13C NMR数据表ⅣA83543F在丙酮-d6中的1H和13C NMR数据位置13C1Ha1172.60-234.503.06/2.42348.822.95442.463.455129.565.876130.395.92742.192.16837.181.97/1.35977.154.651038.302.33/1.341146.890.941250.342.8413148.867.0314145.73-15198.68-1645.493.22/2.501774.173.581830.741.521922.411.70/1.172034.451.512177.094.322229.051.48239.560.811′97.194.832′78.383.533′82.583.384′83.153.005′68.743.486′18.251.18
表ⅣA83543F在丙酮-d6中的1H和13C NMR数据(续)位置13C1Ha2′-OCH359.02 3.433′-OCH357.31 3.404′-OCH360.69 3.471″100.194.532″32.411.80/1.383″18.861.83/1.534″66.162.135″74.014.016″19.461.22N(CH3)241.01 2.22a某些测定结果由1H/13C相关法取得。
A83543G的特性分子量731经验分子式C41H65NO10FAB-MS(M+1)实测值732.4661;计算值C41H65NO10＝732.4687UV(EtOH)λmax243nm(ε8，970)IR(KBr)见图15)表Ⅴ总结了用A83543G(在丙酮-d6中)所观察到的1H和13C NMR数据。
表ⅤA83543G在丙酮-d6中的1H和13C NMR数据位置13C1Ha1172.59-234.673.04/2.46348.722.94442.253.505129.855.846130.265.89742.022.14837.121.95/1.34976.994.321038.282.36/1.361147.230.911250.432.8713148.287.0414144.61-15203.20-1647.943.301781.733.571835.201.551921.681.64/1.162031.411.64/1.362176.474.642228.841.48239.610.802415.291.181′96.984.812′78.233.523′82.463.374′83.052.295′68.643.496′17.181.122′-OCH358.97 3.423′-OCH357.25 3.394′-OCH360.70 3.461″99.514.802″29.621.87/1.483″19.311.734″62.132.295″69.934.206″18.221.17N(CH3)243.47 2.24
a某些测定结果由1H/13C相关法取得。
A83543H的特性分子量717经验分子式C40H63NO10UV(EtOH)λmax243nm(ε10，100)＊IR(KBr)见图16＊＊对A83543H∶J(58∶42)混合物的测定结果A83543J的特性分子量717经验分子式C40H63NO10UV(EtOH)λmax243nm(ε10，100)＊IR(CHCl3)见图16＊＊对A83543H∶J(58∶42)混合物的测定结果A83543H和A83543J是作为一种混合物(H∶J＝58∶42)而从A83543中分离出来的，这种混合物可以用如下所述的分析高效液相色谱法(HPLC)进行分离。对A83543H和A83543J所指定的结构，是基于A83543H∶J混合物在丙酮-d6中的1H和13C NMR研究结果。NMR光谱与A83543A的相似，对它们进行了比较。H和J光谱中的主要变化集中在鼠李糖附近。组分H和J在这个糖中只有两个OCH3。在组分H中，H-1′在1HNMR谱中位移约0.1δ，在13C NMR谱中位移3δ(分别为4.81和99.68)。这些位移是由于2′位的甲氧基上没有甲基。组分J的位移类似地相应于3′位的甲氧基上没有甲基。
A83543A假糖苷配基的特性分子量590经验分子式C33H50O9UV(EtOH)λmax243nm(ε10，300)IR(CHCl3)γ(内酯)1724;(共轭酮1652);C-H振动的多重峰在3017cm-1附近;C-O振动的多重峰在1140cm-1附近(见图3)FD-MS见图7EI-MS见图11A83543D假糖苷配基的特性分子量604经验分子式C34H52O9A83543的各成分可以利用下列分析型HPLC系统之一来彼此分离系统Ⅰ柱ODS，3μ，4.5×50mm(IBM)溶剂CH3OH∶CH3CN∶H2O(2∶2∶1)流速1.0ml/分检测245nm处UV温度室温成分保留时间(分)A8.50B6.15C3.92D11.47
系统Ⅱ柱4.6x100mm，ODS(AQ-301，S-5;YMC，Inc.，Mt.Freedom，NJ)溶剂CH3OH∶CH3CN∶0.05%NH4OAc(H2O)(A)35∶35∶30-pH7.8(B)45∶45∶10-pH6.7流速2.0ml/分层析时间35分检测UV，250nm梯度由10%B在20分钟内达到25%B，在30分钟内达到50%B。
成分保留时间(分)A22.62A-假糖苷配基7.27B12.65C10.62D25.47E19.22F16.30G18.92H16.30J17.50系统Ⅲ柱4.6x100mm，ODS(AQ-301，S-5;YMC，Inc.，Mt.Freedom，NJ)
溶剂CH3OH∶CH3CN∶0.05%NH4OAc(H2O)35∶35∶30-pH6.0流速2.0ml/分层析时间10分检测UV，250nm成分保留时间(分)F4.32H3.42J3.42A83543的各成分不溶于水，但溶于诸如甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、乙腈、丙酮等溶剂中。
A83543及其各成分，如A83543A、A83543B、A83543C、A83543D、A83543E、A83543F、A83543G、A83543H、A83543J，都能进行反应生成各种不同的盐。这些化合物的所有这些形式，都是本发明的一部分。A83543的盐类可用于(例如)分离纯化A83543。此外，某些盐在水中的溶解度较高。
A83543的盐类用盐类制备的标准方法来制备。例如，A83543可以用适当的酸来中和生成酸加成盐。
酸加成盐特别有用。有代表性的适宜的盐包括那些与有机酸和无机酸通过标准反应形成的盐，这些酸有例如硫酸、盐酸、磷酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、乳酸、马来酸、富马酸、胆酸、Pamoicacid、粘酸、谷氨酸、樟脑酸、戊二酸、乙醇酸、苯二甲酸、酒石酸、甲酸、月桂酸、硬脂酸、水杨酸、甲磺酸、苯磺酸、山梨酸、苦味酸、苯甲酸、肉桂酸等。
在讨论用途时，术语“A83543化合物”主要指选自A83543、其各成分及其酸加成盐的化合物，这些成分是A83543A、A83543B、A83543C、A83543D、A83543E、A83543F、A83543G、A83543H、A83543J。
发酵产物A83543的生产方法是在深层通气条件下，在适当的培养基中培养新微生物多刺糖多孢菌(SaccharopolysporaSpinosa)的一个菌株，直到产生可回收量的A83543，所述菌株选自NRRL18395、NRRL18537、NRRL18538和NRRL18539或其产生A83543的突变株。熟悉发酵工艺的人员会认识到，A83543中各成分的比例将会有所变化，取决于生产它所用的发酵条件。一般，A83543中含有约85-90%A83543A、约10-15%A83543D，以及少量的A83543B、C、E、F、G、H、J和A83543A假糖苷配基。各成分如A83543A、A83543B、A83543C、A83543D、A83543E、A83543F、A83543G、A83543H、A83543J和A83543A假糖苷配基，可以如下所述进行分离。
因此，本发明的另一方面是一种生产A83543化合物的方法，该方法包括在深层通气发酵条件下，在含有可同化的碳源、氮源和无机盐源的培养基中，培养一个多刺糖多孢菌菌株，直到产生可回收量的A83543，所述菌株选自NRRL18395、NRRL18357、NRRL18538或NRRL18359、或其产生A83543的突变株。然后可利用本领域的已知技术分离各成分。
本发明还涉及一种用生物学方法纯化的多刺糖多孢菌的培养物，该培养物选自NRRL18395、NRRL18537、NRRL18538或NRRL118539、或其产生A83543的突变株。这些微生物可用来生产A83543。
为方便以下的讨论，给这些菌株命名如下A83543.1、A83543.3、A83543.4和A83543.5。培养物A83543.1是由分离自土壤样品的培养物(A83543)经化学突变而得到的，此土壤样品是从维尔京群岛(VirginIslands)采集的。培养物A83543.3、A83543.4和A83543.5则是由A83543.1培养物的衍生物经化学突变得到的。
培养物A83543.1、A83543.3、A83543.4和A83543.5已保藏在中西部北方地区研究中心(MidwestAreaNorthornRegionalResearchCenter，AgriculturalResearchService，UnitedStatesDepartmentofAgriculture，1815NorthUniversityStreet，Peoria，Illinois，61604)的原种培养物收集中心并成为该机构的一部分，公众可以以下列登记号从该机构得到这些培养物。
NRRL编号菌株编号18395A83543.118537A83543.318538A83543.418539A83543.5利利研究实验室(LillyResearchLaboratories)的FrederickP.Mertz进行了培养物A83543.1的分类研究。根据这些研究，微生物A83543.1、A83543.3、A83543.4和A83543.5被归为糖多孢菌属的一个新种中的成员，这个新种称为多刺糖多孢菌。这一分类是基于直接的实验室比较和对已发表的类似物种的描述所作的检索。
所用方法所采取的方法是由InternationalStreptomycesProject(ISP)所推荐的鉴定链霉菌的方法(E.B.Shirling和D.Gottlieb，“鉴定链霉菌的方法”，Int.J.Syst.Bacteriol.16∶313-340，1966)和R.E.Gordon等人所推荐的鉴定诺卡氏菌的方法(R.E.Gordon，D.A.Barnett，J.E.Handerhan和C.H.Pang，“空腔诺卡氏菌、自养诺卡氏菌和诺卡氏菌素菌株”，Int.J.Syst.Bacteriol.24(1)54-63，1974)。
利用ISCC-NBS中心色图(ISCC-NBSCentroidColorCharts)的2106号标准样本(美国商业部国家标准局1958年版)对反面和气生菌丝的颜色进行命名。
利用光学显微镜和扫描电子显微镜(SEM)进行形态学研究。
利用Becker等人(B.Becker，M.P.Lechevalier，R、E.Gordon和H.E.Lechevalier，“利用全细胞水解物的纸色谱法快速鉴别诺卡氏菌和链霉菌”，Appl.Microbiol.12∶421-423，1964)及Lechevalier和Lechevalier(M.P.Lechevalier和H.Lechevalier，“用化学组成作为好氧放线菌的分类标准”，Int.J.Syst.Bacteriol.20435-443，1970)的色谱法，测定全细胞水解物中的二氨基庚二酸(DAP)异构体和碳水化合物。
利用M.P.Lechevalier和H.Lechevalier的方法测定磷脂(见《AuniversityLaboratoryApproach》，Dietz和Thayer编，SocietyforIndustrialMicrobiologySpecialPublicationNo.6，Arlington，VA，227-233页，1980)。
按R.M.Kroppenstedt(见《ChemicalMethodsinBacterialSystematics》，M.Goodfellow和D.E.Minnikin编，173-196页，1985)和M.D.Collins(同上，267-285页)的方法测定甲基萘醌组成。
通过把抗生素敏感性圆片垫在接种的ISP2号琼脂平皿的表面上，测量抗生素抗性。
通过在ISP4号(无机盐-淀粉)琼脂平皿上用碘测试淀粉的存在，测定淀粉水解。
利用HP5898A微生物鉴定系统(见L.Miller和T.Berger，”利用全细胞脂肪酸的气相色谱鉴定细菌”，Hewlett-PackardApplicationNote228-41，第8页，1985)进行脂肪酸分析。
由在相同条件下培养的冷冻干燥全细胞制备脂肪酸甲酯。
主要成分分析是双向的，并且是由计算机进行的。主要成分图(示于图12)中的测量单位为标准差。
利用Minnikin提出的方法测定霉菌酸(D.E.Minnikin，I.G.Hutchinson和A.B.Caldicott，”含霉菌酸细菌的甲醇解产物的薄层色谱”，J.Chromatography188121-233，1980)。
培养特征培养物A83543.1在复合培养基和合成培养基上都生长良好。该培养物在所用的所有培养基上都产生气生菌丝体。气生孢子群的颜色主要为浅黄粉色，但在有几种培养基上为白色。
反面为黄色至黄褐色。没有明显的色素沉着。在某些培养基中有可溶性褐色色素释放到培养基中。
培养特征总结于表Ⅵ。
形态特征培养物A83543.1产生一种伸展的基质菌丝体，此菌丝体在液体发酵过程中分裂。在琼脂培养基上培养该培养物时未观察到分裂现象。
将培养物培养在ISP培养基1上时，观察到圆形白色菌落，直径为8-10mm，中央隆起，反面为黄褐色。
在大多数培养基上都有成形良好的气生菌丝。气生菌丝分隔成以镰刀状和开环状排列的长孢子链。还观察到了螺旋状的菌丝，但它们短而不完整。
一般形态为柔韧直形(Rectus-flexibilis，RA)。
气生菌丝具有独特的珠状外观，孢子链中有许多空格。这一特征说明孢子链是包在一个孢子壳中。这个孢子壳由非常独特的针状物覆盖。这些针状物约1μm长，环绕在末端上。
孢子形状为椭圆形，平均大小约为1.1×1.5μm。孢子链长度大大超过50个孢子。未观察到之字特征、菌核、孢子囊或游动细胞。
生理特征培养物A83543.1由下列碳水化合物产酸阿东糖醇、D-阿拉伯糖、赤藓糖醇、果糖、葡萄糖、甘油、甘露糖醇、甘露糖、核糖和海藻糖。
该培养物不由下列化合物产酸L-阿拉伯糖、纤维二糖、纤维素、糊精、半乳糖醇、乙醇、半乳糖、糖原、肌醇、菊粉、乳糖、麦芽糖、松三糖、蜜二糖、α-甲基-D-葡萄糖苷、棉子糖、L-鼠李糖、水杨苷、山梨糖醇、L-山梨糖、蔗糖、木糖醇或木糖。
用半乳糖、麦芽糖和松三糖观察到生长，但这些碳水化合物不产酸。
培养物A83543.1利用钠盐形式的下列有机酸乙酸、丁酸、柠檬酸、甲酸、乳酸、苹果酸、丙酸、丙酮酸和琥珀酸。该培养物不利用苯甲酸、粘酸、草酸或酒石酸。
A83543.1分解尿囊素、苹果酸钙、酪蛋白、弹性蛋白、马尿酸、次黄嘌呤、睾酮、L-酪氨酸和脲。它不能分解腺嘌呤、七叶苷、鸟嘌呤、淀粉或黄嘌呤。
A83543.1产生过氧化氢酶、磷酸酯酶、脲酶和H2S。它液化明胶并还原硝酸盐。它不能耐受溶菌酶，不能产生类黑素色素。它既不胨化也不水解脱脂乳。A83543.1对NaCl的耐受水平高达11%(包括11%)。它不能在50℃下存活8小时，但能在15°至37℃间的温度下生长。
A83543.1对头孢金素(30μg)、青霉素G(10单位)和利福平(5μg)有抗性。它对下列抗菌素敏感杆菌肽(10单位)、庆大霉素(10μg)、林肯霉素(2μg)、新霉素(30μg)、夹竹桃霉素(15μg)、链霉素(10μg)、四环素(30μg)、托普霉素(10μg)和万古霉素(30μg)。
细胞壁分析水解后的A83543.1全细胞含有内消旋二氨基庚二酸。全细胞提取物中的鉴别糖为半乳糖和阿拉伯糖。因此，A83543.1具有Ⅳ型细胞壁模式和A型糖模式(Lechevalier和Lechevalier，同上)。细胞中不含霉菌酸。
对全细胞所作的磷脂测定表明有磷脂酰胆碱和心磷脂存在。未检测到磷脂酰乙醇胺。因此，A83543.1具有PⅢ型磷脂模式(M.P.Lechevalier，A.E.Stern和H.A.Lechevalier，“放线菌分类学中的磷脂”，见Actinomycetes，Zbl.Bakt.Suppl.11，K.P.Schaal和G.Pulverer编，GustavFischerVerlag，NewYork，1981)。
所检测到的主要甲基萘醌为MK-9(H4)。观察到少量MK-9(H6)。
噬菌体涂布在A83543.1上涂布若干链霉菌、糖多孢菌和Amycolatopsis噬菌体。未观察到噬菌斑。
A83543.1的性质如上所述，培养物A83543.1具有Ⅳ型细胞壁模式和A型全细胞糖模式。下列十三个属具有这种细胞化学模式诺卡氏菌属、红球菌属、棒杆菌属、酪杆菌属(Caseobacter)、分枝杆菌属、小多孢菌属(Faenia)、假诺卡氏菌属、糖单孢菌属、糖多孢菌属、多孢放线菌属(Actinopolyspora)、Amycolata、Amycolatopsis、Kibdelosporangium。这些属的区别在于霉菌酸的存在与否、脂肪酸组成、以及磷脂和甲基萘醌的类型。小多孢菌属、假诺卡氏菌属和糖多孢菌属具有与A83543.1相同的化学分类学特征，但这些属的形态和培养特性与A83543.1不同。
小多孢菌属的孢子光滑，孢子链短，并且气生菌丝和基生菌丝上都带有孢子链。其气生菌丝稀少且为白色。它是一种能在60℃上生长的嗜热菌。A83543.1不具有这些特性，因此它不同于小多孢菌属。
假诺卡氏菌属的气生菌丝和基生菌丝上都有孢子。它可由向顶出芽并且具有芽生孢子来鉴别。它的菌丝具有特征性的之字形态。这种菌丝被描述为分节但无隔的菌丝(见A.Henssen和D.Schafer，“诺卡氏菌属的补充描述和新种多刺假诺卡氏菌的描述”，Int.J.Syst.Bacteriol.21∶29-34，1971)。它的生长很缓慢。没有发酵或很少观察到发酵。这些特性A83543.1都不具有。
糖多孢菌属的特征是有一个孢子壳，且孢子链的外观为独特的珠状。这一特征在A83543.1中非常显著。还观察到了糖多孢菌属的分裂现象。其中的典型菌种硬毛糖多孢菌(S.hirsuta)是从甘蔗渣中分离得到的。从中获得A83543.1的亲本培养物是从糖厂分离得到的。因为A83543.1具有这个属的许多特性，因此被认为是糖多孢菌的一个菌株。
糖多孢菌属中确切发表的种只有红色糖多孢菌和硬毛糖多孢菌。已知的亚种有硬毛糖多孢菌taberi亚种和硬毛糖多孢菌Kobensis亚种。A83543.1不论是气生菌丝和反面颜色还是在产生可溶性色素方面都与上述菌株不同。
根据尽可能多的生化测定结果建立一个相似性系数表，以此来衡量生化相似性。采用了Jaccard系数Sj和简单配合系统Ssm(见W.Kurylowicz，A.Paszkiewicz，W.Woznicka，W.Kurzatkowski和T.Szulga，“链霉菌的数字分类学”，PolishMedicalPublishers，Warsaw，37页，1975)。
表Ⅶ概括了这些相似性系数。
表ⅦA83543.1和糖多孢菌各物种的相似性系数培养物SsmSjA83543.1100100硬毛糖多孢菌taberi亚种6857硬毛糖多孢菌Kobensis亚种6760红色糖多孢菌6354硬毛糖多孢菌5550A83543.1和已知的糖多孢菌的脂肪酸分析表明，它们都具有饱和的支链脂肪酸。A83543.1的脂肪酸组成与其它种相似但不相同。表Ⅷ比较了A83543.1和已知的糖多孢菌的脂肪酸组成。
对表Ⅷ所示的脂肪酸组成进行的主要成分分析显示出很分散的数据，足以提示这些培养物都是同一属内的不同种。表Ⅷ数据的主要成分图示于图12。
表Ⅸ比较了A83543.1与现有的糖多孢菌种和亚种的生理特性。
所做的比较表明，A83543.1与以前描述过的糖多孢菌的不同足以使其成为糖多孢菌的一个新种，对该新种已选用了多刺糖多孢菌的名称。“多刺”这个名字反映了这个物种的多刺孢子外观。
A83543.3、A83543.4和A83543.5菌株由肉眼看来与A83543.1菌株十分相似，足以分类为多刺糖多孢菌的菌株。这四个菌株的不同在于它们产生A83543的量不同。A83543.3菌株产生的A83543约比A83543.1菌株多四倍;A83543.4和A83543.5菌株约比A83543.1菌株多产生八至九倍。
与其它生物的情况一样，本发明的产A83543培养物(即多刺糖多孢菌NRRL18395、NRRL18537、NRRL18538和NRRL18539)仍然易发生变异。因此，可以利用本领域已知的物理和化学方法得到这些菌株的突变株。例如，可以通过用化学药剂如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍处理得到另一些菌株。多刺糖多孢菌NRRL18395、NRRL18537、NRRL18538和NRRL18539菌株的天然突变株和诱变突变株，只要保留了产生可回收量的A83543这样一个特征，就是本发明的一部分。
用来培养多刺糖多孢菌培养物的培养基，可以是多种培养基中的任意一种。但是从生产的经济、产率最佳和产物易于分离的角度看，优选某些培养基。例如，大规模发酵时优选的碳源为葡萄糖和麦芽糖，但也可以使用核糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇，可溶性淀粉，马铃薯糊精、油酸甲酯、油类(如豆油)等。
优选的氮源为棉子粉、胨化牛奶和消化大豆粉，但也可以使用鱼粉粉、玉米浸液、酵母膏、酶解酪蛋白、牛肉膏等。
可掺入培养基中的营养无机盐有能够产生下列离子的常规可溶性盐锌离子、钠离子、镁离子、钙离子、铵离子、氯离子、碳酸根离子、硫酸根离子、硝酸根离子等。
培养基中还应含有微生物生长发育所需的必需微量元素。这些微量元素一般作为杂质存在于培养基的其他组成成分中，其含量足以满足微生物的生长需要。
如果有发泡问题，通常可将少量(即0.2ml/l)防泡剂(如聚丙二醇)加到大规模发酵培养基中。但在产A83543培养物的情况下，常规消泡剂抑制A83543的生产。可以在培养基中加入豆油或PluronicL-101(BASF)(1-3%)控制发泡。如果出现发泡可再加入一些油。
特定A83543成分的百分比会由于更换培养基而变化。例如，加入缬氨酸或异丁酸或丙酸能提高产生A83543D的百分比。
对大量生产A83543来说，优选在搅拌的生物反应器中进行深层通气发酵。少量A83543可通过摇瓶培养获得。由于用孢子形式的微生物接种大生物反应器通常会造成生产时滞，因此最好使用营养接种物。营养接种物的制备方法是，用孢子形式的微生物或微生物的菌丝体碎片接种少量培养基，得到新鲜的、旺盛生长的微生物培养物。然后将营养接种物移入更大的生物反应器中。营养接种物培养基可以与大规模发酵所用的培养基相同，但其他培养基也适用。
A83543是由产A83543生物体在约24°-33℃的温度下培养时所产生的。生产A83543的最适温度似乎为约28-30℃。
正如深层通气培养工艺中所常见的那样，将无菌空气从容器底部通入容器中，同时培养基用常规涡轮式叶轮搅拌。通气速度和搅拌速度一般应维持溶解氧的水平在空气饱和的35%或35%以上，最好为50%或50%以上，而容器的内压为0.34大气压。
发酵过程中可以通过测试培养液的提取液来监视A83543各成分的产生。实例1所述的HPLC系统是可用于此目的的一种分析方法。
在深层通气发酵条件下产生A83543各成分后，可以利用本领域所用的一些方法从发酵培养基中回收这些成分。在产A83543微生物的发酵过程中产生的A83543，既存在于菌丝体中，也存在于培养液中。A83543看来是亲脂性的。因此，如果在发酵中使用大量的油，则全培养液的提取较为有效。如果只使用少量的油，则大部分A83543在菌丝体中。在这种情况下，先过滤培养基而从菌丝体群(生物量)中分离出培养液，这样回收A83543更为有效。
可以利用多种技术从生物量中回收A83543。一种优选的技术包括用水洗涤分离出的生物量，除去剩余的培养液，将生物量与A83543可溶于其中的溶剂(如甲醇或丙酮)混合，分离并浓缩溶剂，用非极性溶剂提取浓缩物，并且/或者将浓缩物吸附到反相硅胶吸附剂(如RP-C8或RP-C18或象HP-20这样的高度多孔聚合物等)上。
用适当的溶剂(如含少量THF的乙腈甲醇混合物)从吸附剂上洗脱出活性物质。
A83543可以用类似方法分成下列各成分A83543A、A83543B、A83543C、A83543D、A83543E、A83543F、A83543G、A83543H、A83543J、A83543假糖苷配基。优选的分离方法包括反相硅胶(C18或C8)色谱。
培养物固体(包括培养基组成成分和菌丝体)也可以不经提取或分离而作为A83543的来源使用，但最好在除水后使用。例如，在产生A83543后，可以通过冷冻干燥、圆筒烘干、或共沸蒸馏并干燥而使全发酵培养液干燥。然后，干燥的培养液就可以直接使用，例如直接将其混入饲料预混物。
杀虫和杀螨活性本发明的化合物可用于防治昆虫和螨虫。因此，本发明还涉及抑制昆虫或螨虫的方法，该方法包括向昆虫或螨虫地点施用抑制昆虫或抑制螨虫量的A83543化合物。
A83543化合物对一些昆虫和螨虫显示出活性。更具体地说，这些化合物对亚热带粘虫显示出活性，这是一种属于鳞翅目的昆虫。这个目中的典型昆虫有苹果蠹蛾、地老虎、衣蛾、印度谷螟、卷叶虫、棉铃虫、美洲棉铃虫、欧洲玉米螟、菜粉蝶、粉纹夜蛾、棉红铃虫、袋蛾、美洲天幕毛虫、草螟、草地粘虫。
这些化合物还对棉蚜显示出活性，棉蚜是一种属于同翅目的昆虫。同翅目的其他昆虫包括叶蝉、飞虱、梨黄木虱、苹木虱、蚧、粉虱、沫蝉，以及一些其他宿主特异性蚜虫。
此外，A83543化合物对厩蝇、丽蝇和蚊子显示出活性，这些昆虫属于双翅目。这个目中的另一个典型昆虫是常见的家蝇。
A83543化合物可用于减少昆虫和螨虫的虫口，因而可用于一种抑制昆虫或螨虫虫口的方法中，该方法包括向昆虫或螨虫地点施用有效抑制昆虫或螨虫量的A83543化合物。
昆虫或螨虫的“地点”指昆虫或螨虫居住的环境或它们的卵所在的环境，包括它们周围的空气、它们摄食的食物、或它们接触的物体等。例如，防治摄食植物的昆虫或螨虫时，可将活性化合物施用于植物中昆虫或螨虫摄食或栖息的部分，特别是叶簇。
这些化合物被认为还可用于保护纺织品、纸张、贮存谷物或种子，方法是将活性化合物施用于这些物质。
术语“抑制昆虫或螨虫”指活昆虫或螨虫数目的减少或指活昆虫卵或螨虫卵数目的减少。当然，由某种化合物造成的这种减少的程度，取决于化合物的施用率、所用的特定化合物以及目标昆虫或螨虫的种属。至少应使用抑制昆虫或抑制螨虫的量。
术语“抑制昆虫的量”和“抑制螨虫的量”，用来描述足以使所处理的昆虫或螨虫虫口可测减少的量。一般使用的活性化合物量在约1-1000ppm(或0.01-1千克/公顷)的范围内。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种抑制鳞翅目敏感昆虫的方法，该方法包括给植物施用有效抑制昆虫量的本发明的A83543化合物。
本发明的另一个优选实施方案涉及一种抑制家畜中的双翅目刺螫蝇的方法，该方法包括给家畜口服或非肠施用有效抑制害虫量的A83543化合物。
螨虫/昆虫筛选以下列螨虫/昆虫筛选试验测试A83543化合物的杀螨和杀昆虫活性。
配制每个试验化合物时，都是将化合物溶于每升含23g“ToximulR”(磺酸盐/非离子型乳化剂混合物)和13g“ToximulS”(磺酸盐/非离子型乳化剂混合物)的丙酮/乙醇(1∶1)混合物中。然后将这些混合物用水稀释而得到指定的浓度。
在南瓜子叶上放入棉叶螨和棉蚜，使它们在叶片的两面生长繁殖。使同一花盆中的其它植株不受侵染。然后使用DeVilbiss自动喷雾器在10英磅/平方英寸压力下以5ml试验溶液对叶片喷雾。覆盖叶片的两面直到发生径流，然后使其干燥1小时。然后剪下两个未受侵染的叶片放入装有亚热带粘虫的培养皿中。
用类似的制剂和方法评定另一些昆虫，但具有指出的一些不同之处。
在标准接触期后，评定死亡百分率。结果示于下表。使用了下列缩写术语昆虫/螨虫学名BW墨西哥棉铃象AnthonomusgrandisCA棉蚜AphisgossypiiCBW谷实夜蛾HeliothiszeaCLH玉米黄翅叶蝉DalbulusmaidisCRW黄瓜十一星叶甲食根亚种Diabroticaundecim-punctatahowardiSAW亚热带粘虫SpodopteraeridaniaSM棉叶螨Tetranychusurticae表ⅩA83543A对新生CBW幼虫的活性处理天数a施用率(ppm) %抑制b局部c1 1.00 20.005.00100.0010.00100.0050.00100.00100.00100.00
表ⅩA83543A对新生CBW幼虫的活性(续)处理天数a施用率(ppm) %抑制b饲料d4 1.00 30.005.00100.0010.00100.0050.00100.00100.00100.00卵e6 10.00 0.0050.000.00100.0030.00局部c1 0.50 10.001.0040.005.0080.0010.00100.0050.00100.00100.0070.00饲料30.5015.001.0045.005.00100.0010.00100.0050.00100.00
a处理和观察之间的天数b两次平行试验的平均值c用1ml配好的A83543A处理d饲料用A83543A进行表面处理，使其干燥并侵染e虫卵用A83543A局部处理后保持到对照卵完全孵化表ⅪA83543各成分对新生CBW幼虫的控制百分比1PPM成分20.5 1 5 10A55(d)100(a)100(a)100(a)B35(e)80(c)100(a)100(a)C5(g)85(bc)93(bc)100(a)D58(d)90(ac)100(a)100(a)E28(ef)58(d)100(a)100(a)F0(g)0(g)0(g)95(ab)G0(g)0(g)20(f)80(c)1)括号中字母相同的处理在0.05水平上相似。
2)用局部吸管法作4次平行试验，每次20只幼虫;处理和观察间隔一天。
表ⅫA83543A对SAW幼虫的活性虫期处理天数a施用率(ppm) %抑制b新生叶片/矮31.0010.00菜豆c5.00 40.0010.00100.0050.00100.00100.00100.00新生局部d3 1.00 0.005.0060.0010.00100.0050.00100.00100.00100.00新生叶片/矮40.500.00菜豆e1.00 66.675.00100.0010.00100.0050.00100.00二龄局部d1 1.00 0.005.000.0010.000.0050.0080.00100.00100.00二龄叶片/矮41.000.00菜豆d5.00 0.0010.0080.0050.0080.00100.00100.00三龄局部e2 1.00 0.005.000.0010.0013.3350.0073.33三龄叶片/矮40.500.00菜豆e1.00 0.005.0040.0010.00100.0050.00100.00
表ⅫA83543A对SAW幼虫的活性(续)虫期处理天数a施用率(ppm) %抑制b五龄局部e2 10.00 0.0050.000.00五龄叶片/矮菜豆e4 10.00 0.0050.000.00a处理和观察间的天数b平行试验的平均值c一次试验d两次平行试验e三次平行试验f用1ml配好的A83543A局部处理表ⅩⅢA83543A对BW成虫的活性处理施用率(ppm) %抑制a局部b1.00 0.005.0020.0010.0020.0050.00100.00100.00100.00a一次试验;处理3天后观察b配好的A83543A(1ml)倒在培养皿中的成虫上表ⅩⅣA83543A在温室试验中对各种作物害虫的活性作物害虫施用率(ppm) 抑制a玉米CRW3010015507.5103.750南瓜SAW25010012510062.510031.255515.63407.8203.9201.90南瓜SM250701254062.52031.250南瓜CA1000500玉米CLH2009010030500矮菜豆SAW1001005080254012.50矮菜豆SM1001005080253012.5106.250
作物害虫施用率(ppm) 抑制a南瓜CA100805040250玉米CRW63030表ⅩⅤ比较了在室外花盆试验中A83543A处理与灭多虫处理对亚热带粘虫的有效性和持久性。
表ⅩⅤ室外花盆试验中A83543对亚热带粘虫的效力处理后天数a施用率处理(ppm)15714A83543A6310088905A83543A125100889590A83543A25010095100100A83543A500100100100100灭多虫6310020150灭多虫125100354020灭多虫250100854540灭多虫500100908560无00000无00000
a结果以死亡百分率给出表ⅩⅥ概括了A83543A与已知杀虫剂灭多虫比较所显示出的LC50，即试验化合物显示出对50%的试验昆虫或螨虫致死时的浓度。
表ⅩⅥA83543的LC50aLC50(ppm)目标害虫A83543灭多虫CRW156燕麦长管蚜＞2505.4SM15071.4SAW/叶片1.311.4CBW/接触0.614.5a黄瓜十一星叶甲食根亚种的土壤施用率以重量表示;其余均为喷雾浓度。
在标准体外杀蚊卵试验中，A83543各成分对埃及伊蚊有活性。表ⅩⅦ和表ⅩⅧ概括了各成分在这些试验中的活性。
表ⅩⅦA83543B和A83543C对一龄期蚊幼虫的体外活性A83543成分最小抑制浓度(μg/ml)aA 0.016，0.031bB0.016C0.031a24小时后显示出100%抑制的最低浓度(在微量滴定板上)b对两组进行的试验表ⅩⅧA83543各成分对四龄期蚊幼虫的活性a成分控制百分比aA 60，70bB60C60D30E80F0G0a以0.312ppm处理24小时后的结果b两次试验的结果大田试验以大田试验评定A83543A。在这些试验中，A83543A对花茎甘蓝上的菜粉蝶和粉蚊夜蛾以及大豆上的大豆夜蛾(75%)和草地粘虫(25%)混合害虫显示出活性。
杀虫剂组合物本发明的化合物以组合物形式施用，这些组合物也是本发明的一部分。这些组合物含有抑制昆虫或抑制螨虫量的一种A83543化合物和一种植物学上可接受的惰性载体。活性成分(即A83543化合物)的存在形式可以是1)单一的A83543成分;2)两个或更多个成分的混合物;3)分离后的A83543混合物;4)A83543加上产生A83543之发酵培养基的干燥部分，即干燥的粗发酵液。
这些组合物既有可分散于水中施用的浓缩制剂，也有无需进一步处理即可施用的粉剂或粒剂。
这些组合物按农化领域的常规方法和配方制备，但这些方法和配方是新颖而重要的，因为涉及到一种或多种本发明化合物。
最常见的加入有化合物或干燥粗品的分散体是由化合物或粗品的浓缩制剂制备的水悬浮剂或乳剂。这类水溶性、水分散性或可乳化的制剂为固体(通常称为可湿性粉剂)或液体(通常称为乳油或水悬剂)。
可以压制成水分散性颗粒的可湿性粉剂，含有活性化合物、惰性载体和表面活性剂的紧密混合物。活性化合物的浓度通常为约1%(最好为10%)至约90%(重量)。惰性载体通常选自硅镁土、蒙脱土、硅藻土或纯化硅酸盐。
占可湿性粉剂约0.5%至10%的有效表面活性剂选自磺化木素、稠合萘磺酸盐、萘磺酸盐、磺基苯磺酸盐、烷基硫酸盐以及非离子型表面活性剂(如烷基酚的环氧乙烷加合物)。
这些化合物的乳油浓缩剂含有方便浓度的溶解于一种惰性载体中的化合物，例如每升液体约50-500克(相当于约10-50%)，惰性载体为一种可与水互溶的溶剂或与水不互溶的有机溶剂与乳化剂的混合物。
可用的有机溶剂包括芳香族化合物(尤其是二甲苯)和若干石油馏分(尤其是石油的高沸点萘部分和烯烃部分如重芳香石脑油)。也可使用其他有机溶剂，例如萜烯类溶剂(包括松香衍生物)、脂肪族酮类(如环乙酮)和复合醇类(如2-乙氧基乙醇)。
适应于乳油浓缩剂的乳化剂选自常规的非离子型表面活性剂，例如上述的表面活性剂。
水悬浮剂包括本发明的水溶性化合物，它以约5%-50%(重量)的浓度分散于含水载体中而形成悬浮剂。这些悬浮剂的制备方法是将化合物细磨，将其充分混入由水和表面活性剂(选自上述同一类型)组成的载体中。还可以加入惰性成分如无机盐和合成或天然树胶，以提高含水载体的密度和粘度。同时进行化合物的研磨和混合常常是最有效的，即先制出含水混合物，然后用一种工具如砂磨、球磨或活塞式均化器使其均化。
这些化合物还可以作为颗粒组合物施用，这特别适用于土壤施用。颗粒组合物通常含有约0.5%-10%(重量)的化合物，该化合物分散于一种惰性载体中，此载体全部或大部分由粘土或类似的廉价物质组成。
制备这些组合物的通常方法是将化合物溶于适当的溶剂中，然后将其加到已预成型至适当粒度(在约0.5-3mm范围内)的颗粒载体中。配制这些组合物时还可以先制出载体和化合物的面团状物或糊状物，然后粉碎并干燥而得到要求的颗粒粒度。
含化合物的粉剂的简单制备方法是使粉末形式的化合物与适当的粉状农用载体紧密混合，适当的载体有高岭土、粉末火山岩等。粉剂可以适当地含有约1%至10%的化合物。
当由于任何原因而需要时，同样可以使化合物以适当的有机溶剂的溶液形式进行施用。这种溶剂通常是广泛用于农业化学的温和石油产品，如喷雾油。
杀虫剂和杀螨剂通常是以活性成分在液体载体中的分散体形式施用。习惯上以载体中的活性成分浓度表示施用率。最广泛使用的载体是水。
本发明化合物还可以以气雾剂组合物的形式施用。在这类组合物中，活性化合物溶解或分散于一个惰性载体中，此载体是一种产生压力的推进剂混合物。气雾剂组合物包装在容器内，混合物通过一个雾化阀而从该容器中放出。推进剂混合物含有可与有机溶剂混合的低沸点卤化碳类或用惰性气体或气态烃类加压的水悬浮液。
施用于昆虫或螨虫地点的化合物的实际量并不重要，并且易于由本领域专业人员参考所提供的实例来确定。一般来说，浓度为10ppm至5000ppm的化合物可望产生良好的控制效果。对许多化合物来说，浓度为100-1000ppm就足够了。对大田作物如大豆和棉花来说，合适的化合物施用率约为0.01至1千克/公顷，一般以5-50加仑/英亩的喷雾剂施用。
施用化合物的地点可以是昆虫或螨虫栖息的任何地点，例如蔬菜作物、果树和坚果树、葡萄树和观赏植物。
由于螨虫卵具有抵御毒物作用的特殊能力，所以可能需要反复施药以控制新羽化的幼虫，正如其他已知的杀螨剂那样。
杀外寄生虫活性A83543化合物还对双翅目昆虫有活性。
表ⅩⅨ-ⅩⅪ概括了A83543A和A83543D的体外实验结果。
表ⅩⅨA83543A对黑丽蝇幼虫的体外效力剂量水平(ppm) 活性1100100501002510010100510021001950.5600.25251活性＝%死亡率表ⅩⅩA83543A对厩螫蝇成虫的体外效力剂量水平24小时48小时(ppm) 活性1活性11001001005010010025100100101009058010027090110600.50101活性＝%死亡率
在体内试验中，A83543化合物在豚鼠和绵羊体内对丽蝇幼虫和厩螫蝇成虫显示出内吸杀虫活性，而没有明显的毒性迹象。为测定活性范围，已在实验室和目标动物中测试有代表的化合物A83543A和A83543D。下列试验是说明性的。
豚鼠内吸试验本试验体系中使用成年豚鼠。将需测试的化合物溶于聚乙烯吡咯烷酮水溶液或聚乙二醇200中，口服或腹腔注射适量溶液。使用如下表所给出的各种剂量的化合物。
除标明者外，在30分钟时从豚鼠体内取血并离心血样。将牙线用血清浸湿，然后放在培养皿中与厩螫蝇成中接触;丽蝇幼虫暴露在试管中。24小时和48小时后，检查昆虫并计数死亡数。试验结果记为被杀死昆虫的百分率。
绵羊内吸试验用上面豚鼠试验中所述的方法在绵羊体内进行试验。通过腹腔或静脉注射或经瘤胃服用试验化合物;在这些试验中于24小时时取血样。
用A83543A和A83543D进行的豚鼠和绵羊内吸试验的结果概括括于表ⅩⅫ-ⅩⅩⅤ。
在用50毫克/千克体重的单次腹腔内或瘤胃剂量处理的绵羊体内，或者在用肠内线虫Nematospiroidesdubius实验感染并以500mg/kg的剂量单次管饲口服的小鼠体内，A83543A未显示出驱肠虫活性。
在对绵羊肠内捻转血矛线虫所做的试验中，A83543A在100ppm的浓度下杀死30%的蠕虫。
杀外寄生虫方法因此，本发明还涉及一种控制消耗宿主动物血液的昆虫外寄生虫虫口的方法，该方法包括给宿主动物施用有效量的A83543化合物。昆虫外寄生虫包括昆虫和蜱螨类寄生虫。可以采用经皮、经口或肠胃外途径给动物施用药物。
寄生昆虫或蜱螨包括那些吸血的及食肉的、并且在其全部生活史或仅在部分生活史中(如仅在幼虫或仅在成虫期)为寄生性的物种。有代表性的物种包括下列物种虻厩螫蝇墨蚊驴血虱疥螨马痒螨西方角蝇牛羽虱牛血虱犊毛虱采采蝇牛蠕形螨微小牛蜱和清色牛蜱海湾花蜱美洲花蜱耳残喙蜱安氏革蜱旋丽蝇猎蝽蚊具尾扇头蜱非洲红蜱(Rhipicephalusevertsi)斑点蜱璃眼蜱猪血虱穿皮潜蚤绵羊毛虱羊足毛虱羊蜱蝇羊痒螨丝光绿蝇伏蝇次生旋丽蝇铜绿蝇温带臭虫禽角头蚤波斯锐缘蜱鸡皮刺螨鳞脚螨鸡脚螨狗蠕形螨犬栉首蚤变异革蜱血红扇头蜱本发明的方法可用于防护经济动物和伴生动物的外寄生虫。例如，可以有益地将化合物用于马、牛、绵羊、猪、山羊、狗、猫等，以及某些外地动物如骆驼、美洲驼、鹿以及俗称野生动物的其他物种。可以有益地将化合物用于家禽和其他鸟类，如火鸡、鸡、鸭等。该方法优选应用于经济动物，最优选的是应用于牛和绵羊。
有效施用的施用率、定时和方式，将随着寄生虫的种类、杀寄生虫作用的程度和其他因素的不同而有很大的变化。可在宿主的整个寿命中定期施用，也可以只在寄生虫侵袭的高峰季节施用。一般说来，局部施用含约0.00005-95.0%化合物(优选0.00005-5%，最优0.00005-1%化合物)的液体制剂，即可达到防治外寄生虫的目的。服用剂量为约5-100mg/kg时即可达到有效的寄生虫防治作用。
这些化合物以常规兽医操作应用于宿主动物。通常将化合物配制成含有化合物和生理上可接受载体的杀外寄生虫组合物。例如，可以简单地把液体组合物喷到需进行杀外寄生虫防治的动物身上。这些动物也可以利用象背部橡胶这样的装置进行自我治疗，这类装置可以把毒性化合物包在一块布中(例如动物可以沿着它行走而与其接触)。也可应用药浴槽给宿主动物施用活性物质。
这些化合物显示出内吸杀外寄生虫活性。这些化合物对于已服用一种化合物的宿主动物具有渗入该宿主动物的组织的能力，因而便杀死消耗宿主动物血液或其他活组织的昆虫寄生虫。这些化合物可以以经表皮、经口或经皮下途径施用。
本发明还涉及含有生理上可接受的惰性载体和一种A83543化合物的杀外寄生虫组合物。这些化合物可以用本领域已知方法制备，例如把化合物溶于一种生理上可接受的佐剂或稀释剂中。进行口服时可将化合物混入动物的饲料或饮用水中，或者服用象片剂、胶囊、丸剂或埋植物这样的剂型。经皮服用时可以方便地皮下注射、腹腔注射或静脉注射可注射的制剂。
这些化合物可以配制成供口服施用的通常剂型，如灌药、片剂或胶囊。当然，这些组合物要求有口服用惰性载体。这些化合物还可以配成注射液或悬浮液，供皮下注射、皮内注射、瘤胃内注射、腹腔内注射、肌肉注射或静脉注射用。在某些应用中，把化合物方便地配制成标准动物饲料的一个成分。在这个具体方案中，通常是先把该化合物配成一种预混物，其中的化合物分散于液体或颗粒固体载体中。该预混物可含有每磅约2-250克的化合物。再把预混物利用通常的混合方法配成最终饲料。
由于在宿主动物寿命的大部分时间内一般都发生外寄生虫侵袭，所以最好以这样的形式服用本发明化合物，以便能在一段时间内提供缓释作用。常规方法包括使用一种在物理上抑制溶解的基质，其中基质是一种蜡状半固体如植物蜡或高分子量聚乙二醇。服用化合物的一种良好方式是采用持续作用的丸剂，例如Laby(美国专利4，251，506)和Simpson(英国专利2，059，767)的丸剂。对这样一种丸剂来说，可将化合物包囊在一种聚合物基质中，如Nevin所述的基质(美国专利4，273，920)。还可以使用植入物如含硅氧烷橡胶植入物来达到本发明化合物的缓释。
为更充分地说明本发明的实施，给出下列实例实例1A83543HPLC分析方法下列分析型HPLC方法可用来监测生产A83543的发酵过程离心全发酵液样品，倾析除去上清液。在生物量中加入足量甲醇，使样品达到原有体积，混合后使混合物放置至少15分钟。离心并用0.45μ滤器过滤上清液。
也可以用乙腈(1∶4发酵液∶溶剂)或丙酮提取全发酵液。
HPLC系统柱载体8-x 100-mm柱，硅胶-4μ圆形C18(Nova C18，Waters)流动相CH3CN/MeOH/H2O(45/45/10)，含0.05%乙酸铵流速4ml/分检测250nm紫外保留时间A835433.6-3.7分A83543D4.4-4.5分实例2用培养物83543.1制备A83543A.摇瓶发酵使用冰冻干燥块形式或保存在液氮中的悬浮液形式的培养物多刺糖多孢菌NRRL18395，接种组成为A或B的营养培养基(对大规模生产来说优选培养基B)营养培养基A成分量(%)胰豆解酪蛋白大豆肉汤＊3.0酵母膏0.3MgSO4·7H2O 0.2葡萄糖0.5麦芽糖0.4去离子水加至1升未调pH＊Baltimore Biological Laboratories营养培养基B成分量(%)酶解酪蛋白＊3.0酵母膏0.3MgSO4·7H2O 0.2葡萄糖1.0去离子水加至1升pH6.2，用NaOH调至6.5＊NZ AmineA，Sheffield Products，P.O.Box 638 Norwich，NY13815可以在营养种子培养基A或B中加入2.5%琼脂而制得斜面或平板。接种的斜面在30℃下培养约10至14天。用无菌工具刮成熟的斜面培养物使孢子松动，除去并离析菌丝簇。用所得到的松动孢子和培养物的约四分之一来接种50ml第一级营养种子培养基。也可以由液氮安瓿来接种第一级培养基。
培养物保存在液氮中时，用等体积的营养培养物(30℃下培养48-72小时)和悬浮培养基制备安瓿。悬浮培养基中含有乳糖(100g)、甘油(200ml)和去离子水(加至1升)。
用一个液氮安瓿接种装在500ml锥形瓶中的100ml营养培养基(或装在250ml锥形瓶中的50ml培养基)。在以250rpm绕2英寸(5.08cm)圆周旋转的摇床上将培养物于30℃下培养48小时。
用培养后的培养物(5%V/V接种物)接种100ml具有下列组成的生产培养基。
生产培养基Ⅰ成分量(%)葡萄糖4部分酶解的植物蛋白＊1.5-3棉子粉＊＊1.0CaCO3(试剂级或技术级) 0.3豆油1.0自来水加至1升(用NaOH调灭菌前的pH至7.0)＊Sheftone H，Sheffield Products＊＊Proflo，Traders Protein，P.O.Box8407，Memphis，TN38108在以250rpm绕2英寸圆周旋转的摇床上，将接种后的生产培养基于28-30℃下在500ml锥形瓶中培养6至8天。
B.搅拌生物反应器发酵为得到较大量的接种物，用如A节所述制备的10ml培养后的第一级培养基，接种400ml与第一级营养培养基组成相同的第二级营养培养基。在以250rpm绕2英寸圆周旋转的摇床上，将这个第二级培养基在2升广口锥形瓶中于30℃下培养约48小时。
用如此制备的培养后的第二级营养培养基(2升)，接种80至115升如A节所述制备的无菌生产培养基。如果需要，再加一些豆油控制起泡。
使培养后的生产培养基在165升搅拌生物反应器中于28℃下发酵5至8天。搅拌容器中的气流和搅拌器速度由计算机控制，使溶解氧的水平保持在50%空气饱和度或50%以上。
实例3A83543A、B、C和D的分离用助滤剂(1%Hyflo)过滤如实例2所述制备的发酵液(225升)，用水(～50升)洗涤分离出的生物量。然后用甲醇(～100升)搅拌生物量约1小时并过滤。
将甲醇滤液浓缩至体积约为1升。将浓缩液用乙醚提取3次(每次1升)。合并乙醚提取液并浓缩至体积约为200ml。
在硅胶柱(RP-8Lobar，B号，E.M.工业公司的E.M.Science分部出品)上层析一部分浓缩液(8ml)。
重复此操作共12次。以“Autoprep”方式进行制备型层析的仪器安装和操作步骤如下所述完整的“Autoprep”HPLC系统由三个RaininRabbitHPX泵、一个压力舱、一个Gilson 20 1B型HPLC部分收集器、一个ISCO-V4吸收检测器和一个Apple Macintosl、Plus计算机组成。完整系统按Rainin Instrument Combany公司的Dynamax HPLC Method Manager手册中给出的说明排列。“Autoprep”HPLC的配置利用了系统自动化的优点，使得制备性分离能够以实际上相同的条件重复进行并得到实际上相同的结果。从多次操作中收集并合并相应部分即可达到层析容量而无需大层析柱。
在恒溶剂方式中使用流速为8.0ml/分的两种溶剂混合物(A)和(B)。
溶剂体系溶剂量ABCH3OH 95 100CH3CN 95 100H2O 10 -所用的恒溶剂混合物含60%的溶剂B。
每次循环的层析时间为28.0分。弃去每次层析前16分钟的流出液。后面的流出液分6个部分收集，每部分2分钟(16ml)。
自动合并12次循环中每次循环的相应部分，得到6个最终部分(色谱切割组分)。
通过分析每个最终部分对蚊幼虫的活性并通过分析型HPLC，测定是否存在活性A83543化合物。
然后按活性和HPLC图谱合并活性部分，利用相同的“Autoprep”HPLC和溶剂体系但用装填有8μC-18反相硅胶的高分辨率21.4mm×25cm制备柱(Rainin Dynamax)，进行进一步纯化而得到A83543成分A、B、C和D。成分A和D从CH3OH/H2O中结晶出来。
A83543C的FD-MS示于图5;A83543B的FAB-MS示于图9。
实例4A83543A和D的纯化如实例2A节所述制备发酵液(10升)，不同之处是1)在1升锥形瓶中使用200ml生产培养基;2)生产培养基中不加豆油;3)在30℃下培养4-6天。过滤培养液。弃去滤液，此滤液中每ml含4μgA83543A，但不含可检测量的A83543B、C或D。
用水洗涤生物量，用甲醇提取1小时。提取液(7升)中含有72μgA83543A/ml和7μgA83543D/ml。
将甲醇提取液浓缩至体积为5升，将其加到含水(2升)的HP-20树脂(150ml，日本三菱化学工业公司)中。将此混合物搅拌1小时。
然后将HP-20树脂混合物置于玻璃柱中。初始流出液和使用甲醇∶水(1∶1，1升)的洗出液没有活性。使用甲醇∶水(7∶3，1升)的第二洗出液含有微量A83543A。使用甲醇(1升)的后续洗出液含有A83543A和A83543D活性。
浓缩甲醇洗出液，并与由其他操作得到的2个类似部分合并，并浓缩至干。将残渣溶于75ml甲醇∶THF(4∶1)中，将其加到10倍体积的乙腈中进行沉淀。过滤混合物，将滤液浓缩至干。
将残渣溶于甲醇(25ml)中，加到用甲醇制备的5.5×90cmLH-20Sephadex(PharmaciaLKBBiotechnologyInc.，U.S.A.)柱中，用实例1所述的HPLC方法收集并分析125个25ml部分。
合并含有所要化合物的部分并浓缩。将残渣溶于甲醇(10ml)中，加至装填有8μC-18反相硅胶(RaininDynamax)的41.1mm×25cm制备柱中。
该柱用甲醇∶乙腈∶水(37.5∶37.5∶25)老化。加样后，该柱用下列溶剂的180分钟线性梯度展开溶剂体系溶剂量(ml)ABCH3OH 37.5 45CH3CN 37.5 45H2O 25 10使用该梯度从100%A层析至100%B，以25ml为一部分收集。
合并含A83543A的部分，浓缩至干，溶于叔丁醇(5ml)中，冰冻干燥后得到778mg纯化的A83543A。
A83543A在CHCl3中的红外光谱示于图1。A83543A的FD-MS谱示于图4;A83543A的FAB-MS谱示于图8〔FAB分散剂为二硫苏糖醇∶二硫赤藓糖醇(5∶1)〕;A83543A的EI-MS谱示于图10。
将含A83543D的部分与得自6个类似分离操作的含D部分合并，浓缩后如上述用相同的层析柱但用不同的溶剂进行层析。该柱用甲醇∶乙腈∶水(40∶40∶20)老化。以180分钟线性梯度操作展开该柱所用的溶剂为
溶剂体系溶剂量(ml)ABCH3OH 40 95CH3CN 40 95H2O 20 10合并含A83543D的部分并浓缩。将残渣溶于叔丁醇(5ml)中并冰冻干燥，得212mgA83543D。
A83543D在CHCl3中的红外光谱示于图2;A83543D的FD-MS光谱示于图6。
实例5A83543成分E、F、G、H、J和A假糖苷配基的分离如实例4所述，处理用类似于实例2的方法制备的发酵液(8升)。将得自LH-20Sephadex柱的含有所要化合物的部分，与得自类似发酵操作的相应部分合并。由于E、F、G、H、J和A假糖苷配基各成分产生的量很小，所以需要多次发酵才能得到足以供进一纯化的量。
如实例4所述，将以此方式制备并含有约1.6g固体物质的少量成分合并液，加到装填8μ C-18反相硅胶(ODS)的HPLC柱(Rainin Dynamax)中。该柱用CH3OH∶CH3CN∶H2O(75∶75∶50)老化，用下列溶剂体系从100%溶剂(A)到50%(B)进行梯度操作
溶剂体系溶剂量(%)ABCH3OH 75 95CH3CN 75 95H2O 50 10以25ml为一部分收集。合并下列部分合并液部分1.31-44245-63364-69470-80581-1306131-160取一部分合并液5(100ml)浓缩得到残渣，将其溶于甲醇(1ml)中，如实例3所述加到21.4×250mmHPLC柱(RaininDynamax)中。该柱用下列溶剂体系中的溶剂体系(A)老化溶剂体系溶剂量(%)ABCH3OH 30 95CH3CN 30 95H2O(1N NH4OAC，pH5.0) 40 -H2O - 10
用100%溶剂(A)至50%溶剂(B)的120分钟线性梯度展开，以7.5ml/分的流速洗脱，以15ml为一部分收集。以50%(B)继续洗脱60分钟。合并下列部分合并液部分成分137F238-48E352-63B，G465-70H，J将这些合并液与得自用类似起始原料进行的其他层析操作的合并液合并。如上所述对合并后的合并液利用柱层析法进一步纯化;用标准技术在HP-20树脂上脱盐;浓缩并冰冻干燥得下列成分成分量(mg) 分子量＊IR＊＊E249717图13F4717图14G104731图15H，J87717图16假A288590图3＊质谱法测得＊＊KBr片A83543A假糖苷配基的FD-MS和EI-MS光谱分别示于图7和11。
实例6用培养物A83543.3制备A83543A.摇瓶发酵利用类似实例2A节的方法，摇瓶培养培养物多刺糖多孢菌NRRL18537，但使用如下的营养培养基C营养培养基C成分量酶解酪蛋白＊30.0g酵母膏3.0gMgSO4·7H2O 0.2g葡萄糖10.0g甘油20ml去离子水加至1升pH6.6，用NaOH调至7.0＊NZ AmineAB.搅拌生物反应器发酵如实例2所述利用B节的一般方法制备培养物的液氮安瓿。用一个安瓿接种第一级营养培养物(250ml锥形瓶中的50ml培养基C)，培养约48-72小时。用培养后的第一级培养物接种(10ml接种物)第二级培养物(2升锥形瓶中的400ml培养基C)，培养约48小时。用培养后的第二级培养物(5升)接种具有下列组成的生产培养基(115升)
生产培养基Ⅱ成分量(g/l)葡萄糖80胨化牛奶＊20棉子粉＊＊20CaCO35油酸甲酯30ml/l自来水加至1l＊Peptonized Milk Nutrieut，Sheffield Products;可以在第四天开始以5mg/ml/天的比率使用另外的连续养料。
＊＊Proflo(用NaOH将灭菌前的pH调至7.0)使培养后的生产培养基于30℃下在165升搅拌生物反应器中发酵约8至10天或更长时间。如实例2B节所述用计算机系统调节溶解氧(DO)水平，维持DO水平高于50%的空气饱和度。
实例7用培养物A83543.5制备A83543A.摇瓶发酵利用类似实例2A节的方法，用营养培养基B摇瓶培养培养物多刺糖多孢菌NRRL18539。
B.搅拌生物反应器发酵如实例2所述利用B节的一般方法制备培养物的液氮安瓿。用一个安瓿接种第一级营养培养物(250ml锥形瓶中的50ml培养基B)，培养48至72小时。用培养后的第一级培养物接种(10ml接种物)第二级培养物(2升锥形瓶中的400ml培养基B)，培养约48小时。用培养后的第二级培养物(2升)接种具有下列组成之一的生产培养基(115升)生产培养基Ⅲ成分量(g/l)葡萄糖80部分酶解的植物蛋白＊20棉子粉＊＊10CaCO35油酸甲酯30ml/l自来水加至1升＊Sheftone H＊＊Proflo(用NH4OH调灭菌前的pH至7.0)生产培养基Ⅳ成分量(%)葡萄糖8棉子粉＊3胨化牛奶＊＊2玉米浸液1CaCO3(技术级) 0.5油酸甲酯3.0自来水加至1升
＊Proflo＊＊Peptonized Milk Nutrient(用NaOH调灭菌前的pH至7.0)使接种后的生产培养基于30℃下在165升搅拌生物反应器中发酵约8至10天或更长时间。如实例6所述调节DO水平。
实例8用培养物A83543.4制备A83543利用类似实例2和7的方法但使用营养培养基B和生产培养基Ⅲ，培养培养物多刺糖多孢菌NRRL18538。
实例9如实例8所述制备发酵液。如下所述从发酵液中分离A83543。
1.在发酵液中加入等体积的丙酮，使用带有压滤器的陶瓷滤器或助滤剂进行过滤。
2.调节滤液pH至10。
3.加入乙酸乙酯(滤液体积为1/4至1/2)。
4.倾析出不互溶的水溶液部分而回收乙酸乙酯提取液;真空浓缩乙酸乙酯提取液至1/2体积。
5.用0.1M酒石酸水溶液(1/2体积)提取经浓缩的乙酸乙酯溶液;分离两相。
6.通过真空(约5%)蒸发从水相中除去可溶性的乙酸乙酯。利用反渗透操作浓缩水溶液。
7.用氢氧化钠调节浓缩后水溶液的pH至10-11。
8.过滤分离出沉淀物;用水洗涤;真空干燥得A83543。
实例10A83543A假糖苷配基将主要含成分A(约100mg)的A83543样品溶于甲醇(50ml)、水(2ml)和浓盐酸(3ml)中。将此溶液于50℃下浓缩至干。残渣用乙醚处理二次(每次200ml)，弃去不溶物。合并含粗假糖苷配基的醚溶液并浓缩至干。将残渣溶于甲醇(20ml)中，利用实例3所述的AUTOPREP-HPLC系统进行纯化，得20mg纯的A83543A假糖苷配基。
实例11利用与实例10所述类似的方法从A83543D制备A83543D假糖苷配基。
实例12下列制剂为可用于本发明的典型杀虫剂组合物。
A.水悬浮剂A-83543A12.5%“TergitolTMN-6”(非离子型表面活性剂)1.0%“Zeosyl200”(硅石)1.0%“AF-100”(硅基消泡剂)0.2%
吨溶液(2%) 10.0%“Makon10”(10摩尔环氧乙烷壬基酚9.0%表面活性剂)自来水66.3%
B.乳油A83543D12.4%“Exxon200”(萘类溶剂)83.6%“ToximulH”(非离子型/阴离子型2.0%表面活性剂混合物)“ToximulD”(非离子型/阴离子型2.0%表面活性剂混合物)实例13下列示例性组合物说明用于实施本发明方法的制剂的种类。
A.饲料预混物A83543A10%稻壳85轻矿物油5B.饲料预混物A83543E25%苜蓿草粉60粉状粘土5糖蜜10C.悬浮剂A83543A30%萘磺酸盐5非离子型表面活性剂5煅制二氧化硅1水59
D.滴灌溶液A83543A20%非离子型表面活性剂0.8丙二醇15水64.2E.滴灌悬浮液A83543B10非离子型表面活性剂1轻矿物油89F.注射液A83543A15%丙二醇85G.注射用悬浮液A83543C25%丙二醇15水60H.注射用悬浮液A83543D30%聚乙烯吡咯烷酮2水68
权利要求
1.一种杀虫剂或杀螨剂组合物，其中含有1-90%(重量)作为活性成分的式l的A83543化合物或其植物学上可接受的R不为氢的盐，和一种或多种植物学上可接受的载体或稀释剂，
其中R为H或一个选自如下基团的基团
R2为
R1、R3、R5和R6为氢或甲基；R4为甲基或乙基。
2.一种如权利要求1所述的杀虫剂或杀螨剂制剂，其特征在于，式1的A83543化合物是一种其中的R、R1、R3、R4R5和R6取下列组合之一的化合物或其R不为氢时的酸加成盐。R R1R3R4R5R6(a)MeHEtMeMe(b)MeHEtMeMe(c)MeHEtMeMe(a)MeMeEtMeMe(a)MeHMeMeMe(a)HHEtMeMe(d)MeHEtMeMe(a)MeHEtHMe(a)MeHEtMeHHMeHEtMeMeHMeMeEtMeMeHMeHMeMeMeHHHEtMeMeHMeHEtHMeHMeHEtMeH
3.一种如权利要求1或2中任一项所述的杀虫剂或杀螨剂制剂，其特征在于，在A83543化合物中R为一个(a)基团;R1、R5和R6＝CH3;R3＝H;R4＝乙基。
4.一种如权利要求1或2中任一项所述的杀虫剂或杀螨剂制剂，其特征在于，A83543为下列化合物或其酸加成盐R为一个(a)基团;R1、R3、R5和R6＝CH3;R4＝乙基。
5.一种抑制昆虫或螨虫的方法，该方法包括向昆虫或螨虫地点施用有效量的如权利要求1至4中任一项所限定的A83543化合物或其植物学上可接受的盐。
6.一种杀外寄生虫制剂，其中含有0.00005-95%(重量)作为活性成分的、如权利要求1所限定的式1的A83543化合物或其生理上可接受的盐，以及一种或多种生理上可接受的惰性载体或稀释剂。
7.一种控制消耗宿主动物血液的昆虫外寄生虫虫口的方法，该方法包括给宿主动物施用有效量的如权利要求1所限定的A83543化合物或其生理上可接受的盐。
8.一种生产如权利要求1-4中任一项所限定的式1的A83543化合物的方法，该方法包括，在深层通气发酵条件下，在含有可同化的碳源、氮源和无机盐源的培养基中，培养选自NRRL18395、NRRL18537、NRRL18538或NRRL18539的多刺糖多孢菌菌株或它们的产A83543突变株，直到产生可回收量的A83543。
9.一种用生物学方法纯化的多刺糖多孢菌培养物，该培养物选自NRRL18395、NRRL18537、NRRL18538或NRRL18539、或它们的产A83543突变株。
全文摘要
用新描述的物种多刺糖多孢菌生产发酵产物A83543，它包括主要成分A83543A和A83543D及次要成分A83543B、A83543C、A83543E、A83543F、A83543G、A83543H、A83543J。A83543各成分及其酸加成盐(A83543化合物)可用作杀虫剂，特别是针对鳞翅目和双翅目昆虫的杀虫剂。提供了杀虫、杀螨或杀外寄生虫的结合物、组合物和方法。
文档编号C12R1/01GK1043742SQ8910937
公开日1990年7月11日 申请日期1989年12月18日 优先权日1988年12月19日
发明者拉维恩·德韦恩·博克, 招衡, 汤姆·爱德华·易通, 小奥蒂斯·韦伯斯特·戈弗雷, 卡尔·海因茨·米歇尔, 中司, 姚慈晃 申请人:伊莱利利公司