专利名称：具有抗菌和抗肿瘤活性的新大环内酯化合物的制作方法
技术领域：
本发明提供具有抗菌和抗肿瘤活性的新化合物WBI-3001系列。本发 明还提供WBI-3001系列的制备方法，包括培养致病杆菌属的种 (Xenorhabdus species)的微生物的步骤。本发明更进一步提供包含 WBI-3001、其盐的抗菌和抗肿瘤组合物和本发明的化合物作为抗菌和抗 肿瘤药物的使用方法。下图表示了 WBI-3001系列的结构式，其为一组新的化合物，式I其中，R,， R2， R3， R4， R5， R5'， R6， R6'， R7， R7'， Rs， R8'， R9和IV独立地选自如下组成的组H;烷基，环垸基，烯基，炔基，芳基或芳垸基，其中上述基团为取代的或未取代的；卤素，硝基，CN，羟基， 氨基，COR1()， NRnR12， S(0)2NRnR,2; S(0)nR ， n = 0-2; ORn和杂环 基。Rs和Rs'; R6和R6'; RjR7'; Rs和Rs'; 119和R9'不能同时是氮， CN，羟基，氨基，COR10， NR"R12， S(0)2NRRn。R,o选自H;垸基，环烷基，芳基，或芳烷基，其中上述基团为取代 的或未取代的；或NRnRi2，或ORn;Rh和R,2逸自H;烷基，环垸基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的；Rn选自H;烷基，环垸基，芳基，芳垸基或酰基，其中上述基团为取代的或未取代的。
技术背景因为社会的、法律的、生物学的改变，曾经一度通过合成杀虫剂和 化学药物而得到控制的一些有害物质和人、家养动物和农作物疾病又重 新出现在世界的许多地方，并且最近几年越来越明显。在医学和农林学 方面，许多微生物对杀虫剂和化学药物的抗性的发展正对人类产生越来 越多的挑战。此外，人类和动物肿瘤疾病的治疗仍旧是一个艰巨的任务。因此，对用以有效控制疾病的新农药(agrochemicals)和新药物有迫切的需 要。从栖息于土壤中的微生物获得的微生物产品的多样性成为新药物和 农药研发的传统资源库。最近的一个成果是线虫-细菌组合作为对抗虫害的生物控制药物的 商业应用。该生物控制药物的一个重要特征是与线虫共生的细菌(致病杆 菌属的种(XewoW2a^/ws ^p.)或发光杆菌属的种(尸/7otor/zaZ^ws w.))产生 大量具备生物活性的代谢物，包括抑制细菌、真菌和酵母生长的抗菌物 质(Webster等，2002)。虽然关于致病杆菌属的种C^"or/z"Z^w ^p.)和发光杆菌属的种 (尸/w/oW7a^/"s ^p.)的生物学方面的出版物很有限，但已经认识到那些生 物活性物质是由这些细菌产生的。这些特殊的化合物中的一些已经被分 离和鉴定，并且它们的结构也已经被阐明(Forst和Nealson, 1996)。最近， 发现致病杆菌属的种(Jfe"or/za6^w spec/")和发光杆菌(P/zotoWzaZ^M /^m77^cew)的无细胞培养肉汤对多种农业和医学上重要的真菌是有对抗 作用的(Chen等人，1994)。从这些细菌培养物中发现了两种类型的新抗菌 物质nematophin (Webster等，US专利5569668)和xenorxides (Webster 等，US专利6316476)。并且，xenorxides己经被证实具有非常强的抗肿瘤 活性(Webster等,US专利6020360)。作为这些细菌正在进行的研究中的一 部分，WBI-3001系列(一组新的化学物质)发现有非常强的抗菌和抗肿瘤 活性，并且成为本发明的主题。现有技术资料没有记载WBI-3001的存在 及其应用或者作为抗菌和/抗肿瘤药物的任何可以使用的方面。微生物本研究中使用的伯氏致病杆菌(^e"or/zaWw Z>oWem7)及其线虫共生 体斯氏线虫(&e/we wema /e/"ae)采集于加拿大英属哥伦比亚大学的土壤， 并且培养于Dr. J. M. Webster在Simon Fraser University, Burnaby, B.C., Canada V5A 1S6的生物学系的实验室。简要的说，以25个侵染性幼虫 (infective juvenile, IJ)/幼虫的比例，用带有伯氏致病杆菌(X. Z oWem7) A21 株的侵染性幼虫线虫侵染大蜡螟(Greater Wax Moth, Ga〃w/a me〃owe〃a) 的终龄幼虫。24到48小时后，通过将死去的昆虫幼虫蘸满95%的酒精 并将其点燃的方式对其进行表面消毒。解剖尸体，将血淋巴放置于琼脂 培养基上，在室温下进行黑暗培养。根据布达佩斯条约，用于分离本发 明化合物的菌株保藏于Rochville, Md.的美国典型培养物保藏中心，保藏 号为ATCC 55743。 Webster等人在其#6583171号美国专利中，对该菌株 的分离步骤和该菌株的特征进行了充分的描述。WBI-3001的制备微生物伯氏致病杆菌的培养产生了新物质WBI-3001 。为了制备 WBI-3001,将伯氏致病杆菌培养(发酵)，例如在大约25。C，沉没在包 含碳源(碳水化合物)和氮源的水性培养基中进行有氧培养，直到培养 基具备了 WBI-3001所形成的抗菌活性。发酵过程可以持续约48-96小时， 发酵结束时，生成抗菌的WBI-3001 ，且其可以从发酵培养基中分离和纯 化。在发酵完成后，发酵肉汤可以进行过滤或离心分离，用盐酸将滤液 的pH值调节到大约7.0或者不对pH值进行调节。然后，滤液可以用与 水不混溶的有机溶剂，例如，用乙酸乙酯或氯仿进行萃取。混合的有机 层(例如合并的乙酸乙酯或氯仿萃取液)可以被真空浓縮(例如在大约 30°C)成油性渣体("糖浆")。这些油可以与小量的有机溶剂混合，并 在硅胶柱上进行色谱分析。在上样后，可利用氯仿或其他有机溶剂洗脱 生物活性部分。这些生物活性部分可以用高效液相色谱(HPLC)在有机 溶液和/或水溶液中进一步纯化。本发明的化合物包括WB1-3001及其盐。本文所用的术语"盐"是指其 与无机和/或有机的酸和碱形成的酸性盐和/或碱性盐。合适的酸例如包括 盐酸、硫酸、硝酸、苯磺酸、醋酸、马来酸、酒石酸和可药用的类似酸。 优选的是可药用的盐，特别是当使用本发明的化合物作为药物的时候。 其它盐例如在这些化合物的加工过程中，或在非药物型用途的需求下应 用。WBI-3001及其应用WBI-3001由于对动物和植物的致病微生物具有抗菌活性，其可用于 预防和治疗由这些微生物引发的感染，特别是，由对抗生素有抗性的细 菌(例如葡萄球菌属的细菌)引发的感染。可治疗的宿主包括植物和动物， 特别是如狗、猫和其他家养动物等哺乳动物，尤其是人。WBI-3001还对一些人癌细胞系具有很强的抗肿瘤活性。最重要的， WBI-3001抑制人肺癌的生长以及人宫颈癌和乳腺癌的生长。剂型、给药方式以及剂量，可以由熟练的技术人员进行选择。对成 年人的示例性剂量为每日大约2.5 mg到大约2，000 mg。对哺乳动物的给 药方式例如可以是口服、肠胃外或者局部给药(topical)。对植物宿主的 给药方式例如可以通过施予种子、树叶或其他植物部分，或者施予土壤 中来实现。当WBI-3001或其盐被用于治疗的时候，它们可以被单独使用或者以 药学上合适的制剂形式使用，所述制剂含有活性成分以外的一种或多种 常规的载体。根据疾病的性质和/或给药途径，本发明的组合物可以用己 知的方法来制备。药物组合物的例子包括适于口服、局部或肠胃外给药的任何固体组 合物(片剂、丸剂、胶囊、颗粒、粉末等)或液体组合物(溶液、悬浮 液或乳剂)，它们可以仅包括纯化合物或其盐，也可以由该化合物或其 盐与任何的载体或其他药学活性化合物组合在一起。这些组合物在肠胃 外使用前需要进行灭菌。给药剂量取决于疾病的种类、宿主的类型(包括其年龄，健康状况 和体重)、同时进行的其他类型的治疗(如果有其他类型的治疗)、以及治疗的频率和治疗比。示例性地，使用的活性成分的剂量水平，在静脉给药时是0.1到约200 mg/kg宿主体重；肌肉给药时是1到约500 mg/kg 宿主体重；口服给药时是5到约1000 mg/kg宿主体重；滴鼻给药时是5 到约1000 mg/kg宿主体重；喷雾给药时是5到约1000 mg/kg宿主体重。 以浓度表示，用于皮肤、鼻腔、咽喉、支气管、阴道、直肠或者眼睛局 部给药的本发明组合物含有浓度为组合物的约0.01到约50% w/w，优选约1到约20^w/w的活性成分。同样地，对于肠胃外给药，使用的组合 物可含有约0.05到约50% w/v，优选约5到约20% w/v的本发明活性成 分。在动物和人的疾病的治疗中，用作抗菌药物和/或抗肿瘤药物的活性 成分的WBI-3001或其盐，可以利用现有技术中的药用物质和确定的工艺 容易地制成单位剂型。可以选择合适的固体或液体赋形剂(vehicles)或者 稀释剂，通过本领域技术人员已知的方法制备该组合物。作为农业应用，该抗菌组合物可以用这些活性成分之一置于惰性载 体内制成。如果制成固体，活性成分可以与例如漂白土 (Fuller's earth)、 高岭土、硅土或其他可润湿的无机稀释剂等常用载体混合。也可以使用 流动性粉尘制剂，其通过将干燥的活性成分与诸如滑石粉、硅藻土 (kieselguhr)、叶蜡石、粘土和硅藻土 (diatomaceous earth)等的细微 固体混合而制得。根据其在液体载体中的溶解性，粉末可以以悬浮液或溶液形式施用。 可以使用压力喷雾剂，特别是活性成分弥散于低沸点的分散剂溶剂载体 中的气雾剂。重量百分比可以根据该组合物被应用的方式和所使用的制 剂进行调整，通常，该抗菌组合物中包括0.005wtM到95wtn/。的活性成分。 该抗菌组合物可以与其他成分一起使用，所述其他成分包括生长调节因 子、杀虫剂和肥料等。有助于应用、易于操作、维持化学稳定性和增强 效力的活性成分制剂可能需要添加多种不同的物质。根据活性成分的溶 解性、火灾隐患(fire hazard)和闪点、乳化度、比重和经济因素选择溶 剂。可加入佐剂以增强活性成分，还可以包括阴离子、阳离子或非离子 的表面活性剂。稳定剂和防冻剂可以延长保藏时间。另外，可以加入增 效剂、粘结剂、铺展剂(spreader)和除臭剂化合物以改善商业制剂的处理 特性。可选的，该活性成分可与诸如碳酸钙等惰性载体组合制成丸，或制成其他可消耗的给药器(consumable delivery device),包括用于定量传 输活性成分的控释给药器。本发明的化合物还可用作抗菌药物，用于抑制现存微生物的生长或 者根除活宿主表面上或活宿主外媒介(medium)内的微生物。本发明的 化合物和/或它们的盐例如可用作消毒剂，对多种易于微生物生长的固体 或液体媒介进行消毒。本发明化合物的合适用量可根据本领域技术人员 已知的方法来确定。下面的例子用于进一步说明本发明，但其并不用于以任何形式限定 本权利要求书的范围。
具体实施方式
实施例l.从伯氏致病杆菌培养肉汤中制备和分离WBI-3001 伯氏致病杆菌的初级培养物维持14天后进行次级培养。通过将一接 种环的培养物加入到100ml锥形烧瓶中的50ml胰酶大豆肉汤(TSB)中， 制备接种体(Inocula)的初级培养物。在25汇下，培养物在Eberbach转 动振荡器(Eberbach gyrorotary shaker)上以120rpm震动24小时。在 2000ml的烧瓶中，通过将100ml该细菌培养物加入到900ml的TSB中开 始细菌发酵。烧瓶在25。C下于Eberbach转动振荡器上进行黑暗培养。96 小时后，培养物立即进行离心分离(12,000 xg， 20分钟，4°C)以分离 出细菌细胞。伯氏致病杆菌接种到二十升培养基。接种的培养基在37'C 下培养3天。然后，培养基被研碎并用20L的乙酸乙酯萃取三次。合并 萃取物并进行真空蒸发。蒸发后得到大约20克油性物质。向该油性物质 加入100ml己烷，搅拌所得混合物半小时。通过此操作，出现了固体沉 淀物。通过过滤得到大约IO克固体。将这些固体重新溶解在20ml氯仿 中，并装入硅胶柱通过色谱分析进行分离。氯仿和甲醇(9: 1)混合物 为洗脱剂。通过TLC监测这些化学物质的分离。对色谱分析纯化所得的 物质进行抗菌活性实验。得到一个具有显著抗菌活性的化学物质，用 NMR和MS对其进行鉴别。该化学物质的结构如下所示例2. WBI-3001的鉴定用C5D5N5在Bmker WM600光谱仪上得到NMR光谱。通过70 eV 下操作的惠普5985B gc/ms体系使用直接进样探针(direct probe)得到低分 辨率MS。通过上述相同的设备使用异丁烷得到CIMS图谱。用Kmtos MS80设备得到高分辨率MS。用配备沃特斯(Waters)996 PDA检测器的 沃特斯2695进行HPLC和UV分析。'H NMR (C5D5N) (600Hz) 50.87 (dd, 6H， J=7.2Hz)， 1.42(mult., 1H), 1.83(mult" 2H), 1.92(mult" 2H)， 2.21(mult" 1H)， 2.35(mult" 1H), 2.94(dd, 1H， J=16Hz, J=3Hz), 3.21(dd, 1H， J=16Hz, J=13Hz)， 3.41(mult" 1H), 4.40(mult" 1H)， 4.66(mult,， 1H), 4.72(dd" 1H， J=16Hz， J=3Hz), 4.88(d, 1H, J=6Hz)， 5.02(dd， 1H， J=6Hz， J=3Hz), 6.62(d， 1H， J=7Hz), 6.97(d, 1H, J=8Hz), 7.35(t， 1H, J=8Hz), 8.78(d， 1H, J=9Hz).13C NMR (C5D5N) (600Hz) S21,76(C画1), 23.41(C-1，)， 24.70(C-8), 24.94 (C-2)， 25.91(C-7)， 30.10 (C-6), 39.93(C-3), 45.53(C-12), 49.39(C-4) 62.46(C-9)， 71.78(C-11)， 74.16(C-10)， 81.77(C-5)， 109.07(C-18)， 115.95(C-20), 118.67(C-19)， 136.50(017), 140.78(C-15), 162.40(C-16)， 170.01(C-13), 173.99(C-14).MS: 408(CI) (M+l)UV (CH3CN:H20=2:8): Dmax (log s) 314,8 nm (3.7). 例3. WBI-3001作为抗菌药物进行了以下实验，其显示了 WBI-3001的抗菌特性。为了确定 WBI-3001的最小抑制浓度(MIC)，采用了标准稀释方法。测试在35'C下 进行，并在培养24小时后测定MICs。表1显示了这些化合物对每种微生物的抑制所测定的MICs。得到的 结论是，从致病杆菌(Xenorhabdus)分离出的WBI-3001具有有效的抗菌特 性，特别是对一些有抗生素抗性的葡萄球菌菌株的抗菌特性。表l: 24hr和48hr时间点下，胰蛋白酶大豆肉汤中，WBI-3001和 红霉素的MICs (注MIC值的单位是吗/ml).细菌样品WBI-3001红霉素大肠杆菌C^c/zer/c/n'a co//)41表皮葡萄球菌(S,a/ /^/ococcM51印/(/er/mW")80.25金黄色葡萄球菌MSRA* (S. flwe^ MSRA)4>32粪肠球菌(五"/erococcws力eca叫32>32化脓性链球菌(5Vre/ ,ococcws /^ogewe51)40.03绿脓杆菌CP"wdowomw aerag/wosa)>32>32*耐甲氧西林株的临床分离物(clinical isolates)例4. WBI-3001作为抗肿瘤药物WBI-3001体外的抗肿瘤活性己经在人肺癌H460、乳腺癌MCF-7和 宫颈癌Hda的细胞培养物中得到确认。测试用Skehan等人(1990)所描述 的方法进行。WBI-3001对这些癌细胞都表现出很强的抗肿瘤活性。表2. WBI-3001对三种肿瘤细胞系的抗肿瘤活性IC50 (pg/ml)化合物H460MCF-7HelaWBI-30010.10.810.24尽管上述说明含有许多具体特征，然而它们不应当被认为是对本发 明的限定，只是优选的实施方式的例子。因此，本发明的范围不应当由 所提供的实施例来限定，而应当通过权利要求和其法律等同物来限定。1权利要求
1.式I的化合物或其盐其中，R1，R2，R3和R4独立地选自如下组成的组H；烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的；卤素，硝基，CN，羟基，氨基，COR8，NR9R10，S(O)2NR9R10；S(O)nR9，n＝0-2；OR11和杂环基；R5和R6独立地选自如下组成的组H；烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的；卤素，硝基，CN，羟基，氨基，COR8，NR9R10；R7选自如下组成的组H；烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳烷基和杂环基，其中上述基团为取代的或未取代的；R8选自H；烷基，环烷基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的；R9和R10选自H；烷基，环烷基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的；R11选自H；烷基，环烷基，芳基，芳烷基或酰基，其中上述基团为取代的或未取代的；-(X-Z)-的结构如下R12，R13，R14和R15独立地选自如下组成的组H；烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的；卤素，硝基，CN，羟基，氨基，COR8，NR9R10，S(O)2NR9R10；S(O)nR9，n＝0-2；OR11和杂环基。
2. 根据权利要求1所述的化合物，其中R,为羟基，R2， R3和R4为H。
3. 根据权利要求2所述的化合物，其中R6为羟基，R7为异丁基。
4. 根据权利要求3所述的化合物，其中R,2和Rn为羟基，R,4和R,s 为H。
5. 根据权利要求1所述的化合物，其中，-(X-Z)-是-(CHR16-CHR17)-， R,6和Rn独立地选自如下组成的组H;烷基，环烷基，烯基，炔基， 芳基或芳垸基，其中上述基团为取代的或未取代的。
6. 根据权利要求1所述的化合物，其中-(X-Z)-为如下结构
7.根据权利要求l所述的化合物，其中-(X-Z)-为如下结构:
8.根据权利要求1所述的化合物，其中-(X-Z)-为如下结构:R"， R15， R,6和Rn独立地选自如下组成的组H;烷基，环烷基， 烯基，炔基，芳基或芳垸基，其中上述基团为取代的或未取的；卤素， 硝基，CN，羟基，氮基，COR8， NR9R1()， S(0)2NR9R1(); S(0)nR9， n = 0-2; ORn和杂环基。
9. 一种药物组合物，其包括式I所示的化合物或其盐，<formula>formula see original document page 4</formula>其中，Rp R2， R3和R4独立地选自如下组成的组H;烷基，环烷 基，烯基，炔基，芳基或芳垸基，其中上述基团为取代的或未取代的；卤素，硝基，CN，羟基，氨基，COR8， NR9R1()， S(0)2NR9R1(); S(0)nR9， n二0-2; ORu和杂环基；Rs和R6独立地选自如下组成的组H;烷基，环烷基，烯基，炔基， 芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的；卤素，硝基，CN，羟基，氨基，COR8， NR9R10;R7选自如下组成的组H;烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳 垸基和杂环基，其中上述基团为取代的或未取代的；R8选自H;垸基，环垸基，芳基或芳垸基，其中上述基团为取代的 或未取代的；R9和R,o选自H;垸基，环烷基，芳基或芳烷基，其中上述基团为 取代的或未取代的；Rn选自H;烷基，环烷基，芳基，芳垸基或酰基，其中上述基团为 取代的或未取代的；-(X-Z)-的结构如下R12， R13， R，4和R,5独立地选自如下组成的组H;烷基，环垸基， 烯基，炔基，芳基或芳垸基，其中上述基团为取代的或未取代的；卤素， 硝基，CN，羟基，氨基，COR8， NR9R1()， S(0)2NR9R1(); S(0)nR9， n = 0-2;
10. 根据权利要求9所述的组合物，其中-(X-Z)-是-(CHR16-CHR17)-&6和Rn独立地选自如下组成的组H;烷基，环烷基，烯基，炔基， 芳基或芳垸基，其中上述基团为取代的或未取代的。
11. 根据权利要求9所述的组合物，其中-(X-Z)-为如下结构<formula>formula see original document page 5</formula>
12.根据权利要求9所述的组合物，其中-(X-Z)-为如下结构:<formula>formula see original document page 5</formula>
13.根据权利要求9所述的组合物，其中-(X-Z)-为如下结构:^12R14， R15, R,6和R"独立地选自如下组成的组H;垸基，环垸基， 烯基，炔基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的；卤素， 硝基，CN，羟基，氨基，COR8， NR9R1()， S(0)2NR9R1(); S(0)nR9， n = 0-2; ORn和杂环基。
14.式I所示的化合物或其盐在制备治疗微生物感染和肿瘤疾病的药 物中的应用；R2 O其中，R,， R2， R3和R4独立地选自如下组成的组H;烷基，环垸基，烯基，炔基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的； 卤素，硝基，CN，羟基，氨基，COR8， NR9R1()， S(0)2NR9R1(); S(0)nR9， n = 0-2; ORu和杂环基；R5和R6独立地选自如下组成的组H;垸基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的；卤素，硝基，CN， 羟基，氨基，COR8， NR9R10;R7选自如下组成的组H;垸基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳 垸基和杂环基，其中上述基团为取代的或未取代的；R8选自H;烷基，环烷基，芳基或芳垸基，其中上述基团为取代的 或未取代的；R9和R0选自H;垸基，环烷基，芳基或芳烷基，其中上述基团为 取代的或未取代的；Rn选自H;烷基，环垸基，芳基，芳烷基或酰基，其中上述基团为 取代的或未取代的；-(X-Z)-的结构如下-R12， R13， R"和R。独立地选自如下组成的组H;垸基，环垸基， 烯基，炔基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的；卤素， 硝基，CN，羟基，氨基，COR8， NR9R10， S(O)2NR9R10; S(0)nR9， n = 0-2; ORn和杂环基。
15. 根据权利要求14的应用，其中-(X-Z)-是-(CHRi6-CHR,7)-， R16和Rn独立地选自如下组成的组H;烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基 或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的。
16. 根据权利要求14的应用，其中-(X-Z)-为如下结构<formula>formula see original document page 7</formula>
17.根据权利要求14的应用，其中-(X-Z)-为如下结构:<formula>formula see original document page 7</formula> 。<formula>formula see original document page 7</formula>，R14， R15， R16和R17独立地选自如下组成的组H;垸基，环垸基， 烯基，炔基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的；卤素， 硝基，CN，羟基，氨基，COR8， NR9R10， S(O)2NR9R10; S(0)nR9， n = 0-2; OR11和杂环基。
全文摘要
本发明涉及具有抗菌和抗肿瘤活性的式I所示新大环内酯化合物，其可用作治疗微生物感染(特别是涉及抗药性葡萄状球菌的传染病)和治疗人或动物癌症的药物和/或农药。
文档编号C07D269/00GK101326170SQ200680046689
公开日2008年12月17日 申请日期2006年11月28日 优先权日2005年12月14日
发明者滨 李, 李建雄, 约翰·韦伯斯特, 胡凯基, 陈庚辉 申请人:云南省玉溪市维和制药有限公