专利名称：淡紫拟青霉抑制象耳豆根结线虫的测定方法
淡紫拟青霉抑制象耳豆根结线虫的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物的测定方法，尤其涉及一种淡紫拟青霉抑制象耳豆根结线虫的测定方法。
背景技术：
根结线虫(Meloidogyne spp.)是一类危害极大的植物寄生线虫，它广泛分布于世界各地，世界每年由根结线虫所引起经济上重要农作物的损失占总损失的5% (孙龙华等， 2005)。近年来，由于作物复种指数的提高和设施农业的发展，根结线虫的发生和危害明显加剧(蒋寒等，2003)。目前主要采用杀线虫剂防治根结线虫，但杀线虫剂通常毒性较高， 会增加环境的污染，因此越来越多的学者认识到控制根结线虫必须采取综合措施或采用以生物生态防治为核心的可持续治理系统(张绍升，1999)，而生物防治是其中的一个重要部分。线虫生物防治是指通过引入捕食线虫和寄生于线虫的生物，从而降低线虫的群体，以便把线虫引起的经济损失减少到最低水平，或者通过生物所产生的毒素杀死线虫的一种防治手段(冯志新，2001)。又由于淡紫拟青霉在我国分布广，较易分离到，且对根结线虫有很好的防治作用，因此我国学者对淡紫拟青霉进行了大量的研究。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于提供一种淡紫拟青霉抑制象耳豆根结线虫的测定方法，不仅能实现生物防治根结线虫，而且可避免对环境造成污染。本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的技术方案之一淡紫拟青霉抑制象耳豆根结线虫卵孵化的测定方法，包括以下步骤(1)挑取纯化后的象耳豆根结线虫的卵囊，放入带盖的IOmL离心管内，加入 5mL0. 5% NaClO，用力振荡3min，迅速将其通过双层筛，上层筛孔径为250 μ m，下层筛孔径为38 μ m，接着用无菌水收集冲洗下层筛中的卵粒；(2)单孢分离的淡紫拟青霉菌株在25°C下生长7d后，用直径为6mm的打孔器切取菌落边缘的菌块，将菌块置于PDA培养基平板中央，在菌块周围斜插上3块载玻片，每块载玻片上放置约50粒卵；设置一个对照，该对照是直接把卵粒放置在载玻片上后，置于PDA培养基中；各重复3次，然后把它们均置于25°C培养箱中；(3)分别在3d、7d和IOd后取出载玻片镜检卵的孵化数，并通过计算卵的相对抑制率，同时每天观察卵被菌寄生的情况。技术方案之二淡紫拟青霉抑制象耳豆根结线虫2龄幼虫的测定方法，包括以下步骤(1)挑取象耳豆根结线虫卵囊置于25°C培养箱中，孵化获得2龄幼虫；(2)单孢分离的淡紫拟青霉菌株在25°C下生长7d后，用直径为6mm的打孔器切取菌落边缘的菌块，将菌块移入装有50mLPDB培养液的250mL三角瓶中，然后置于温度为 25°C、转速为120rpm的摇床中培养7d，将培养所得真菌粗提液先经滤纸过滤第一次，滤去菌丝，接着再使用孔径为0.2μπι的微孔滤膜过滤第一次的滤液，最后获得的第二次滤液即为所需的淡紫拟青霉培养滤液；设置一对照，该对照用未接菌的，且于温度25°C、转速 120rpm摇床中培养7d的PDB培养液；(3)取ImL步骤O)中的培养滤液，加入0. 5mL象耳豆根结线虫2龄幼虫悬浮液， 该悬浮液浓度约为200条2龄幼虫/mL，放入25°C培养箱培养Mh，24h后取出于解剖镜下采用针刺法观察线虫的活动性，不活动的线虫即被击倒的，将不活动线虫挑入清水中，24h 后观察其死亡率，不动者即为死亡；其中，步骤O)中的PDB培养液的组分为马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。本发明淡紫拟青霉抑制象耳豆根结线虫的测定方法的有益效果在于通过淡紫拟青霉素寄生于象耳豆根结线虫从而对象耳豆根结线虫起到抑制作用，实现生物防治根结线虫，进而取代现有的利用杀线虫剂防治根结线虫的方法，避免了杀线虫剂的毒性对环境造成的污染。
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。图1是本发明淡紫拟青霉抑制象耳豆根接线虫卵孵化的测定方法流程图。图2是本发明淡紫拟青霉抑制象耳豆根结线虫2龄幼虫的测定方法流程图。图3a是本发明中淡紫拟青霉菌株寄生于象耳豆根结线虫卵第3天时的细胞图。图北是本发明中淡紫拟青霉菌株寄生于象耳豆根结线虫卵第5天时的细胞图。
具体实施方式本发明淡紫拟青霉抑制象耳豆根结线虫的测定方法主要通过两个技术方案实现的技术方案之一请参阅图1，淡紫拟青霉抑制象耳豆根结线虫卵孵化的测定方法，包括以下步骤(1)挑取纯化后的象耳豆根结线虫的卵囊，放入带盖的IOmL离心管内，加入 5mL0. 5% NaClO，用力振荡3min，迅速将其通过双层筛，上层筛孔径为250 μ m，下层筛孔径为38 μ m，接着用无菌水收集冲洗下层筛中的卵粒；(2)单孢分离的淡紫拟青霉菌株在25°C下生长7d后，用直径为6mm的打孔器切取菌落边缘的菌块，将菌块置于PDA培养基平板中央，在菌块周围斜插上3块载玻片，每块载玻片上放置约50粒卵；设置一个对照，该对照是直接把卵粒放置在载玻片上后，置于PDA培养基中；各重复3次，然后把它们均置于25°C培养箱中；(3)分别在3d、7d和IOd后取出载玻片镜检卵的孵化数(载玻片上的空卵壳即为孵化的卵数)，并通过计算卵的相对抑制率，同时每天观察卵被菌寄生的情况。其中卵的相对抑制率的计算公式为卵的相对抑制率(％ )=(对照卵的孵化率-处理卵的孵化率)/对照卵的孵化率X100.0。技术方案之二
请参阅图2，淡紫拟青霉抑制象耳豆根结线虫2龄幼虫的测定方法，包括以下步骤(1)挑取象耳豆根结线虫卵囊置于25°C培养箱中，孵化获得2龄幼虫；(2)单孢分离的淡紫拟青霉菌株在25°C下生长7d后，用直径为6mm的打孔器切取菌落边缘的菌块，将菌块移入装有50mLPDB培养液的250mL三角瓶中，然后置于温度为 25°C、转速为120rpm的摇床中培养7d，将培养所得真菌粗提液先经滤纸过滤第一次，滤去菌丝，接着再使用孔径为0. 2 μ m的微孔滤膜过滤第一次的滤液，最后获得的第二次滤液即为所需的淡紫拟青霉培养滤液；设置一对照，该对照用未接菌的，且于温度25°C、转速 120rpm摇床中培养7d的PDB培养液；(3)取ImL步骤O)中的培养滤液，加入0. 5mL象耳豆根结线虫2龄幼虫悬浮液， 该悬浮液浓度约为200条2龄幼虫/mL，放入25°C培养箱培养Mh，24h后取出于解剖镜下采用针刺法观察线虫的活动性，不活动的线虫即被击倒的，将不活动线虫挑入清水中，24h 后观察其死亡率，不动者即为死亡；相对其中死亡率的计算公式如下相对死亡率(％ )=(处理死亡率-对照死亡率)/ (1-对照死亡率)X 100. 0另外，步骤O)中的PDB培养液的组分为马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。结果与分析1.淡紫拟青霉对象耳豆根结线虫卵孵化抑制淡紫拟青霉抑制象耳豆根虫卵孵化的测定结果见表1。从表1可以看到，淡紫拟青霉菌株对象耳豆根结线虫卵孵化有较好的抑制效果，在3天前抑制效果不明显，到第7天抑制效果很明显，到第10天对卵的抑制率达到55. 6%。根据观察结果，我们发现通常在第3 天该菌菌丝大量接触到线虫卵并开始侵入卵，到第5天左右该菌产生分生孢子梗及大量的分生孢子，有的菌丝从卵内穿出(如图3a与图北所示)。卵的所有胚胎期均可被该菌寄生，被该菌寄生的卵粒通常死亡而停留在死亡的胚胎阶段，但一般卵粒保持完整，比如卵粒胚胎进入到1龄幼虫期后死亡，我们可以清楚的观察到卵内的1龄幼虫，但幼虫不溢出。表1淡紫拟青霉对象耳豆根结线虫卵孵化的抑制率
权利要求
1.一种淡紫拟青霉抑制象耳豆根结线虫卵孵化的测定方法，其特征在于包括以下步骤(1)挑取纯化后的象耳豆根结线虫的卵囊，放入带盖的IOmL离心管内，加入5mL0.5% NaClO，用力振荡3min，迅速将其通过双层筛，上层筛孔径为250 μ m,下层筛孔径为38 μ m， 接着用无菌水收集冲洗下层筛中的卵粒；(2)单孢分离的淡紫拟青霉菌株在25°C下生长7d后，用直径为6mm的打孔器切取菌落边缘的菌块，将菌块置于PDA培养基平板中央，在菌块周围斜插上3块载玻片，每块载玻片上放置约50粒卵；设置一个对照，该对照是直接把卵粒放置在载玻片上后，置于PDA培养基中；各重复3次，然后把它们均置于25°C培养箱中；(3)分别在3d、7d和IOd后取出载玻片镜检卵的孵化数，并通过计算卵的相对抑制率， 同时每天观察卵被菌寄生的情况。
2.一种淡紫拟青霉抑制象耳豆根结线虫2龄幼虫的测定方法，其特征在于包括以下步骤(1)挑取象耳豆根结线虫卵囊置于25°C培养箱中，孵化获得2龄幼虫；(2)单孢分离的淡紫拟青霉菌株在25°C下生长7d后，用直径为6mm的打孔器切取菌落边缘的菌块，将菌块移入装有50mLPDB培养液的250mL三角瓶中，然后置于温度为25°C、转速为120rpm的摇床中培养7d，将培养所得真菌粗提液先经滤纸过滤第一次，滤去菌丝，接着再使用孔径为0. 2μπι的微孔滤膜过滤第一次的滤液，最后获得的第二次滤液即为所需的淡紫拟青霉培养滤液；设置一对照，该对照用未接菌的，且于温度25°C、转速120rpm摇床中培养7d的PDB培养液；(3)取ImL步骤O)中的培养滤液，加入0.5mL象耳豆根结线虫2龄幼虫悬浮液，该悬浮液浓度约为200条2龄幼虫/mL，放入25°C培养箱培养Mh，24h后取出于解剖镜下采用针刺法观察线虫的活动性，不活动的线虫即被击倒的，将不活动线虫挑入清水中，24h后观察其死亡率，不动者即为死亡；其中，步骤O)中的PDB培养液的组分为马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。
全文摘要
本发明涉及一种淡紫拟青霉抑制象耳豆根结线虫的测定方法，其可通过两种技术方案来实现，一种是采用淡紫拟青霉对象耳豆根结线虫卵孵化的抑制测定，另一种是淡紫拟青霉对象耳豆根结线虫2龄幼虫的抑制毒杀测定。本发明的优点在于不仅能实现生物防治根结线虫，而且可避免对环境造成污染。
文档编号C12Q1/02GK102373260SQ20101025211
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月12日 优先权日2010年8月12日 公开号201010252116.发明者卓侃, 史怀, 周先治, 黄素芳 申请人:福建省农业科学院农业生物资源研究所, 福建省农业科学院生物技术研究所