专利名称：一株淡紫拟青霉及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株淡紫拟青霉及其应用，特别涉及淡紫拟青霉在防控热带亚热带地区香蕉等热带果树蔬菜根结线虫病和香蕉枯萎病中的应用。
背景技术：
植物线虫病是ー种世界范围内普遍发生的植物病害，危害3000多种植物。全球每年因线虫造成的损失高达1000多亿美元。在我国，线虫危害果树、花、蔬、粮、油、林、烟草、药材等几乎所有作物，成为农林业生产中的重要限制因子之一。香蕉是重要的热带水果，但香蕉线虫在我国华南地区普遍发生，同时诱发枯萎病、根腐病和细菌性软腐病等多重土传 病害。严重威胁我国香蕉产业的发展。长期以来，生产上对香蕉线虫病主要是采用化学防治，这些杀线虫剂毒性強，污染环境，残留含量高，缺乏安全、有效的防控手段，因此生物防治受到广泛重视。目前，汪军和黄俊生等分离到了两株对香蕉根结线虫具有致病性的淡紫拟青霉E7菌株(汪军，刘磊，李传东，刘昌燕，黄俊生.淡紫拟青霉E7菌株对香蕉根结线虫的致病性和生防效果.中国植保导刊.2008年第10期)和淡紫拟青霉PL04菌株(汪军，黄俊生*，邓国平，赵培静，杨腊英，陈希德.淡紫拟青霉PL04菌株抗逆性及其对香蕉根结线虫的寄生作用.西北农业学报.2009，18(3):263-267)。虽然，已得到了对香蕉根结线虫具有致病性的菌株，但还需分离对香蕉根结线虫具有更高致病性的菌株，以加速高效稳定的生物杀线虫剂的开发进程。
发明内容
本发明所要解决的ー个技术问题是提供一株淡紫拟青霉。本发明所提供的淡紫拟青霉是淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus) E16,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 5951。该菌种已于2012年04月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCOo本发明的淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus) E16 CGMCC No. 5951 在查氏培养基28°C培养7d，菌落直径为40mm，菌落很干燥与培养基连接紧密，不易挑取，中央为淡红色，周围为白色；菌丝呈绒毛状，长而细。分生孢子梗呈扫帚状，菌丝较长，分生孢子为椭圆形，成串呈不分枝的链状。本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种杀线虫剂。本发明所提供的杀线虫剂，它的活性成分是上述淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus) E16CGMCC No. 5951。本发明所要解决的另一个技术问题是提供以上述淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus) E16CGMCC No. 5951为活性成分的下述I) _5)中的任一种产品I)增加香蕉果实产量的产品；
2)增加香蕉根重的产品；3)增加香蕉株高的产品；4)増加香蕉地上部分重量的产品；5)防治由尖孢铼刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)引起的植物病害的产品。在本发明的一个实施例中，所述植物病害具体为香蕉枯萎病。所述淡紫拟青霉(Paecilomyces Iilacinus)E16CGMCCNo. 5951具体可为分生抱子或/和菌丝体。所述杀线虫剂可用于防治由南方根结线虫(Meloidogyne incognita)和爪日圭根结线虫(Meloidogyne Goeidi)中的至少一种引起的植物虫害。在本发明的一个实施例中，所述植物虫害具体为香蕉根结线虫病。实验证明，4X106cfu/mL 的淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus) E16CGMCCNo. 5951孢子悬液对南方根结线虫卵的相对寄生率为39. 43% ;淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)E16 CGMCC No. 5951固体菌剂,在盆栽实验中对2龄香蕉根结线虫的防治效果为86. 37%，对香蕉根重的增长率为37. 76%，对香蕉株高的增长率为56. 47%，对香蕉地上部分的增长率为38. 03% ;小区实验中对香蕉根结线虫的防治效果为83. 03%,对香蕉果实的增产率为28. 05%。而且，淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus) E16 CGMCCNo. 5951对香蕉枯萎病的防治效果达83. 2%。生物材料信息分类命名淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)菌株编号E16保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称CGMCC地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号保藏日期2012年04月06日保藏中心登记入册编号CGMCC No. 5951下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的淡紫拟青霉E7菌株(汪军，刘磊，李传东，刘昌燕，黄俊生.淡紫拟青霉E7菌株对香蕉根结线虫的致病性和生防效果.中国植保导刊.2008年第10期)，公众可从中国热带农业科学院环境与植物保护研究所获得。下述实施例中的淡紫拟青霉PL04菌株(汪军，黄俊生*，邓国平，赵培静，杨腊英，陈希德.淡紫拟青霉PL04菌株抗逆性及其对香蕉根结线虫的寄生作用.西北农业学报.2009, 18(3) :263-267)，公众可从中国热带农业科学院环境与植物保护研究所获得。下述实施例中的尖孢铼刀菌古巴专化型4号生理小种(Fusarium oxysporumf. sp. cubense race 4，F0C4) B2 菌株(F0C4-B2)(齐兴柱，杨腊英，黄俊生.F0C4 的 2 个过氧化氢酶基因的克隆与表达分析.及其引起的香蕉苗活性氧迸发研究中国农学通报2012，28(15) : 163-169)，公众可从中国热带农业科学院环境与植物保护研究所获得。实施例I、淡紫拟青霉(Paecilomyces Iilacinus)E16CGMCC No. 5951 的分离及鉴
定I、淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus) E16CGMCC No. 5951 的分离从中国海南省香蕉种植地选择线虫病重发田中的香蕉植株，采集根部土样，采用透明圈筛选法从土壤里分离拟青霉。选取一定量土样置于加有无菌水和玻璃珠的三角瓶中，180r/min，28°C震荡lh，让土样充分打散，静置lOmin，再用无菌水稀释成不同稀释度的土壤悬浮液，取一定量的土壤悬浮液涂布于壳聚糖选择性培养基中，28°C培养4 6天，挑取单菌落进行平板划线纯化，并置于斜面培养基上培养3天，挑取单菌落进行反复纯化，得·到E16菌株。2、淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus) E16CGMCC No. 5951 的鉴定I)形态鉴定将E16菌株划线接种于查氏培养基上，28°C培养7d，观察菌落形态。另取培养的菌落，适当稀释后于显微镜下观察。结果显示E16菌株在查氏培养基上菌落直径为40mm，菌落很干燥与培养基连接紧密，不易挑取，中央为淡红色，周围为白色；菌丝呈绒毛状，长而细。显微镜下观察到的形态特征分生孢子梗呈扫帚状，菌丝较长，分生孢子为椭圆形，成串呈不分枝的链状。2)分子鉴定E16菌株经反复纯化后，于查氏培养基上划线培养，将单菌落进行PCR扩增，将扩增产物用凝胶回收试剂盒回收纯化，由宝生物工程(大连)有限公司測定得拟青霉E16的ITS序列，将所得序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST分析，结果表明，与该菌株ITS序列最为接近的为淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus),其ITS序列同源性为97%,结合菌株E16的形态学特点,将该菌株鉴定为淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)。其中，淡紫拟青霉(Paecilomyces Iilacinus)E16CGMCCNo. 5951的ITS序列如序列表中的序列I所
/Jn o淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus) E16已于2012年04月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 5951。3、淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus) E16CGMCC No. 5951 的抗逆特性淡紫拟青霉(PaecilomycesIilacinus)E16CGMCC No. 5951 有较强的抗逆性,淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus) E16CGMCC No. 5951菌落生长和产抱的适宜温度为5 400C，最适温度为29°C;在pH值4 13范围内的PDA培养基中均可以生长，其最适生长pH值为7 ;在NaCl浓度为0. 05 0. 25mol/L条件下，NaCl对菌株E16的生长有一定的促进作用有较强的耐盐能力；对氯霉素有较强的耐受性。实施例2、淡紫拟青霉(Paecilomyces Iilacinus)E16CGMCC No. 5951 对南方根结线虫(番茄)卵的寄生性I、南方根结线虫卵粒悬浮液的制备将带有大量南方根结线虫(Meloidogyne incognita)根结的番爺病根洗净,在解剖镜下挑取卵囊，用1%的次氯酸钠表而消毒3min，后无菌水漂洗5次，掏碎卵囊用灭菌水调节使悬浮液中卵粒为100个/mL。2、淡紫拟青霉孢子悬浮液的制备将淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus) E16CGMCC No. 5951 菌株、淡紫拟青霉E7菌株和淡紫拟青霉PL04菌株分别在PDA培养基上，25°C下培养7d (天)后，用无菌水将培养基上的孢子洗出，用血球计数板计数算出孢子浓度，配制成浓度为4X106cfu/mL的孢子悬浮液。3、淡紫拟青霉孢子悬浮液对南方根结线虫卵孵化的影响实验设四个处理，分别为淡紫拟青霉E16组、淡紫拟青霉E7组、淡紫拟青霉PL04组和对照组。
淡紫拟青霉E16组按照如下方法处理在经过高压灭菌的培养皿加入ImL卵粒悬浮液，姆皿加4mT,淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus) E16CGMCC No. 5951抱子悬浮液(4X106cfu/mL)，25°C、培养3d后隔日镜检，统计各皿中孵化幼虫数。淡紫拟青霉E7组按照如下方法处理在经过高压灭菌的培养皿加入ImL卵粒悬液，每皿加4mL淡紫拟青霉E7菌株孢子悬浮液(4 X IO6Cf u/mL)，25°C、培养3d后隔日镜检，统计各皿中孵化幼虫数。淡紫拟青霉PL04组按照如下方法处理在经过高压灭菌的培养皿加入ImL卵粒悬浮液，每皿加4mL淡紫拟青霉PL04菌株孢子悬浮液(4X 106cfu/mL)，25°C、培养3d后隔日镜检，统计各皿中孵化幼虫数。对照组按照如下方法处理在经过高压灭菌的培养皿加入ImL卵粒悬浮液，每皿加4mL无菌水，25°C、培养3d后隔日镜检，统计各皿中孵化幼虫数。其中，上述四个处理各3个重复，每个重复设3个培养皿。第9天，按照下式计算卵孵化率和卵相对寄生率，利用Excel 2003进行数据处理卵孵化率(％)=[孵化幼虫数/ (孵化幼虫数+未孵化卵粒数)]X 100。卵相对寄生率(%) = [(对照卵孵化率一处理卵孵化率)/对照卵孵化率]X 100。试验结果如表I所示，表明淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)E16CGMCCN0. 5951孢子悬液对南方根结线虫卵的孵化有明显的抑制效果。在培养9天时，对照(CK)的卵孵化率达到97. 22%，所有的卵粒已基本孵化成幼虫，而淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus) E16CGMCC No. 5951 的却只有 59. 22% 孵化，淡紫拟青霉(Paecilomyces Iilacinus)E16CGMCC No. 5951孢子对卵的相对寄生率达到39. 08%优于淡紫拟青霉E7和淡紫拟青霉PL04菌株。表I.淡紫拟青霉孢子悬液对南方根结线虫卵的孵化的影响
权利要求
1.淡紫拟青霉(PaecilomycesIilacinus),其特征在于所述淡紫拟青霉(Paecilomyces Iilacinus)的菌株号为E16,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 5951。
2.权利要求I所述的淡紫拟青霉(PaecilomycesIilacinus)在生产分生孢子和/或菌丝体中的应用。
3.下述I)-6)的产品，它的活性成分是权利要求I所述的淡紫拟青霉(PaecilomycesIiiacinus) O杀线虫剂； 2)増加香蕉果实产量的产品； 3)増加香蕉根重的产品； 4)增加香蕉株高的产品； 5)増加香蕉地上部分重量的产品； 6)防治由尖孢铼刀菌古巴专化型(Fusairiumoxysporum f. sp. cubense)引起的植物病害的产品。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于所述淡紫拟青霉(PaecilomycesIilacinus)为分生孢子或/和菌丝体。
5.根据权利要求3或4所述的产品，其特征在于所述杀线虫剂用于防治由南方根结线虫(Meloidogyne incognita)和爪H圭根结线虫(Meloidogyne Goeidi)中的至少一种引起的植物虫害。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于所述植物虫害为香蕉根结线虫病。
7.权利要求I所述的淡紫拟青霉(PaecilomycesIilacinus)在制备植物杀线虫剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述植物杀线虫剂的靶标线虫为南方根结线虫(Meloidogyne incognita)和爪日圭根结线虫(Meloidogyne Goeidi)中的至少一种。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于所述植物杀线虫剂用于防治香蕉根结线虫病。
10.权利要求I所述的淡紫拟青霉(PaecilomycesIilacinus)在制备下述至少ー种产品中的应用 1)増加香蕉果实产量的产品； 2)増加香蕉根重的产品； 3)增加香蕉株高的产品； 4)増加香蕉地上部分重量的产品； 5)防治由尖孢铼刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporum f. sp. cubense)引起的植物病害的产品。
全文摘要
本发明公开了一株淡紫拟青霉及其应用。本发明所提供的淡紫拟青霉是所述淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)E16，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.5951。本发明的淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)E16CGMCC No.5951在盆栽实验中对2龄香蕉根结线虫的防治效果为86.37%，对香蕉根重的增长率为37.76%，对香蕉株高的增长率为56.47%，对香蕉地上部分的增长率为38.03%；小区实验中对香蕉根结线虫的防治效果为83.03%，对香蕉果实的增产率为28.05%。
文档编号A01P3/00GK102851219SQ20121035876
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月25日 优先权日2012年9月25日
发明者黄俊生, 汪军, 梁昌聪, 邓国平, 任文彬, 郭立佳 申请人:中国热带农业科学院环境与植物保护研究所