使用质谱检测至少一种碳青霉烯抗性机制的方法
【专利摘要】本发明涉及通过质谱检测样品中至少一种微生物针对至少一种抗菌剂的至少一种抗性标记的方法，其特征在于抗菌剂是碳青霉烯，且所述抗性标记是蛋白质或肽。优选地，所述蛋白质或肽是来自所述微生物的蛋白质。
【专利说明】使用质谱检测至少一种碳青霉烯抗性机制的方法
[0001]本发明涉及微生物学领域。更精确地说，本发明涉及用质谱检测样品中至少一种微生物对碳青霉烯抗性的至少一种机制的方法。
[0002]自从巴斯德发现了微生物以来，微生物体以显微镜和生化分析来研究。这些传统的方法通常冗长乏味，因此很久以来一直在寻找其他分析方法。这就是为什么J.Anhalt和C.Fenselau从1975年起发起了以质谱分析细菌[I]。
[0003]随着这一初步工作，气相色谱与质谱联用的方法被用于微生物细胞壁中脂肪酸的研究[2]。这项技术广泛采用的英语术语是FAME,即脂肪酸甲酯(Fatty Acid MethylEster) 0现在成为一种分类学研究的参考方法。尽管如此，它的应用局限于某些特定的以皂化、水解和分离的方法处理样品的实验室。
[0004]在1996 年，M.Claydon 等[3]以及 T.Krishnamurthy 和 P.Ross [4]的工作证明可以用MALD1-T0F(矩阵辅助的激光解吸离子化-渡越时间，Matrix Assisted LaserDesorption 1nization - Time Of Flight)质谱鉴别不同的细菌种。该分析结合了获取质谱和解释专业软件。十分简单并且可以在几分钟内得出结果。尽管如此，现在还只是应用在药物分析的实验室[5]。其临床应用现在还局限于鉴别细菌和酵母的种类，还没有常规应用于鉴别抗菌剂抗性。
[0005]为了保证最优化的病患护理，对诸如抗生素等抗菌剂的抗性的鉴别是重要的要素。
[0006]推荐其他质谱方法，特别是串联质谱，以满足这些需要。例如，可以引用C.Fenselau等关于用四极子-TOF(Q-TOF)鉴别β -内酰胺酶的工作[6]。
[0007]尽管如此，这些研究结果是通过通过研究仪器获得的，要求高素质的人员，无法应用于日常临床。通常大于I小时/样品的分析时间与微生物分析实验室的工作量是不相容的。
[0008]最近，S.Hofstadler等[7]提出了一种结合PCR扩增微生物基因组和电喷射-TOF(ES1-TOF)检测PCR产物的方法。这种方法现在是全自动的[8]。尽管如此，它要求PCR扩增，其具有分子生物学固有的瑕疵，即提取产量，探针成本等问题。
[0009]在这一背景下，本发明的目的在于提出一种检测碳青霉烯抗性机制的方法，以克服现有技术的不足，也就是提供一种廉价的方法，特别是与分子生物学相比，不使用每个种特异的试剂，在短时间内(少于I小时)得出结果，不要求高素质人员而能够应用于日常临床。
[0010]为了这个目的，本发明提出了一种通过质谱检测样品中至少一种微生物对至少一种抗菌剂的至少一种抗性机制的新方法，其特征在于:抗菌剂是碳青霉烯；以及检测针对至少一类碳青霉烯抗生素的所述抗性机制的标记是蛋白质和/或多肽。
[0011]优选地，抗性标记是来自于所述至少一种微生物的蛋白质。有利的是，几种不同抗菌剂的抗性标记可以同时检测。
[0012]如PCT/FR2010/052181中所示，在检测抗性机制标记之前或同时，所述微生物的类型和/或毒力标记能够通过质谱以相同的方法检测。[0013]至少一种碳青霉烯类抗菌剂的抗性标记理解为以所述性质为特征的蛋白质来源的分子。碳青霉烯是属于β_内酰胺家族的抗生素，其主要代表是亚胺培南、美罗培南、厄他培南和多利培南。这些分子被Bush和Jacoby分类的β -内酰胺酶2df、2f和3a分解([9], Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010 ；54 (3):969-976)。
[0014]确定对至少一种抗菌剂的抗性理解为确定微生物被抗菌剂杀死的敏感性。当科和种不同时抗性机制涉及的蛋白也将不同。
[0015]β -内酰胺酶一β -内酰胺抗性细菌酶一的命名法未标准化。既根据一级结构分为四类(Α到D)，也按照靶底物和对抑制剂的抗性功能性分组(作为概述，见前述Bushand Jacoby[9]) 0对分子分类，测序技术使更精确的分类成为可能:例如，已经描述了 TEM蛋白的183种变体(标记为TEM-1, i从I到183)。对于功能性分类,前述Bush and Jacoby提出了新的功能性亚组:
[0016]-第一组酶是属于C类分子的头孢菌素酶。CMY和FOX是质粒携带的酶，属于这个亚组。
[0017]-第二组酶属于A类和D类分子。这个组自我再分为亚组2b、2be、2br、2ber、2d、2de、2df、2f等。CTX-M(2be)和TEM(包括2be、2br)是属于这个亚组的酶。2b亚组对应被克拉维酸、sulfobactam或三唑巴坦抑制的广谱的β_内酰胺酶。2be亚组对应同样也被克拉维酸、sulfobactam或三唑巴坦抑制的超广谱的β -内酰胺酶(ESBL)。2br亚组对应2b亚组中对克拉维酸、sulfobactam或三唑巴坦的抑制不敏感的β_内酰胺酶。2bf亚组包括对碳青霉烯超广谱的0ΧΑ。2f组对应碳青霉烯酶β -内酰胺酶，例如KPC。
[0018]-第三组包含水解碳青霉烯的金属-β-内酰胺酶，例如MP、VIM, SPM、GIM, SM、AM、KHM、D頂或 NDM。
[0019]NDM-1 β -内酸胺酶于 2010 年被描述(Kumarasamy et al., 2010, Lancet Infect.Dis.，10:597-602)。相当于一种金属-β -内酰胺酶，赋予对除氨曲南外所有β _内酰胺的抗性。
[0020]KPCP -内酰胺酶于 2001 年在美国被描述(Yigit et al., 2001, Antimicrobi0.Agents Chemother.，45:1151-1161),随后遍及世界。相当于A类β -内酰胺酶,赋予对头
孢菌素和碳青霉烯的抗性，尤其是对亚胺培南和美罗培南。
[0021]IMP β -内酸胺酶于 1994 年在日本被描述(Osano et al., 1994, Antimicrobi0.Agents Chemother.，38:71-78),随后遍及世界。相当于金属-β -内酰胺酶,赋予对头孢菌素和碳青霉烯的抗性，但是对替莫西林和氨曲南无效。
[0022]VIM β -内酰胺酶与1999年在欧洲被描述(Lauretti etal., 1999, Antimicrobi0.Agents Chemother., 43:1584-1590)，随后遍及世界。相当于金属-β -内酰胺酶，赋予对头孢菌素和碳青霉烯的抗性，但是对氨曲南无效。
[0023]第一个GES β -内酰胺酶与1998年在法属圭亚那被分离(Poirel etal., 2000, Antimicrobi0.Agents Chemother.，43:622-632)。这种酶(GES-1)赋予 ESBL抗性。从耐受GESi1-内酰胺酶的细菌的第二次分离于2000年在南非完成(Poirel etal., 2001, Antimicrobi0.Agents Chemother.，45:2598-2603)。这种酶(GES-2)赋予对诸如亚胺培南的头孢菌素和碳青霉烯的抗性。
[0024]INDP -内酰胺酶首次描述于 1999 年(Bellais et al.，1999，FEMS Microbi0.Lett., 171:127-132)。相当于金属-β-内酰胺酶，赋予对头孢菌素和碳青霉烯的抗性。
[0025]SME β -内酸胺酶首次描述于 1994 年(Naas et al., 1994, Antimicrobi0.AgentsChemother.，38:1262-1270)。相当于A类β -内酰胺酶,赋予对头孢菌素和碳青霉烯的抗性。
[0026]OXAβ -内酰胺酶(或oxacillinases)对应D类β -内酰胺酶。根据其的初级序列，其能够赋予对头孢菌素或对头孢菌素和碳青霉烯的抗性(Poirel etal., 2010, Antimicrobi0.Agents Chemother., 54:24-38)。
[0027]本发明的方法可以用于检测细菌中对于碳青霉烯的抗性机制。因此，例如，可以根据本发明的方法在其中找到对碳青霉烯的抗性机制的细菌的非穷举性实例有:大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、芽抱杆菌(Bacillus spp)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、气单胞菌(Aeromonas spp)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、假单胞菌(Pseudomonasotitidis)以及阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae),更广泛地说，携带blaNDM-Ι或blaKPC抗性基因的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)微生物。应该进一步注意的是已知抗碳青霉烯的菌株也对头孢菌素和青霉素有抗性。
[0028]因此，根据本发明的方法也使检测对所述抗生素的抗性机制成为可能。
[0029]本发明的方法可以应用的样品是任何容许含有靶微生物的样品。样品可以是生物学来源的，无论是动物，蔬菜还是人。在这个实施方式中，相当于生物流体样品(例如全血、血清、血浆、尿液、脑脊液、组织分泌物)、组织样品或者分离的细胞。在细菌β -内酰胺抗性机制的标记能够用于检测或者在分析前可以进行富集、提取、浓缩、纯化、培养等根据本领域技术人员已知的方法制备的样品可以使用。
[0030]样品可以是工业来源或者根据非穷举的列表可以是空气样品、水样品、表面样品、制成品的一部分或者食物产品。在食物样品中，简单来说，可以包括乳制品(酸奶、奶酪)样品、肉、鱼、蛋、水果、蔬菜、水、饮料(牛奶、果汁、苏打水等)。这些食物样品还可以来自酱或即食餐。最后，食物样品可以来自动物饲料，例如动物膳食。
[0031]在质谱检测的上游，优选地，待分析的样品经过预处理使样品中存在的完整蛋白质片段化而产生多肽，例如用蛋白酶消化或化学试剂反应。事实上，裂解蛋白质可以通过物理化学、生物学或者两者结合处理来实现。在可用的处理中，可以提及以羟自由基处理，特别是H2O2。羟自由基处理导致肽键的切开在任何蛋白质的肽键位置随机发生。羟自由基浓度决定裂解数，以及所得到的肽段的长度。还可以用其他化学处理，例如特异性在甲硫氨酰残基羧基处切开肽键的溴化氰(CNBr)处理。也可以在三氟乙酸中加热蛋白质溶液到1000°C进行天冬氨酰残基上的部分酸裂解。
[0032]尽管如此，酶解处理蛋白优先于物理化学处理，因为其更能保护蛋白结构并且更易控制。“酶解”意味着一个或者多个酶在正确的条件下单独或联合的反应。实施蛋白水解的酶，即蛋白酶在特定位置切割蛋白。每种蛋白酶一般识别一种氨基酸序列，并总是进行同样的切割。某些蛋白酶识别一个氨基酸或两个氨基酸的序列并在其间裂解，而其他蛋白酶只识别更长的序列。这些蛋白酶可以是内切蛋白酶或外切蛋白酶。在已知的蛋白酶中，包括如在W02005/098071中描述的:[0033]-特异性酶,例如胰蛋白酶(trypsin)在Arg和Lys的羧基处切断肽键,细胞内溶素(endolysin)在赖氨酸羰基处裂解肽键,糜蛋白酶(chymotrypsin)在芳香残基(Phe、Tyr和Trp)羧基处水解肽键，胃蛋白酶(pepsin)在芳香残基(Phe、Tyr和Trp)氨基处切割,来源于Staphylococcus aureus V8菌株的蛋白酶V8在Glu残基羧基处裂解肽键；
[0034]-非特异性酶，例如来自细菌Bacillusthermoproteolyticus的嗜热菌蛋白酶(thermolysin)在疏水氨基酸(Xaa_The、Xaa-1Ie> Xaa-Phe)氨基端水解肽键，属于细菌蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)和链霉蛋白酶(pronase)实际上水解所有肽键并能在控制的反应条件(酶浓度和反应时间)下把蛋白转化成寡肽。
[0035]如果反应模式可以兼容，有些蛋白酶可以同时或相继使用。在本发明范围内，样品的消化优选的由蛋白酶执行，例如胰蛋白酶。
[0036]用化学试剂或蛋白酶产生多肽能通过溶液中简单反应的方法实现。还可以通过微波炉[10]或高压[11]，甚至使用超声仪器[12]实现。在后面的三个实施方式中，方案快了很多。
[0037]在如此获得的多肽中，蛋白特异性的多肽被称为蛋白质代表性(proteotypic)肽，也就是将要被质谱分析的。
[0038]根据本发明细菌对碳青霉烯的抗性机制标记是来自可以在其中找到抗碳青霉烯机制的细菌的蛋白。尤其是，所述蛋白被优选地使用酶，更优选地使用胰蛋白酶消化成多肽。
[0039]相似的是，含有细菌抗碳青霉烯机制特征性蛋白标记的样品可以预处理以达到纯化的目的。纯化预处理可以在如上所述的多肽产生步骤之前或之后进行。
[0040]样品纯化处理在本领域技术人员中是众所周知的，尤其是采用离心、过滤、电泳或层析技术。这些分离技术可以单独使用或者彼此联用以获得多维的分离。例如，多维层析可以如T.Fortin等[13]或H.Keshishian等[14]所述,通过离子交换层析和反相层析的联用来实现。在这些文章中，层析介质可以是柱或者筒(固相萃取)。蛋白质代表性肽的电泳或层析级份(或一维或多维层析的保留时间)是每种肽的特征，因此采用这些技术使选择蛋白质代表性肽或多肽进行分析成为可能。这样区别产生的多肽可以增加后续质谱分析的特异性。
[0041]目的在于分离多肽的电泳或层析技术的一个变形在于特异性纯化N-糖肽([15]以及专利申请W02008/066629)。尽管如此，这样的纯化只可以定量进行了 N-糖基化的翻译后修饰的多肽。不是所有的蛋白都会糖基化，这限制了其应用。
[0042]作为分析和检测不同类型分子的有力工具，用于本发明方法的质谱是本领域技术人员所共知的。一般来说，任何可以被电离的分子都可以根据其分子量由质谱仪检测。根据被测分子的自然状态，无论蛋白还是代谢源，某些质谱技术会更合适。然而，无论用质谱方法检测什么，后面都包括把靶分子电离为所谓分子离子的步骤，即本实施方式中，电离特征标记的步骤和分离质谱获得的分子离子的步骤。
[0043]因此，所有的质谱包含:
[0044]-用于电离待分析样品中存在的标记的电离源，即给予这些标记正或负电荷；
[0045]-用于根据其荷质比分离电离标记或分子离子质量分析仪；
[0046]-用于测量分子离子直接产生的信号或以后述方法自分子离子产生的离子的检测仪。
[0047]电离步骤(采用质谱所必需的)可以通过任何本领域技术人员已知的方法进行。电离源可以使待分析分子转化成气态的并且电离的状态。电离源可以用正电荷模式研究阳离子，或者负电荷模式研究阴离子。存在几种类型的电离源，可基于要寻找的结果和要分析的分子使用这些电离源。尤其是包括:
[0048]-电子电离(EI)、化学电离(Cl)和解吸化学电离(DCI)；
[0049]-快原子轰击(FAB)、亚稳态原子轰击(MAB)或离子轰击(SMS，LSMS)；
[0050]-电感耦合等离子体(ICP)；
[0051]-大气压化学电离(APCI)和大气压光电离(APPI)；
[0052]-Electronebulisation 或点喷射(ESI)；
[0053]-矩阵辅助激光解吸/电离(MALDI)、表面活化激光解吸/电离(SELDI)或硅解吸/ 电离(DIOS)；
[0054]-与亚稳态种相互作用的电离/解吸(DART)。
[0055]具体而言，电离进行如下:把含有靶分子的样品导入电离源，在此分子在气态下被离子化并转化成对应最初分子的分子离子。电喷射电离(ESI)源可以通过使分子从液态逐渐变气态而电离。在正电荷模式中，如此得到的存在于液相中的对应于分子的有1、2甚至3或者更多的额外质子的分子离子带有1、2甚至3或者更多的电荷。例如，当靶分子是一种蛋白，分离靶蛋白后获得的蛋白质代表性肽使用电喷射源在正电荷模式的电离产生气相的带1、2甚至3或者更多的额外质子多肽离子，其带有1、2甚至3或者更多的电荷，并可以从液相移动到气相[16]。这类源尤其适合先用反相液相色谱分离获得的靶分子或蛋白质代表性肽。然而，样品中存在的分子的电离得率(ionisation yield)会随着浓度和存在的不同物种的天然状态而改变。这一现象导致了本领域技术人员所周知的矩阵效应。
[0056]MALDI电离源可以使来自固态样品的分子电离。
[0057]根据荷质比分离离子化标记的步骤在质量分析器中进行，本领域技术人员公知的任何质量分析器都适用。其可以由低分辨率分析器、四极子(quadripole或quadrupole (Q))、3D 离子陷讲(iron trap, IT)或线性离子陷讲(linear iron trap、LIT)也称离子陷阱、高分辨率分析器组成，高分辨率分析器使其可以测量被分析物的确切质量，并且特别使用了连接于扇形电场的扇形磁场、渡越时间(TOF)、傅里叶变换离子回旋加速(FT-1CR)、轨道阱。
[0058]依靠其荷质比的分子离子的分离可以只进行一次(单质谱或MS)，或者可以进行几次连续的分离。当执行了两次连续的MS分离时，该分析被称为MS/MS或MS2。当执行了三次连续的MS分离时，该分析被称为MS/MS/MS或MS3，一般地说，当执行了 η次连续的MS分尚时，该分析被称为MSn。
[0059]在使用了几次连续的分离的技术之中，检测或分析单一靶分子的选择反应监测(Selected Reaction Monitoring, SRM)模式,或者检测或分析数种祀分子的多反应监测(Multiple Reaction Monitoring, MRM)模式是MS2分离的具体应用。近似地,MRM3模式是MS/MS/MS分离的具体应用。这就称为靶向质谱。
[0060]在单MS模式检测的情况下，所得到的的分子离子的荷质比与待检测的分子有关。在MS/MS模式检测的情况下，与MS分析相比，基本上要添加两步:[0061]-分子离子(后称为前体离子，precursorions)的破碎，以产生所谓第一代碎片离子(fragment ions),以及
[0062]-根据其与前体离子荷质比(m/z)相应的质量(m/z)2、比例(m/zh分离所谓的第一代碎片离子。
[0063]因此，这样获得的第一代碎片离子的荷质比与待测的靶分子有关。第一代碎片离子是来源于前体离子，经过破碎步骤，并且其荷质比m/z不同于前体离子的一种离子。
[0064](111/2)2和(m/zh对被称为转换(transitions),代表待测的典型离子。
[0065]待测的与靶分子有关的典型离子的选择是由本领域技术人员根据标注方法进行的。在再现性和可靠性方面，其选择有利于带来最敏感、最特异以及最有鲁棒性的实验可能性。在所发展的用于选择蛋白质代表性肽(m/z) i的方法中，选择基本上是基于响应强度的。更具体地说，可以参考V.Fusaro et al.[17]。本领域技术人员使用诸如来自AppliedBiosystems或MRMaid的MIDAS和MRM Pilot软件[18]的市场上可以买到的软件可以预测所有可能的转换对。还可以使用F Desiere et al.[19]构建的称为PeptideAtlas的数据库编辑科学界所描述的所有肽的MRM转换。P印tideAtlas数据库可以在因特网上免费使用。对于非蛋白质分子，也可以使用数据库，例如可通过Applied Biosystems公司(美国)的Cliquid软件进入的数据库。
[0066]—种选择蛋白质代表性肽的(m/z)2和(HiA)1的替换方法在于使用在其他研究中得到的MS/MS破碎光谱。例如，该研究可以是蛋白质组分析发现和坚定生物标记的各阶段。这一方法是由Thermo Scientific在用户会议中提出的[18]。这使得从通过SIEVE软件(Thermo Scientific )检测而鉴定的肽产生候选转换清单成为可能。J.Mead等[18]详细说明了选择离子的(111/2)2和(m/zh确定标准如下:
[0067]-必须避免有内部裂解位点的肽，即内部有赖氨酸和精氨酸的肽，除非赖氨酸或精氨酸后是脯氨酸；
[0068]-必须避免有天冬酰胺或谷氨酰胺的肽，因为会脱氨基；
[0069]-必须避免N端有谷氨酰胺或谷氨酸的肽，因为会自发环化；
[0070]-必须避免有甲硫氨酸的肽，因为会被氧化；
[0071]-必须避免有半胱氨酸的肽，因为会在潜在的变性、还原和封闭硫醇功能的步骤中被不可逆转的修饰；
[0072]-有脯氨酸的肽被认为是有利的，因为会产生在MS/MS中非常强烈单峰的集中片段。然而，非常强烈的单峰片段并不能证实复杂混合物中转换的同一性。事实上，只有同时出现几个特征碎片才可以证明所找的前体离子确实被检测到；
[0073]-必须避免在临近C端的位置(位置η-1)或相对于C端的第二位(位置n_2)为脯氨酸的肽，因为在这种情况下一般认为第一代肽片段太小而不具备充分特异性；
[0074]-优选地选择比前体(m/z)!更大的片段以增强特异性。为了这一目的，必须选择双电荷前体离子和最集中的(m/z) i大于前体的第一代离子片段，即单电荷第一代碎片离子。
[0075]对所选的前体离子的破碎是在破碎单元中进行的，例如三连四极子模型、离子陷阱模型或渡越时间模型，这些也能分离离子。破碎的进行照例是在电场中与惰性气体(例如IS气和氮气)碰撞，用强光源进行光激发或者光分解，与电子或放射物碰撞，应用潜在的差异(例如在渡越时间管中)，或者其他的活化模式。电场的性质决定了破碎的强度和性质。因此，在由惰性气体存在时应用的电场，例如在四极子中，决定了提供给离子的碰撞能。本领域技术人员将优化碰撞能以提高待测的转换的敏感性。举例来说，在ABSCIEX OTRAP.K,: 5500质谱(Applied Biosystems公司，美国福斯特城)的q2中，可以于5到ISOe-V之间改变碰撞能。相似地，本领域技术人员将优化碰撞步骤的持续时间和激发能(例如在离子陷阱中)以进行最敏感的实验。举例来说，在AB SCIEX QTRAP(R) 5500质谱(Applied Biosystems公司)的Q3中，持续时间(称为激发时间)在0.010到50ms之间，激发能在O到I (任意单位)之间可以进行改变。
[0076]最后，在常规仪器中检测所选典型离子，特别是使用探测器和处理系统的方法。探测器收集离子并产生电信号，其强度取决于收集的离子的数量。得到的信号随后被放大以使其可以被计算机处理。计算机数据处理可以集合地转换质谱探测器得到的信息。
[0077]SRM模式甚或MRM模式的原理是特别地选择一个前体离子，将其破碎，然后特别地选择一个碎片离子。对于这些应用，三连四极子或偶联的三连四极子/离子陷阱仪器被普遍使用。
[0078]在用于MS2模式的三连四极子(Qlq2Q3)的个案中，以分析或检查靶蛋白为目的，第一个四极子(Ql)可以根据荷质比(m/z)过滤在较早的消化步骤中获得的待测蛋白质特有的蛋白质代表性肽相应的分子离子。只有与要找的蛋白质代表性肽荷质比相同的肽才被散发到第二个四极子(q2)并作为接下来破碎的前体离子，这里的荷质比被称为(m/zh。q2分析器能够使荷质比为的肽破碎成为第一代碎片离子。破碎一般通过前体肽与诸如氮气或氩气的惰性气体在q2中碰撞获得。第一代碎片离子散发到第三个四极子(Q3)中，其根据特定的称为(m/z)2的荷质比过滤第一代碎片离子。只有荷质比与要找的蛋白质代表性肽的(m/z)2相同的碎片离子被散发到探测器中以检测甚或定量。
[0079]当本发明的方法采用的质谱是串联质谱(MS/MS spectrometry) (MS2、MS3、MS4或MS5)时，可以将几个质量分析器连在另一个上。例如，第一个分析器分离离子，碰撞单元使其可以破碎离子，第二个分析器分离碎片离子。诸如离子陷阱和FT-1CR的某些分析器把几个分析器组合成一个，使其可以破碎离子并直接分析碎片。
[0080]根据本发明优选的实施方式，本发明的方法包括以下特征中的一个或几个:
[0081]-为得到至少一种抗菌剂的潜在抗性的属性而采用的质谱是MS/MS谱，其有利于产生待检测或定量的分子特异的碎片，因而有利于向试验方法提供极大的特异性；
[0082]-MS/MS谱是MRM，这有利于利用质谱仪的几十毫秒的分析循环时间，使其能够以高度的敏感性以多路复用方式检测或定量大量不同的分子。
[0083]-同时优选地，在适用的情况下，类型属性和毒力因子的确定和对至少一种抗菌剂的抗性的标记的确定是在同一个质谱设备中进行的，这有利于减少分析时间和设备的花费，还会促进结果的处理和产出。
[0084]除确定抗菌剂的抗性外，还需要鉴别待测样品中的微生物。
[0085]鉴别微生物的方法是本领域技术人员公知的，例如Murray P.R.等在临床微生物学手册(Manual of Clinical Microbiology) 2007年第九版中所描述的那样,尤其是在第一卷第三部分第十五和十六章关于细菌和酵母、第二卷第六部分第八十二章关于病毒、第二卷第十部分第一百三十五章关于原生动物的内容中。作为常规鉴别方法的例子，上述内容可以包括生物属性的确定，例如，用Vitek2(bi0M6rieuX)鉴别卡，甚或以基于某些基因的存在和其序列的研究的鉴别标准，使用分子生物学技术。
[0086]鉴别可以从鉴别的样品直接进行，或者可以通过本领域技术人员公知的方法用为要找的微生物种量身定做的最适培养基和培养条件培养样品中含有的微生物，如MurrayP.R.等在临床微生物学手册(Manual of Clinical Microbiology) 2007年第九版第一卷第三部分第十四章所描述的，特别是在第一卷第四部分第二十一章中关于细菌、第二卷第六部分第八十一张关于病毒、第二卷第八部分第一百一十七章关于酵母和第二卷第十部分第一百三十四章关于原生动物的内容中。
[0087]因此，一般来说，在使用生物化学方法鉴别样品中细菌的情况下，首先需要获得纯培养物形式的细菌，例如在接种于琼脂之后。在特定情况下分子生物学(PCR)可以直接用于待分析样品。
[0088]除了培养微生物，还可以用活化表面的方法直接从样品中捕获以浓缩微生物。W.-J.Chen等[10]描述了这样一种方法，他们以添加有活化表面的磁珠Fe304/Ti02捕获了不同种的细菌。还可以用其他方法进行捕获，例如用凝集素(lectin)，或者抗体，或者万古霉素捕获。捕获可以浓缩微生物，从而减少甚至排除培养步骤。这相当大的节省了时间。
[0089]鉴别还可以用质谱进行，根据前面描述的技术，优选用MS、MS/MS甚或用构成本发明一个【具体实施方式】的连接了 MS/MS谱的MS。在这种情况下，样品也可以经受培养的步骤，例如接种到琼脂上。
[0090]MS鉴别方法的使用的进步在于可以在几分钟内得以实现，而且要求单分析器的质谱仪，也就是说比串联质谱MS/MS的设备简单。。
[0091]通过连接了 MS/MS谱的MS鉴别方法的使用也是更进步的。可以检查MS所发现的离子的同一性，这样就提高了分析的特异性。
`[0092]MRM型MS/MS鉴别方法的使用的好处在于比常规的连接了 MS/MS谱的MS方法更敏感更简单。这种方法既不要求高性能软件以处理获得MS谱和MS/MS谱之间的信息，也不要求在设置连接MS和MS/MS谱的机器参数时做改变。
[0093]如S.Vaidyanathan等[26]或者R.Everley等[27]描述的那样,用MS鉴别的方法可以和电喷射源一起用于层析分离后的粗样品。这样，不同的m/z范围可以鉴别微生物。
S.Vaidyanathan 等使用了 200 到 2000Th 之间的范围，而 R.Everley 等使用了 620 到 2450Th之间的范围。质谱还可以去卷积以获取蛋白的质量而不依靠其电荷状态。因此R.Everley等使用大约5,000到50，OOODa之间的质量。或者，使用MS的鉴别方法也可以如Claydon等[3]和T.Krishnamurthy与P.Ross [4]所描述的那样采用添加MALD1-T0F。分析结合了质谱的获取和专业软件的翻译。非常简单且能够在几分钟内得以实现。这种鉴别方法在医学分析实验室中越来越广泛传播。
[0094]通过样品中存在的其蛋白采用连接MS/MS的MS鉴别细菌被很多团队广泛应用。举例来说，上述包括Manes N.等[29]最近的工作，他们研究肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)的妝组(peptidome),或者 R.Nandakumar 等[30]或 L.Hernychova 等[31]的工作，他们了细菌的以胰蛋白酶进行蛋白消化后的蛋白质组。传统的方法包括i )获得质谱，? )依次选择质谱中获得的有强烈信号的每个前体离子，iii)依次破碎每个前体离子并获得其 MS/MS 谱，iv )通过诸如 Mascot (Matrix Science、London、United Kingdom)或 SEQUEST (Thermo Scientific、Waltham、United States of America)的软件查询诸如SffISS-PROT或NCBI的蛋白质数据库，以鉴别有很大可能性与MS/MS谱发现的肽相匹配的肽。如果鉴别出种特征的蛋白质或多肽，这种方法就可以导致微生物的鉴别。
[0095]使用质谱的一个优势在于，在细菌对内酰胺抗性机制的标记的实施方式中，其对定量分子尤其有效。有鉴于此，使用了电流强度检测，其与靶分子的量是成比例的。因此，测量的电流强度可以作为定量方法使确定存在的靶分子的量成为可能，这个量的特征在于以国际标准单位mol/m3或kg/m3、或者这些单位的倍数或分数、或者国际标准单位的通常的派生物(其中包括倍数或分数)表达。举一个非限制性的例子，定量方法的特征单位诸如 ng/ml 或 fmol/L.[0096]然而，必须进行标定以使相当于检测的离子所引发的电流强度的测量的峰面积与待测的靶分子的量相关联。为了这个目的，在本发明的架构中，采用质朴中常用的标定。MRM实验通常以添加外参或者优选地添加内参(例如T.Fortin等[13]所描述的)来标定。如果靶分子是使分析感兴趣的分子成为可能的蛋白质代表性肽，定量方法和靶蛋白质代表性肽(继而是感兴趣的蛋白)的量的关联是通过相对于其检测的量已知的标准信号标定测量到的信号而获得的。标定可以用标定曲线进行，例如以连续的注射不同浓度的标准蛋白质代表性肽(外标定)，或者优选的用重肽(heavy peptide)作为内参进行内标定，例如根据如下所述的AQUA、QconCAT或PSAQ法。“重肽”理解为蛋白质代表性肽相应的肽，但是其中的一或几个碳12原子(12C)被碳13 (13C)取代，并且/或者一或几个氮14原子(14N)被氮15 (15N)取代。
[0097]在美国专利申请2004/0229283中也提出将重肽用作内参(AQUA)。原理是以含有较天然的同位素更重的同位素的氨基酸人工合成蛋白质代表性肽。例如，这些氨基酸是通过以碳13(13C)取代碳12原子(12C),或者以氮15 (15N)取代氮14原子(14N)获得的。如此合成的人工肽(AQUA)具有与天然肽严格相同的物理化学性质(除了更大的质量)。通常在质谱分析的上游，例如在引起感兴趣的蛋白的裂解的处理和处理后获得的肽的分馏步骤之间，人工肽以给定浓度添加到样品。这样，AQUA肽与待分析的天然肽在肽分馏期间共纯化。于是，这两种肽被同时注入质谱仪以检测。然后它们在电离源中经历同样的电离得率。天然肽和已知浓度的AQUA肽的峰面积的比较，可以计算天然肽的浓度，从而得到待测蛋白的浓度。AQUA技术的一个变型由J.-M.Pratt等[32]以QconCAT的名称提出。这个变型在专利申请W02006/128492中也进行了描述。它由连接各种AQUA肽和产生重重组蛋白形式的人工多肽组成。重组蛋白以含有重同位素的氨基酸合成。用这种方法可以以较低的开销获得标定同时进行的几个蛋白的检测的参照。QconCAT参照一开始即被加入，在引起蛋白的裂解的处理上游，如果存在蛋白质分馏、变性、还原和封闭蛋白硫醇功能的步骤，则在其之前。因此，QconCAT参照与天然蛋白经历同样的引发蛋白裂解的处理周期，这使其可以从引发蛋白裂解的步骤开始顾及得率。事实上，天然蛋白的处理，尤其是消化可能并不完全。在这种情况下，使用AQUA参照会导致低估天然蛋白的量。因此为了完全的检测，可能从引发蛋白裂解的步骤开始顾及得率是重要的。然而，V.Brun等[33]表示QconCAT参照有时不能完全再现处理的得率，尤其是消化天然蛋白，无疑是因为与QconCAT蛋白的三维构象不同。
[0098]在此之后，V.Brun等[33]提出使用被称为PSAQ的方法，并在专利申请W02008/145763中进行描述。在这个实施方式中，内参是与天然蛋白的序列相同的重组蛋白，但以中氨基酸合成。合成实在体外以重氨基酸进行的。这一参照具有与天然肽严格相同的物理化学性质(除了更大的质量)。参照一开始即被加入，当存在蛋白分馏步骤时，则在其之前。PSAQ展现出与天然蛋白同样的处理得率，尤其是消化处理。如果进行肽分馏步骤，裂解后获得的重肽也与天然肽共纯化。于是，两种肽同时被注入质谱仪以定量分析。然后，它们在电离源中经历相同的电离得率。PSAQ方法中比较天然肽和参照肽可以顾及分析方法中所有步骤地计算待测蛋白的浓度。[0099]所有这些名为AQUA、QconCAT或PSAQ或其他标定技术，用于质谱分析尤其是MRM或MS分析的技术可以用于在本发明构架范围内进行标定。
[0100]优选地，根据本发明，检测方法中所用的质谱是MS/MS。更加优选地，质谱是MRM。
[0101]本发明的方法可以检测对碳青霉烯的抗性，其特征在于检测至少一种肽作为抗性标记。优选地，所述抗性标记肽从蛋白质NDM、KPC、GES、IMP, IND、SME, VIM或OXA中选择。
[0102]具体而言，检测一种由NDM蛋白的表达引发的抗碳青霉烯的机制，其特征在于检测至少一种选自NDM蛋白及其不同序列变体SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.1078到SEQ IDN0.1080 的肽。
[0103]SEQ ID N0.1:
[0104]MELPNMHPVAKLSTALAAALMLSGCMPGEIRPTIGQQMETGDQRF ⑶ LVFRQLAPNVWQHTSYLDMPGFGAVASNGLIVRDGGRVLVVDTAWTDDQTAQILNWIKQEINLPVALAVVTHAHQDKMGGMDALHAAGIATYANALSNQLAPQEGMVAAQHSLTFAANGWVEPATAPNFGPLKVFYPGPGHTSDNITVGIDGTDIAFGGCLIKDSKAKSLGNLGDADTEHYAASARAFGAAFPKASMIVMSHSAPDSRAAITHTARMADKLR
[0105]SEQ ID N0.1078
[0106]MELPNMHPVAKLSTALAAALMLSGCMAGEIRPTIGQQMETGDQRF ⑶ LVFRQLAPNVWQHTSYLDMPGFGAVASNGLIVRDGGRVLVVDTAWTDDQTAQILNWIKQEINLPVALAVVTHAHQDKMGGMDALHAAGIATYANALSNQLAPQEGMVAAQHSLTFAANGWVEPATAPNFGPLKVFYPGPGHTSDNITVGIDGTDIAFGGCLIKDSKAKSLGNL⑶ADTEHYAASARAFGAAFPKASMIVMSHSAPDSRAAITHTARMADKLR
[0107]SEQ ID N0.1079
[0108]MELPNMHPVAKLSTALAAALMLSGCMPGEIRPTIGQQMEIODQRFGDLVFRQLAPNVWQHTSYLDMPGFGAVASNGLIVRDGGRVLLVDTAWTDDQTAQILNWIKQEINLPVALAVVTHAHQDKMGGMDALHAAGIATYANALSNQLAPQEGLVAAQHSLTFAANGWVEPATAPNFGPLKVFYPGPGHTSDNITVGIDGTDIAFGGCLIKDSKAKSLGNLGDADTEHYAASARAFGAAFPKASMIVMSHSAPDSRAAITHTARMADKLR
[0109]SEQ ID N0.1080
[0110]MELPNMHPVAKLSTALAAALMLSGCMPGEIRPTIGQQMETGDQRF ⑶ LVFRQLAPNVWQHTSYLDMPGFGAVASNGLIVRDGGRVLVVDTAWTDDQTAQILNWIKQEINLPVALAVVTHAHQDKMGGMDALHAAGIATYANALSNQLAPQEGMVAAQHSLTFAANGWVEPATAPNFGPLKVFYPGPGHTSDNITVGIDGTDIAFGGCLIKDSKAKSLGNLGDADTEHYAASARAFGAAFPKASMIVMSHSAPDSRAAITHTARMADKLR
[0111]优选地，所述从序列为SEQ ID N0.2到SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.1083的肽中选
择的肽定义如下:
[0112]
【权利要求】
1.一种通过质谱检测样品中至少一种微生物针对至少一种抗菌剂的至少一种抗性标记的方法，其特征在于: a)抗菌剂是碳青霉烯；以及 b)所述抗性标记是蛋白质或肽。
2.权利要求1的检测方法，其中所述质谱是串联质谱。
3.权利要求2的检测方法，其中所述串联质谱是多反应监测。
4.权利要求1-3中任一项的检测方法，其中所述抗性标记是来源于所述至少一种微生物的蛋白质。
5.权利要求4的检测方法，其中来源于所述微生物的蛋白质被消化成肽。
6.权利要求5的检测方法，其中用酶进行所述消化。
7.权利要求6的检测方法，其中所述酶是胰蛋白酶。
8.权利要求1-7中任一项的检测方法，其中所述抗性标记是NDM、KPC、GES、IMP,IND、SME、VIM或OXA型的蛋白质或肽。
9.权利要求1-8中任一项的检测方法，其中所述抗性标记是选自序列为SEQID N0.2到 SEQ ID N0.9 以及 SEQ ID N0.1083 的肽的 NDM 肽。
10.权利要求9的检测方法，其中所述抗性标记是选自序列为SEQID N0.2、SEQ IDN0.3、SEQ ID N0.5 或 SEQ ID N0.7 的肽的 NDM 标记。
11.权利要求1-8中任一项的检测方法，其中所述抗性标记是选自序列为SEQIDN0.20 到 SEQ ID N0.33、SEQ ID N0.1094、SEQ ID N0.1096 和 SEQ ID N0.1097 的肽的 KPC肽。
12.权利要求11的检测方法，其中所述抗性标记是选自序列为SEQID N0.20、SEQ IDN0.21、SEQ ID N0.23、SEQ ID N0.25、SEQ ID N0.28、SEQ ID N0.29、SEQ ID N0.31 或者 SEQID N0.32的肽的KPC标记。
13.权利要求1-8中任一项的检测方法，其中所述抗性标记是选自序列为SEQIDN0.51、SEQ ID N0.52、SEQ ID N0.54到SEQ ID N0.58、SEQ ID N0.61到SEQ ID N0.75、SEQID N0.77 到 SEQ ID N0.79 的肽的 GES 标记。
14.权利要求13的方法，其中所述抗性标记是选自序列为SEQID N0.51、61、64、70、73、74、79的肽的GES标记。
15.权利要求13的方法，其中所述抗性标记是选自序列为SEQID N0.54、55、66、67、68、69、71、77、78 的肽的 GES 标记。
16.权利要求1-8的检测方法，其中所述抗性标记是选自序列为SEQID N0.106、SEQID N0.108 到 SEQ ID N0.130,SEQ ID N0.133 到 SEQ ID N0.173,SEQ ID N0.175 到 SEQ IDN0.180的肽的IMP标记。
17.权利要求16的检测方法，其中所述抗性标记是选自序列为SEQID N0.106,SEQ IDN0.108、SEQ ID N0.109、SEQ ID N0.110、SEQ ID N0.112、SEQ ID N0.113、SEQ ID N0.115、SEQ ID N0.116、SEQ ID N0.117、SEQ ID N0.118、SEQ ID N0.121、SEQ ID N0.124、SEQ IDN0.126、SEQ ID N0.127、SEQ ID N0.128、SEQ ID N0.129、SEQ ID N0.130、SEQ ID N0.133、SEQ ID N0.134、SEQ ID N0.135、SEQ ID N0.136、SEQ ID N0.137、SEQ ID N0.138、SEQ IDN0.139、SEQ ID N0.140、SEQ ID N0.141、SEQ ID N0.142、SEQ ID N0.143、SEQ ID N0.144、SEQ ID N0.145、SEQ ID N0.146、SEQ ID N0.147、SEQ ID N0.148、SEQ ID N0.149、SEQ IDN0.150、SEQ ID N0.151、SEQ ID N0.152、SEQ ID N0.153、SEQ ID N0.154、SEQ ID N0.155、SEQ ID N0.156、SEQ ID N0.157、SEQ ID N0.158、SEQ ID N0.159、SEQ ID N0.160、SEQ IDN0.161、SEQ ID N0.162、SEQ ID N0.163、SEQ ID N0.164、SEQ ID N0.165、SEQ ID N0.166、SEQ ID N0.167、SEQ ID N0.168、SEQ ID N0.169、SEQ ID N0.170、SEQ ID N0.171、SEQ IDN0.172、SEQ ID N0.173、SEQ ID N0.175、SEQ ID N0.176、SEQ ID N0.177、SEQ ID N0.179、SEQ ID N0.180的肽的MP标记。
18.权利要求16的检测方法，其中所述抗性标记是选自序列为SEQID N0.109,SEQ IDN0.143、SEQ ID N0.144、SEQ ID N0.148、SEQ ID N0.149、SEQ ID N0.150、SEQ ID N0.151、SEQ ID N0.154、SEQ ID N0.155、SEQ ID N0.156、SEQ ID N0.159、SEQ ID N0.165、SEQ IDN0.169,SEQ ID N0.170,SEQ ID N0.17USEQ ID N0.172,SEQ ID N0.173 的肽的 MP 标记。
19.权利要求1-8中任一项的检测方法，其中所述抗性标记是选自序列为SEQIDN0.188 到 SEQ ID N0.197,SEQ ID N0.200、SEQ ID N0.20KSEQ ID N0.203 到 SEQ ID N0.262的肽的I ND标记。
20.权利要求19的检测方法，其中所述抗性标记是选自序列为SEQID N0.188,SEQ IDN0.189、SEQ ID N0.190、SEQ ID N0.191、SEQ ID N0.192、SEQ ID N0.193、SEQ ID N0.194、SEQ ID N0.195、SEQ ID N0.197、SEQ ID N0.201、SEQ ID N0.203、SEQ ID N0.204、SEQ IDN0.205,SEQ ID N0.206,SEQ ID N0.207,SEQ ID N0.208,SEQ ID N0.209,SEQ ID N0.210、SEQ ID N0.211、SEQ ID N0.212、SEQ ID N0.213、SEQ ID N0.215、SEQ ID N0.216、SEQ IDN0.218,SEQ ID N0.219,SEQ ID N0.220,SEQ ID N0.221,SEQ ID N0.222,SEQ ID N0.225、SEQ ID N0.226、SEQ ID N0.227、SEQ ID N0.228、SEQ ID N0.233、SEQ ID N0.234、SEQ IDN0.235,SEQ ID N0.236,SEQ ID N0.237,SEQ ID N0.238,SEQ ID N0.239,SEQ ID N0.240、SEQ ID N0.241、SEQ ID N0.242、SEQ ID N0.243、SEQ ID N0.244、SEQ ID N0.245、SEQ IDN0.246、SEQ ID N0.247、SEQ ID N0.248、SEQ ID N0.249、SEQ ID N0.250、SEQ ID N0.251、SEQ ID N0.252、SEQ ID N0.253、SEQ ID N0.254、SEQ ID N0.255、SEQ ID N0.256、SEQ IDN0.257、SEQ ID N0.258、SEQ ID N0.259、SEQ ID N0.260、SEQ ID N0.261、SEQ ID N0.262的肽的IND标记。
21.权利要求19的检测方法，其中所述抗性标记是选自序列为SEQID N0.188,SEQ IDN0.193,SEQ ID N0.207,SEQ ID N0.242,SEQ ID N0.243,SEQ ID N0.246,SEQ ID N0.256、SEQ ID N0.260的肽的IND标记。
22.权利要求1-8中任一项的检测方法，其中所述抗性标记是选自序列为SEQIDN0.266 到 SEQ ID N0.281 以及 SEQ ID N0.283 到 SEQ ID N0.287 的肽的 SME 标记。
23.权利要求22的检测方法，其中所述抗性标记是选自序列为SEQID N0.266、SEQ IDN0.268,SEQ ID N0.269,SEQ ID N0.270,SEQ ID N0.273,SEQ ID N0.274,SEQ ID N0.277、SEQ ID N0.279、SEQ ID N0.281 的肽的 SME 标记。
24.权利要求1-8中任一项的检测方法，其中所述抗性标记是选自序列为SEQIDN0.314 到 SEQ ID N0.318 以及 SEQ ID N0.320 到 SEQ ID N0.346 的肽的 VM 标记。
25.权利要求24的检测方法，其中所述抗性标记是选自序列为SEQID N0.316、SEQ IDN0.318、SEQ ID N0.321、SEQ ID N0.341、SEQ ID N0.342、SEQ ID N0.344、SEQ ID N0.346的肽的VM标记。
26.权利要求1-8中任一项的检测方法，其中所述抗性标记是选自序列为SEQIDN0.509 到 SEQ ID N0.523、SEQ ID N0.525 到 SEQ ID N0.572、SEQ ID N0.574 到 SEQ IDN0.604,SEQ ID N0.606 到 SEQ ID N0.618,SEQ ID N0.620 到 SEQ ID N0.696、SEQ ID N0.698到 SEQ ID N0.1077 以及 SEQ ID N0.1098 到 SEQ ID N0.1109 的肽的 OXA 标记。
27.权利要求26的检测方法，其中所述抗性标记是选自序列为SEQID N0.509、SEQID N0.510、SEQ ID N0.512、SEQ ID N0.513、SEQ ID N0.514、SEQ ID N0.515、SEQ IDN0.516,SEQ ID N0.517,SEQ ID N0.518,SEQ ID N0.519,SEQ ID N0.520,SEQ ID N0.521、SEQ ID N0.522、SEQ ID N0.523、SEQ ID N0.525、SEQ ID N0.526、SEQ ID N0.528、SEQ IDN0.530,SEQ ID N0.531,SEQ ID N0.532,SEQ ID N0.533,SEQ ID N0.534,SEQ ID N0.535、SEQ ID N0.536、SEQ ID N0.537、SEQ ID N0.538、SEQ ID N0.539、SEQ ID N0.540、SEQ IDN0.541,SEQ ID N0.542,SEQ ID N0.543,SEQ ID N0.544,SEQ ID N0.545,SEQ ID N0.546、SEQ ID N0.547、SEQ ID N0.548、SEQ ID N0.549、SEQ ID N0.550、SEQ ID N0.551、SEQ IDN0.552,SEQ ID N0.553,SEQ ID N0.554,SEQ ID N0.555,SEQ ID N0.556,SEQ ID N0.557、SEQ ID N0.558、SEQ ID N0.559、SEQ ID N0.560、SEQ ID N0.561、SEQ ID N0.562、SEQ IDN0.563,SEQ ID N0.564,SE Q ID N0.565,SEQ ID N0.566,SEQ ID N0.567,SEQ ID N0.571、SEQ ID N0.572、SEQ ID N0.574、SEQ ID N0.575、SEQ ID N0.576、SEQ ID N0.577、SEQ IDN0.578,SEQ ID N0.580,SEQ ID N0.58KSEQ ID N0.583,SEQ ID N0.584,SEQ ID N0.586、SEQ ID N0.587、SEQ ID N0.588、SEQ ID N0.589、SEQ ID N0.590、SEQ ID N0.591、SEQ IDN0.593,SEQ ID N0.594,SEQ ID N0.595,SEQ ID N0.596,SEQ ID N0.597,SEQ ID N0.598、SEQ ID N0.599、SEQ ID N0.600、SEQ ID N0.601、SEQ ID N0.602、SEQ ID N0.604、SEQ IDN0.606,SEQ ID N0.607,SEQ ID N0.609,SEQ ID N0.611,SEQ ID N0.612,SEQ ID N0.613、SEQ ID N0.614、SEQ ID N0.615、SEQ ID N0.616、SEQ ID N0.618、SEQ ID N0.620、SEQ IDN0.622,SEQ ID N0.623,SEQ ID N0.624,SEQ ID N0.625,SEQ ID N0.626,SEQ ID N0.627、SEQ ID N0.632、SEQ ID N0.633、SEQ ID N0.635、SEQ ID N0.636、SEQ ID N0.637、SEQ IDN0.638,SEQ ID N0.639,SEQ ID N0.640,SEQ ID N0.641,SEQ ID N0.642,SEQ ID N0.643、SEQ ID N0.645、SEQ ID N0.648、SEQ ID N0.649、SEQ ID N0.651、SEQ ID N0.652、SEQ IDN0.653,SEQ ID N0.654,SEQ ID N0.655,SEQ ID N0.656,SEQ ID N0.659,SEQ ID N0.660、SEQ ID N0.664、SEQ ID N0.665、SEQ ID N0.666、SEQ ID N0.667、SEQ ID N0.669、SEQ IDN0.670,SEQ ID N0.672,SEQ ID N0.673,SEQ ID N0.674,SEQ ID N0.675,SEQ ID N0.676、SEQ ID N0.677、SEQ ID N0.678、SEQ ID N0.679、SEQ ID N0.680、SEQ ID N0.681、SEQ IDN0.685、SEQ ID N0.686、SEQ ID N0.687、SEQ ID N0.688、SEQ ID N0.689、SEQ ID N0.690、SEQ ID N0.691、SEQ ID N0.692、SEQ ID N0.693、SEQ ID N0.694、SEQ ID N0.696、SEQ IDN0.698、SEQ ID N0.699、SEQ ID N0.700、SEQ ID N0.701、SEQ ID N0.702、SEQ ID N0.703、SEQ ID N0.706、SEQ ID N0.707、SEQ ID N0.710、SEQ ID N0.714、SEQ ID N0.717、SEQ IDN0.719,SEQ ID N0.720,SEQ ID N0.722,SEQ ID N0.725,SEQ ID N0.726,SEQ ID N0.727、SEQ ID N0.728、SEQ ID N0.729、SEQ ID N0.732、SEQ ID N0.735、SEQ ID N0.736、SEQ IDN0.737,SEQ ID N0.738,SEQ ID N0.740,SEQ ID N0.741,SEQ ID N0.743,SEQ ID N0.744、SEQ ID N0.745、SEQ ID N0.746、SEQ ID N0.747、SEQ ID N0.748、SEQ ID N0.749、SEQ IDQI 53S ,8ε6.0Ν S 5MS ,Ζε6.0Ν S 5MS ,9ε6.0Ν S 5MS ,9ε6.0Ν S 5MS ,Ζε6.0Ν S σΜοοοε6.ΟΝ S 53s,8s.0Ν S 5MS ,S6.0Ν S Ssds.0N S 5MS 二 S.0Ν S 5MS0S.0ΝQI 53S ,816.0Ν S 5MS ,Η6.0Ν S 5MS ,Π6.0Ν S 5MS ,ΖΤ6.0Ν S 5300,26.0Ν Sσ.35,606.0Ν S 5300,806.0Ν S 5MS ,Ζ06.0Ν S 5MS ,906.0Ν S 5MS ,906.0Ν S 5MS,S6.0ΝCl 53S ,CO06.0Ν ωηηSg ,Sg.?=曰 Sg ,Sg.?艺 Qi sgoog.?=曰 sg ,ggg.?=曰 σΜοο,868.ΟΝ S 5MS,Z68.ΟΝ S 5MS ,968.ΟΝ S 5MS ,968.ΟΝ S 1-l.0^ QI Sg ,Sg.差Cl 53S ,S8.ΟΝ ωηη1.0^ Qi sgogg.?=曰 Sg ,ggg.?=曰 sg ,000000.?=曰 σΜοο,Ζ88.0Ν QH ss,988.0Ν QHafMs ,Looooo_QN QHafMs^oooo_QN QHafMs ,εοοοο_QN QH ss ,S8.0ΝCl 53S 二 88.0Ν ωηηsgogg.?=曰 1.0^ Ξ Sgvgfc=曰 1.0^ Ξ σΜοο,9Ζ8.0Ν S 53s,loz8.0Ν S ss^zo0.0Ν S 5MS,U00.0Ν S 5MS ,698.0Ν S 5MS ,898.0ΝCl 53S ,Ζ98.0Ν ωηηSg ,ggg.?=曰 Sg ,Sg.?=曰 Sgdggg 曰 1.0^ Ξ 53Sο98.ΟΝ S 5300,698.0Ν S 5MS ,898.0Ν S 5MS ,ZLO00.0Ν S 5MS ,998.0Ν S 5MS ,998.0ΝCl 53S ,S8.0Ν ωηηSgvsggqhh1- S?.0^ Ξ 53S0900.0Ν ΩΗΗSg ?οο.?=QHHσΜοο,ι.ΟΝ QHaf3s,zs _QN QHafMs ?οο_QN QHafMs ?οο.0Ν QH Ss,荨8.0Ν QHafMs ?οο_QNCl 53S 二寸8.0Ν ωηηsgoig.?=曰 Sg vgcog.?=曰 1.0^ Qi sg vgcog.?=曰 σΜοο,9ε8.ΟΝ S ss^coo0.0Ν S 5MS ,εεοο.0Ν S 53s,zco8.0Ν S 5MS ,?εοο.0Ν S 5MS0CO8.0ΝQI 53S ,6S.0Ν S 5MS ,8S.0Ν S 5MS ,Zs.0Ν S 5MS ,9S.0Ν S 5MS ,LOS.0Ν S σΜοο,艺8.0Ν QH Ssds.0Ν QH Ss 二 S.0Ν QH Ss ,818.0Ν QH Ss ?οο.0Ν QH Ss ,Η8.0ΝQI 53S ,Π8.0Ν S 5MS ?οο.0Ν S 5MS ,ποο.0Ν S 5MS0T00.0Ν S 5MS ,608.0Ν Sσ.35,Ζ08.ΟΝ ωη η1-1.0^ Ξ sg,LOog.?=qhh1-l.0^ Ξ sg ,Sg.?=曰 sg,so0.0ΝQI 53S008.0Ν S 5MS ,66Ζ.0Ν S 5MS ,86Ζ.0Ν S 5MS ,Ζ6Ζ.0Ν S 5MS ,96Ζ.0Ν S σΜοο,96ζ.ΟΝ S 5MS^6Z.0Ν S 5MS ,CO6Z.0Ν S 5MS ,Sz.0Ν S 5MS06Z.0Ν S 53s,68z.0ΝQI 53S ,88Ζ.0Ν S 5MS ,Ζ8Ζ.0Ν S 5MS ,98Ζ.0Ν S 5MS ,LO00Z.0Ν S 5MS ,εοοζ.0Ν S σΜοο,Ζ8Ζ.0Ν S 5MS,T00Z.0Ν S 5MS000Z.0Ν S 5MS ,6ΖΖ.0Ν S 5MS ,8ΖΖ.0Ν S 5MS,ZZZ.0Να? 53S ,9ΖΖ.0Ν ωηηi Jp.0^ <Π i Jp.0^ αι 1.0^ <Π 53S ,Uz.0Ν ωηησΜοοοζζ.ΟΝ S 5MS,69Z.0Ν S 5MS ,89Ζ.0Ν S 5MS ,Ζ9Ζ.0Ν S 5MS ,99Ζ.0Ν S 5Ms,co9z.0ΝQI 53S ,Sz.0Ν S 53S09Z.0Ν S 5MS ,Sz.0Ν S 5MS ,ZLOZ.0Ν S 5MS ,9LOZ.0Ν S σΜοο,LOLOZ.0Ν S 5MS,SZ.0Ν S 5MS,SZ.0Ν S 5MS,SZ.0Ν S 5MS ,TLOZ.0Ν S SSOLOZ.0Νstloa ο.玲狀 r-ψ V 9TS9ZS0T ZoSEQ ID N0.1015、SEQ ID N0.1018、SEQ ID N0.1019、SEQ ID N0.1020、SEQ ID N0.1022、SEQ ID N0.1024、SEQ ID N0.1025、SEQ ID N0.1026、SEQ ID N0.1027、SEQ ID N0.1028、SEQ ID N0.1030、SEQ ID N0.1031、SEQ ID N0.1034、SEQ ID N0.1036、SEQ ID N0.1041、SEQ ID N0.1042、SEQ ID N0.1044、SEQ ID N0.1045、SEQ ID N0.1046、SEQ ID N0.1048、SEQ ID N0.1049、SEQ ID N0.1050、SEQ ID N0.1052、SEQ ID N0.1053、SEQ ID N0.1054、SEQ ID N0.1058、SEQ ID N0.1059、SEQ ID N0.1060、SEQ ID N0.1062、SEQ ID N0.1063、SEQ ID N0.1064、SEQ ID N0.1067、SEQ ID N0.1068、SEQ ID N0.1069、SEQ ID N0.1070、SEQ ID N0.1071、SEQ ID N0.1072、SEQ ID N0.1073、SEQ ID N0.1074、SEQ ID N0.1075、SEQ ID N0.1076,SEQ ID N0.1098,SEQ ID N0.1099,SEQ ID N0.1100,SEQ ID N0.110USEQID N0.1102、SEQ ID N0.1103、SEQ ID N0.1104、SEQ ID N0.1105、SEQ ID N0.1106、SEQ IDN0.1107、SEQ ID N0.1108、SEQ ID N0.1109 的肽的 OXA 标记。
28.权利要求26的检测方法，其中所述抗性标记是选自序列为SEQID N0.510,512,513、514、520、521、522、523、525、530、532、537、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、556、557、558、559、560、561、562、574、581、582、583、584、596、597、598、599、600、601、602、607、609、632、633、635、636、649、655、656、667、674、675、689、690、698、714、719、720、722、727、729、741、746、748、750、751、752、755、756、757、763、767、768、772、775、781、782、790、792、793、794、795、796、797、798、801、809、811、812、813、814、824、832、834、837、838、847、851、853、854、855、856、857、858、859、860、862、868、869、870、874、875、876、877、879、880、881、882、894、895、898、902、903、904、906、907、908、912、913、914、920、922、923、937、938、939、945、946、948、949、950、951、954、956、962、964、967、969、971、972、974、975、979、980、985、988、990、993、994、995、996、997、1000、1001、1003、1004、1005、1011、1013、1015、1018、1019、1027、1030、1034、1035、1036、1042、1048、1052、1058、1060、1070、1098、1099、1100、1101、1102、1103、1104、1105、1106、1107、1108、1109 的肽的 OXA 标记。
29.权利要求26的检测 方法，其中所述抗性标记是选自序列为SEQID N0.1098、SEQID N0.1100、SEQ ID N0.1102、SEQ ID N0.1103、SEQ ID N0.1104、SEQ ID N0.1105、SEQ IDN0.1107、SEQ ID N0.1108、SEQ ID N0.1109 的肽的 OXA 标记。
【文档编号】G01N33/68GK103765216SQ201280030179
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2012年4月20日 优先权日:2011年4月21日
【发明者】Y·沙勒捷, J-P·沙里耶, C·弗兰切斯基, G·赞巴尔迪, T·切基尼, E·德古沙尔梅特 申请人:生物梅里埃公司