一株毒杀植物寄生线虫的菌核青霉及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物农药技术领域，具体设及一株毒杀植物寄生线虫的菌核青霉及 其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 植物寄生线虫在世界上许多国家和地区发生和为害，种类多种多样。在全球范围 内，植物寄生线虫的发生与危害随着农林业的发展和耕作栽培制度的变化日益严重。据估 计，全球每年因植物寄生线虫给农业、林业生产造成的损失高达1，570亿美元(Abad P，et al.2008.Genome sequence of the metazoan plant-parasitic nematode Meloidogyne inco即ita.Na1:ure Biotechnology, 26:909-915)，而实际的损失远远超过估计，再者，线虫 与其它生物相互作用而对植物产生的直接或间接影响还在急剧增加。
[0003] 目前对植物有害的线虫约有3000多种，在我国主要有根结线虫、胞囊线虫、松材线 虫等。根结线虫可W危害114科超过3000种植物，是农业上为害最大的一类线虫，病害发生 后，一般减产1〇%-15%左右，严重的高达75%W上，甚至绝收(A.G.怖itehead，1998.Plant 化matode Con化O1.ISBN0851991882CAB International)。目前线虫防治仍W化学防治为 主，但是线虫体表为不具细胞结构的角质层，神经系统又不发达，虫体通气性、透水性较差， 对化学物质反应迟纯，所W化学杀线剂多为剧毒农药，对人畜毒性高，污染环境，很多已被 禁止用于蔬菜和瓜果。目前虽有一些适于菜田使用的中、低毒杀线剂，但品种很少，给线虫 的防治工作增添了困难，因此开发高效安全的生物杀线剂迫在眉睫。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是如何防治植物寄生线虫。
[0005] 为解决W上技术问题，本发明提供了一株菌核青霉。
[0006] 本发明所提供的菌核青霉，其菌株号为D35,其在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中屯、的登记入册编号为CGMCC No. 12168。
[0007] 上述菌核青霉D35可W分生抱子、菌丝或含有分生抱子和/或菌丝的菌丝体的形式 存在。
[000引上述菌核青霉D35的培养物也属于本发明的保护范围。
[0009] 本发明所提供的菌核青霉D35的培养物，是将菌核青霉D35在微生物培养基中培养 得到的培养容器内的物质，所述物质包括所述菌核青霉和所述菌核青霉的代谢物。
[0010] 上述菌核青霉D35的培养物中，所述微生物培养基可为固体培养基或液体培养基。
[0011] 上述菌核青霉D35的培养物中，所述固体培养基可为由糖米和水制成的固体培养 基。所述糖米是稻谷脱去外保护皮层稻壳后的颖果，内保护皮层(果皮、种皮、珠屯、层)完好 的稻米巧粒。
[0012] 为解决W上技术问题，本发明提供了植物寄生线虫抑制剂。
[0013] 本发明所提供的植物寄生线虫抑制剂，它的活性成分是菌核青霉D35和/或菌核青 霉D35的代谢物。
[0014] 所述植物寄生线虫抑制剂具体可为用乙酸乙醋从菌核青霉D35的培养物中提取得 到的溶于乙酸乙醋的物质。
[0015] 上述植物寄生线虫抑制剂中，所述植物寄生线虫可为根结线虫。
[0016] 上述植物寄生线虫抑制剂中，所述根结线虫可为南方根结线虫。
[0017] 上述菌核青霉D35和/或菌核青霉D35的代谢物和/或菌核青霉D35的培养物在制备 植物寄生线虫抑制剂中的应用或在制备抑制植物寄生线虫危害黄瓜药剂中的应用也属于 本发明的保护范围。
[001引上述菌核青霉D35和/或菌核青霉D35的代谢物和/或菌核青霉D35的培养物在抑制 植物寄生线虫中的应用或抑制植物寄生线虫危害黄瓜中的应用也属于本发明的保护范围。
[0019] 上述应用中，所述植物寄生线虫可为根结线虫。
[0020] 上述应用中，所述根结线虫可为南方根结线虫。
[0021] 上文中，所述植物寄生线虫抑制剂中，除所述活性成分外，还含有载体。所述载体 可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体;所 述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物;所述矿物材料可为粘±、滑石、高岭 ±、蒙脱石、白碳、沸石、娃石和娃藻±中的至少一种;所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀 粉中的至少一种;所述高分子化合物可为聚乙締醇和/或聚二醇;所述液体载体可为有机溶 剂、植物油、矿物油或水;所述有机溶剂可为癸烧和/或十二烧。
[0022] 所述植物寄生线虫抑制剂中，上述菌核青霉D35可W分生抱子、菌丝或含有分生抱 子和/或菌丝的菌丝体的形式存在。
[0023] 所述植物寄生线虫抑制剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒 剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
[0024] 根据需要，所述植物寄生线虫抑制剂中还可添加表面活性剂（如吐溫20、吐溫80 等）、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂）、抑调节剂等。
[0025] 实验证明，活性成分为用乙酸乙醋从菌核青霉D35的培养物中提取得到的溶于乙 酸乙醋的物质的植物寄生线虫抑制剂，在活性成分含量为1.5g/L对南方根结线虫的校正死 亡率为100%。菌核青霉D35对南方根结线虫卵解化的平均抑制率为99%。菌核青霉D35固体 发酵培养物在没有任何助剂填加的条件下，45天时对黄瓜根结线虫病防效达83.9%，80天 后对黄瓜根结线虫病防效仍达77.7%。经菌核青霉D35处理后的黄瓜苗根系发达，根结少， 植株生长正常，对黄瓜安全。菌核青霉D35和/或菌核青霉D35的代谢物可用于植物寄生线虫 的防治中。
[002引保藏说明
[0027]菌种名称：菌核青霉(Penicillium aff.sclerotiorum)
[002引菌株编号:D35
[0029] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、
[0030] 保藏机构简称:CGMCC
[0031] 地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0032] 保藏日期:2016年4月12日
[0033] 保藏中屯、登记入册编号:CGMCC No. 12168
【附图说明】
[0034] 图1为菌核青霉D35在马下平板上菌落形态。
[0035] 图2为菌核青霉D35在马下平板上产抱情况。
[0036] 图3为菌核青霉D35分生抱子梗形态。
[0037] 图4为植物寄生线虫抑制剂处理45天的黄瓜根系。
[0038] 图5为CK处理45天的黄瓜根系。
【具体实施方式】
[0039] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为 常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0040] 实施例1、菌核青霉D35的分离与鉴定
[0041 ] 1.1菌株分离
[0042] 采用稀释平板分离法从中国福建武夷山±样中分离菌株。称取±样10邑放入90ml 无菌水中，用Iml无菌移液管吸取Iml 1〇-1浓度的菌液于一管9ml无菌水中，摇匀即为1〇-2浓 度的菌液，同样方法，依次稀释到1〇- 4。将上述1〇-2、1〇-哺1〇-4上壤菌液分别涂布到PDA平板 上，吹干后倒置于25°C培养箱中培养3-5天，将分离到的真菌转接到PDA斜面上培养，待长好 后，置于冰箱中保存。取编号为D35的菌株进行下述鉴定。
[0043] 1.2菌株鉴定
[0044] 1.2.1菌株形态观察
[0045] 将菌株D35用接种针挑至马下培养基（培养基配方：葡萄糖Ig、蛋白腺0.5g、 KH2P04* 3出0 0.1g、MgS〇4. 7出0 0.05g、0.1%孟加拉红溶液0.331111、琼脂1.5~2旨、蒸馈水 100mL，自然抑，2%去氧胆酸钢溶液2ml (预先灭菌，临用前加入），链霉素溶液（10 OOOu/ml) 0.33ml(临用前加入））平板中央，25°C培养箱中培养，7化后照相，并于显微镜下观察分生抱 子梗及分生抱子的形态。从图1中可W看到菌株D35在马下培养基上菌落呈圆形，初在边缘 产生白色菌丝，渐变为澄黄色，从图2中可W看到分生抱子较多的面上近于暗绿色，产抱量 大。从图3显微镜下可W看到D35菌丝有横隔，分生抱子梗顶端产生几轮对称或不对称的小 梗，形如扫靑，分生抱子球形。鉴于分生抱子梗和菌落等典型形态特征，初步鉴定D35为青霉 属真困。
[0046] 1.2.2分子生物学鉴定
[0047] 提取菌株D35的基因组DNA，-20°C保存备用。W提取的DNA为模板，扩增引物为真菌 rDNA-ITS通用引物ITS1(5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'）和口S2(5'-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3'）JCR 扩增的反应体系为 IOXPCR Buffer 2.5 化，dNTPs 1.5 化，TaqDNA 聚合酶0.化L，引物1.扣L，模板DNA 1.扣L，d地20 17.化L，总体积25化。PCR扩增反应的条件 为：94°C预变性2min，94°C变性45S，37°C退火 1111111，72°(：延伸2111111，35个循环，72°(：延伸 IOmiruPCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格后送生工生物工程(北京)有限公 司测序。将所得序列与GenBank数据库中序列进行比对，通过MEGA5.0构建系统发育进化树。 [00 4引经测序获得菌株D35的rDNA-ITS序列（序列表中序列1)，通过Blast分析，选取与之 同源性较高的菌株，利用软件MEGA5.0进行系统发育分析、Nei曲bor-Joining法构建菌株的 rDNA-ITS系统发育树。结果表明D35与化nicillium aff. sclerotiorum聚在一个分支上，同 源性为99 %，因此，结合之前的形态特征，确定菌株D35为菌核青霉（Penici Ilium aff.sclerotiorum)0
[0049] 菌核青霉（Penicillium aff .scle;rotio;rum)D35 已于 2016年 4 月 12 日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏号为CGMCC No. 12168。
[0050] 实施例2、植物根结线虫抑制剂