一种快速鉴定南方根结线虫二龄幼虫体外生存状态的方法
【专利摘要】一种快速鉴定南方根结线虫二龄幼虫体外生存状态的方法，属农业病原害虫药物筛选领域。本发明应用尼罗红对J2脂肪的染色，根据虫体的着色部位鉴定出二龄幼虫的生存状态。即：将150?180条J2加入到盛有500μl无菌水的24孔细胞培养板中，向其加1μl经0.22μm过滤器除渣并溶解于丙酮中0.5mg/ml尼罗红溶液，25℃放置4h后，置于用波长为580?630mm的黄绿色激发光曝光120毫秒，每隔24h重复同样的操作，观测和记录荧光值；当线虫口针到口器顶部的头部呈现出明显的橘红色荧光，判定线虫为死亡状态；当线虫头部基本没有荧光，判定J2为非死亡状态。有益效果在于：操作简单、灵敏度高；多次检测且不影响J2的活力；能够降低假死给杀虫药物筛选带来的统计误差，减少筛选周期和成本。
【专利说明】
一种快速鉴定南方根结线虫二龄幼虫体外生存状态的方法
技术领域
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[0001]本发明涉及一种快速鉴定南方根结线虫二龄幼虫体外生存状态的方法，属于农业病原害虫药物筛选领域。
【背景技术】
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[0002]植物寄生线虫(plant parasitic nematodes)是世界范围难以防治的重要的植物病害。该线虫寄生范围广，适应环境能力强，几乎可以侵染所有的栽培作物。全球每年因作物病原线虫造成的直接经济损失高达1570亿美元，并呈现逐年上升的趋势，其中，根结线虫属(Meloidogyne spp.)每年对世界农业造成的损失数百亿美元。目前，已发现根结线虫90多个种，常见的主要有南方根结线虫(Me loidogyne incognita)、花生根结线虫(Meloidogyne arenar ia)、北方根结线虫(Me1idogyne hapla)、爪唾根结线虫(Meloidogyne javanica)等4个种，其中南方根结线虫最为普遍，对农作物引起的危害也最为严重。随着现代化设施农业的快速发展，根结线虫已成为限制世界农业发展的关键因素之一，因而，迫切需要筛选出高效、安全的植物寄生杀虫剂。
[0003]与模式生物-秀丽隐杆线虫一样，南方根结线虫生活史也包括卵、幼虫和成虫三个阶段。由于根结线虫的卵粒为蛋白凝胶所包被并具有寄生性的特点，在实验室条件下，主要选取二龄幼虫(second-stage juvenile，J2)为杀虫剂或基因功能研究的革E标虫龄，通过检测经不同药物处理的靶标线虫体外生存状态，获取高效、安全、特异的植物线虫防控方法。目前，二龄幼虫的体外生存状态主要是通过镜检、机械刺激、滴加NaOH和荧光检验法等进行鉴定。然而，上述方法具有不易区分、难以操作、虫体需求量大、持续性较低和耗时长等缺点，容易造成错误判断，给筛选植物寄生线虫杀虫剂的筛选工作和基因功能的寄主体外研究带来困难。J2在体外活动性较弱，遇到逆境时常虫体僵直的假死状态呈现；当J2适应逆境后，假死状态的J2呈现出正弦或余弦曲线轨迹活动。面临逆境，难以区分死活状态J2给数据统计的工作带来的巨大的困扰。对于体积较小的J2，机械刺激难以操作且耗时较长，而且不适用于潜在杀虫的大批量筛选。对于NaOH鉴别法而言，J2需求量过大且不易观察到经药物处理的J2生存动态效果。尽管荧光检验法较为灵敏和准确，但且吖啶橙染料本身易致癌，给操作者的人生安全带来了隐患。因而，寻找出一种快速、安全和灵敏性高的鉴别J2死活的方法具有重要的理论和实用价值。
[0004]J2肠道中分布着与溶酶体相关的酸性脂肪以提供体外生存所需要的基本能量，本实验室通过用尼罗红(Nile Red)对J2的酸性脂肪进行活体染色，根据J2的着色情况判断其死活状态。相关的着色效果与死亡关系未见在植物寄生虫中报道。
【发明内容】
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[0005]本发明的目的在于提供一种操作简单、灵敏度高的快速鉴定南方根结线虫二龄幼虫体外生存状态的方法。
[0006]本发明的快速鉴定南方根结线虫二龄幼虫(J2)体外生存状态的方法，其骤
[0007]如下:
[0008]&.150-180条12经5%似(:10处理21^11后，用无菌水洗涤以除尽残余的恥(:10，经洗涤过的J2幼虫放置于装有500ul的无菌水中，再放置于25°C恒温培养箱中；
[0009]b.将盛有J2的培养皿置于冰上冰浴8h ；
[0010]c.将40μ1 IN NaOH滴加到Iml盛有J2的2ml离心管中，摇晃4min;
[0011]d.将盛有J2的培养皿放置于37 0C恒温培养箱中放置12h ；
[0012]e.将J2 收集到 1.51111离心管中，14000印111 4°C 离心 30min;
[0013]d.上述各处理后的虫体分别用无菌水洗涤3-5次，再将虫体放置于盛有Iml无菌水的24孔细胞培养板中，并加入2μ1经0.22μπι过滤器除渣并溶解于丙酮中0.5mg/ml尼罗红溶液，25°C放置4h后，置于用波长为580-630mm的黄绿色激发光曝光120毫秒，然后，每隔24h重复同样的操作，观测和记录相应的荧光值;易被尼罗红着色，荧光强度值较高且出现部分弥散，线虫口针到口器顶部的头部呈现出明显的橘红色荧光，判定线虫为死亡状态。仅肠道中与溶酶体相关的脂肪颗粒被尼罗红着色，且荧光值较低，头部基本没有荧光，判定J2为非死亡状态。如图3和图4所示。
[0014]本发明的有益效果在于:操作简单、灵敏度高；多次检测且不影响J2的活力，适用于大批量药物筛选的特性；能够降低由于根结线虫的假死给杀虫药物筛选带来的统计误差，从而缩短药物筛选的周期和成本。
【附图说明】
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[0015]图1.死亡线虫(A)和非死亡线虫(B)经尼罗红染色4h后的荧光照片，A:线虫经1.8%的阿维菌素乳油稀释1000 X处理2天;B:线虫放置于无菌水中2天。(40 X，标尺为20μm) ο
[0016]图2.死亡线虫(A)和非死亡线虫(B)经尼罗红染色4h后全身和头部的荧光强度值统计结果及其尼罗红未影响线虫活力的活力(C)。
[0017]图3.经A、B、C、D、E各处理后，线虫经尼罗红染色4h后在荧光显微镜下的荧光照片(40 X，标尺为2Oym)。
[0018]图4.经A、B、C、D、E各处理后，线虫经尼罗红染色4h后全身和头部的荧光强度值统计结果。
[0019]图5非死亡线虫经尼罗红染色后不同时间在荧光显微镜下的荧光照片(40X，标尺为20μηι)。
[0020]图6非死亡线虫经尼罗红染色4h后全身和头部的荧光强度值统计结果。
【具体实施方式】
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[0021]下面结合附图对本发明作进一步的详述。
[0022]实施例一:
[0023]本发明的快速鉴定南方根结线虫二龄幼虫(J2)体外生存状态的方法，其骤
[0024]如下:
[0025]a.150条或180条J2经5%NaClO处理2min后，用无菌水洗涤以除尽残余的NaC1，经洗涤过的J2幼虫放置于装有500ul的无菌水中，再放置于25°C恒温培养箱中；
[0026]b.将盛有J2的培养皿置于冰上冰浴8h ；
[0027]c.将40μ1 IN NaOH滴加到Iml盛有J2的2ml离心管中，摇晃4min;
[0028]d.将盛有J2的培养皿放置于37 0C恒温培养箱中放置12h ；
[0029]e.将J2 收集到 1.51111离心管中，14000印111 4°C 离心 30min;
[0030]d.上述各处理后的虫体分别用无菌水洗涤3-5次，再将虫体放置于盛有Iml无菌水的24孔细胞培养板中，并加入2μ1经0.22μπι过滤器除渣并溶解于丙酮中0.5mg/ml尼罗红溶液，25°C放置4h后，置于用波长为580-630mm的黄绿色激发光曝光120毫秒，然后，每隔24h重复同样的操作，观测和记录相应的荧光值;易被尼罗红着色，荧光强度值较高且出现部分弥散，线虫口针到口器顶部的头部呈现出明显的橘红色荧光，判定线虫为死亡状态。仅肠道中与溶酶体相关的脂肪颗粒被尼罗红着色，且荧光值较低，头部基本没有荧光，判定J2为非死亡状态。如图3和图4所示。
[0031]实施例二:
[0032]基本同实施例一。不同之处为:将收集新鲜孵化的J2幼虫并将其加到盛有500μ1的24孔细胞培养板中，并在第I天、5天和15天分别向培养板中滴加2μ1经0.22μπι过滤器除渣、浓度为0.5mg/ml、溶解于丙酮的尼罗红溶液，25°C放置4h后，置于荧光显微镜下进行虫体荧光检测。如图5和图6所示。
【主权项】
1.一种快速鉴定南方根结线虫二龄幼虫体外生存状态的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下: a.150-180条南方根结线虫二龄幼虫经5%NaC10处理2min后，用无菌水洗涤以除尽残余的NaC1，经洗涤过的南方根结线虫二龄幼虫幼虫放置于装有500ul的无菌水中，再放置于25 °C恒温培养箱中； b.将盛有南方根结线虫二龄幼虫的培养皿置于冰上冰浴8h; c.将40μ1I N NaOH滴加到Iml盛有南方根结线虫二龄幼虫的2ml离心管中，摇晃4min; d.将盛有南方根结线虫二龄幼虫的培养皿放置于37°C恒温培养箱中放置12h; e.将南方根结线虫二龄幼虫收集到1.5ml离心管中，14000rpm4°C离心30min; d.上述各处理后的虫体分别用无菌水洗涤3-5次，再将虫体放置于盛有Iml无菌水的24孔细胞培养板中，并加入2μ1经0.22μπι过滤器除渣并溶解于丙酮中0.5mg/ml尼罗红溶液，25°C放置4h后，置于用波长为580-630mm的黄绿色激发光曝光120毫秒，然后，每隔24h重复同样的操作，观测和记录相应的荧光值；当线虫口针到口器顶部的头部呈现出明显的橘红色荧光，判定线虫为死亡状态;当线虫头部基本没有荧光，判定J2为非死亡状态。
【文档编号】G01N21/64GK105911035SQ201610235811
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月15日
【发明人】邹成钢, 陆朝军, 张克勤, 卞静
【申请人】云南大学